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GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Y PREGUNTAS SOBRE TEMAS DE LAS CLASES TEÓRICAS CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS U.N.C.P.B.A. 2015 CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA 2015 Contenidos I Inmunobiología 1. Introducción a la Inmunología: referencias históricas. 2. Inmunología; relaciones con otras ciencias. Especialidades. 3. Inmunidad; funciones; clasificación. I.I Sistema inmunitario 1. Sistema inmunitario o inmunocompetente; Composición: órganos. Sector de formación. Médula ósea. Células troncales. Mielopoyesis y linfopoyesis. Citoquinas participantes. Sector de diferenciación (órganos primarios). Timo; bolsa de Fabricio; placas de Peyer ileocecales. Sector de activación y de generación de respuestas inmunitarias (órganos secundarios) médula ósea; ganglios linfáticos; bazo. Tonsilas, nódulos linfoides. Estructura relacionada con la función. 2. Sistema inmunitario asociado a mucosas; organización y función. Sectores inductivos y efectores. Linfocitos intraepiteliales. Placas de Peyer yeyunales. Células M. 3. Células: clasificación; ontogenia. Linfocitos T y B; marcadores; receptores; recirculación; maduración final. Subpoblaciones T (Th1, Th2, Th3); polimorfonucleares neutrófilos, eosinófilos y basófilos; mastocitos; plaquetas. 4. Células presentadoras; macrófagos; sistema de Langerhans; células dendríticas (interdigitantes); endoteliales; linfocitos B. Otras células. Importancia; funciones. I.2 Inmunidad Innata 1. Factores condicionantes: genéticos, nutricionales, edad, estrés, sanidad. 2. Barrera cutáneo-mucosa, piel. Aparato digestivo. Aparato respiratorio. Aparato genitourinario. Glándula mamaria. Ojos. 3. Mecanismos de reconocimiento inmunitario innato (inmunidad innata): Patrones moleculares asociados a patógenos (PMAP). Receptores para PMAP. 4. Indicadores tempranos de infección: inflamación: signos clínicos; dinámica. Proteínas de fase aguda (PFA). Colectinas. Pentraxinas: proteína C reactiva, amiloide sérico. Proteínas fijadoras de manosa y de lipopolisacáridos. Sistema del Complemento; nomenclatura. Vías de activación: vía clásica: inductores; unidad de reconocimiento; unidad de activación; unidad de ataque de membrana; amplificación. Vía alterna: inductores; unidad de activación; unidad de ataque de membrana; amplificación. Vía de las lectinas. Enzimas líticas: Lisozima y otras. Interferones tipo I. 5. Sistemas de captura de material extraño. Fagocitosis. Sistema mieloide: polimorfonucleares neutrófilos; polimorfonucleares eosinófilos. Sistema Fagocítico Mononuclear; Células de Langerhans. Quimioquinas: función en la infección. Selectinas. Integrinas. Mecanismo de la fagocitosis. Funciones. Mecanismos microbicidas dependientes e independientes del oxígeno. Compuestos microbicidas derivados del nitrógeno. Defensinas. 6. Células Asesinas Naturales (NK): tipos; características; funciones y mecanismos de acción. Perforinas y granzimas. 2 I.3 Inmunidad adaptativa: Inmunógenos y Antígenos. 1. Inmunógenos; Inmunogenicidad. Atributos de un inmunógeno: exogenicidad, tamaño, estabilidad metabólica, estado biológico. Efecto de la dosis, adyuvantes, especie animal, edad. 2. Especificidad. Antígenos: características, clasificación. Composición química: proteínas, hidratos de carbono, lípidos, mixtos o combinados. Antígenos timoindependientes y timodependientes. Epitopes T y B. Superantígenos y su relación con la enfermedad. Competición antigénica; importancia. Metabolismo: características; fases; destino. I.4 Generación y expresión de la respuesta inmunitaria adaptativa. 1. Inmunidad adaptativa (adquirida o específica). Inmunidad mediada por anticuerpos; inmunidad mediada por células. 2. Procesamiento de proteínas y presentación de antígenos. Células presentadoras profesionales y no profesionales. Células dendríticas, macrófagos y linfocitos B. Génesis de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (mCMH: clases I y II). Vías de procesamiento endógena (citosólica) y exógena (endosómica). Circuitos del antígeno (péptido) dentro de la célula presentadora. Presentación. Interacción con receptores y correceptores. CD4 y CD8; B7. Superantígenos. Interacción con LT . Importancia de la vía de procesamiento en el establecimiento de una respuesta efectora adecuada. Presentación de antígenos no peptídicos. Presentación vía CD1. 3. Inmunidad mediada por anticuerpos: Inmunoglobulinas; Anticuerpos; selección clonal. Anatomía y dinámica de los centros germinativos: inducción, ubicación ganglionar, procesamiento, presentación, colaboración celular, proliferación celular; hipermutaciones y ajuste de la afinidad; cambio de isotipo; diferenciación celular. Célula plasmática: biosíntesis de Ac; célula B de memoria. 4. Inmunoglobulinas: síntesis, composición; estructura; dimensiones; propiedades; distribución; funciones; catabolismo; isotipos; subisotipos; idiotipos; alotipos. Nociones sobre generación de la diversidad. Inmunoglobulinas secretorias: inducción; isotipos; Ig A secretoria: biosíntesis, estructura, secreción, circuito enterohepático, funciones. 5. Dinámica de la respuesta inmunitaria; respuesta primaria y secundaria: evolución y características. Cambio isotípico. Afinidad. Memoria inmunitaria. 6. Inmunidad mediada por células: inducción: linfocitos T efectores: linfocitos T de hipersensibilidad tardía; linfocitos T citotóxicos; linfocitos T colaboradores; linfocitos T supresores; linfocitos T de memoria Fenómenos de citotoxicidad. Apoptosis. Citotoxinas: perforina y granzimas. Activación del macrófago. I. 5 Regulación de la Respuesta Inmunitaria 1. Mecanismos de control: importancia; tipos: fisiológicos, celulares, genéticos, (i) por el inmunógeno: Tolerancia inducida; características: tipos de inmunógenos, dosis, vía, edad, aparición, persistencia, uso de drogas; inducción: subpoblaciones LT y LB; (ii) por los Ac: mecanismos de retroalimentación, concentración de Ig, inmunocomplejos (IC), idiotipos; (iii) por células: mecanismos de restricción del CMH, linfocitos CD4 y CD8, macrófagos supresores; (iv) por otros factores. 2. Equilibrio de respuesta inmunitaria humoral versus celular. Nociones de respuesta de tipo I y tipo II. Citoquinas reguladoras. II Inmunodiagnóstico 1. Pruebas in vitro: Reactantes: tipos, obtención, manejo, conservación. Suero, plasma, otros fluídos biológicos. Detección de Ig totales. 2. Unión Ag-Ac: teorías, fase específica, fuerza de unión, afinidad, avidez; fase inespecífica: factores condicionantes, clasificación: interacción primaria, secundaria y terciaria. 3 3. Pruebas de interacción primaria: tipos: radioinmunoensayo, inmunofluorescencia, inmunoenzimáticas (ELISA, Western blot, dot-blot): Fundamentos. 4. Pruebas de interacción secundaria: tipos: precipitación en medios líquidos y gelificados; aplicación; aglutinación: directas, indirectas; aplicaciones. Fundamentos. 5. Expresión del resultado de una prueba: pruebas cualitativas, semicuantitativas y cuantitativas. Título: significado y determinación. Conversión serológica. 6. Estudio de las proteínas séricas: electroforesis, inmunoelectroforesis, aplicaciones. 7. Anticuerpos monoclonales: propiedades, obtención y aplicaciones. III Inmunoprofilaxis 1. Inmunoprofilaxis: Objetivos. Inmunidad activa: vacuna: finalidad, características: seguridad y eficacia; clasificación: (i) por su finalidad, (ii) por su substrato, (iii) por su especificidad, (iv) por su estado biológico, (v) por la vía de aplicación. 2. Vacunas y respuesta inmunitaria: vías de inmunización en relación con la patogenia y la respuesta inmunitaria buscada, selección, aplicaciones. 3. Vacunas convencionales: tipos. Atenuación: por pasajes en otras especies o por cultivos. Razones de la atenuación: ejemplos. Vacunas inactivadas. Métodos de inactivación. 4. Adyuvantes. Tipos. Clasificación (origen animal, vegetal, mineral, sintético). Mecanismos de acción. Inmunomodulación. Usos. 4 PERFIL DEL CURSO Departamento: Sanidad Animal y Medicina Preventiva (SAMP) Cuatrimestre de Dictado: 1er Cuatrimestre Duración: 11 semanas Página web: http://www.vet.unicen.edu.ar/facultad/areas Organización: Clases guía: 9 Talleres:3 Taller de integración: 1 Trabajos Prácticos: 6 Integrantes del curso: Guillermo Arroyo, M. V. [email protected] Silvia Estein, M. V., Dr. [email protected] Analía Etcheverría, M. V., Dr [email protected] Silvina Gutiérrez, M. V., Dr. [email protected] Paula Lucchesi, Ing. Agr., Dr. [email protected] Claudia Lützelschwab, M.V., Dr. [email protected] Nora Lía Padola, M. V., Dr. [email protected] Marcelo Sanz, M.V., Dr. [email protected] Daniel Fernández, M.V., Dr. [email protected] Vanesa Fernández, M.V. [email protected] Descripción del curso: El curso provee conocimientos sobre los componentes del sistema inmune y los mecanismos inmunológicos básicos, cubriendo aspectos importantes para la formación del profesional veterinario. Estos temas se desarrollarán en las clases guía y luego aspectos de los mismos se trabajarán durante los talleres. En el taller de integración se realizarán actividades de autoevaluación con una discusión grupal posterior. Los trabajos prácticos desarrollarán los fundamentos de las pruebas de diagnóstico con base inmunológica más importantes para el diagnóstico clínico. Los talleres y los trabajos prácticos son de asistencia obligatoria. Objetivos A-Objetivos del Curso Los objetivos del curso son: 1. Comprender los conceptos más importantes sobre los que se basa el funcionamiento del sistema inmune. 2. Conocer las funciones de tejidos, células, proteínas y genes del sistema inmune. 3. Comprender los mecanismos, interacciones y regulación de la respuesta inmune. 4. Conocer el fundamento de los métodos con base inmunológica utilizados para el diagnóstico veterinario. B-Objetivos de aprendizaje Para que el alumno adquiera dominio de la fisiología del sistema inmune debe lograr: 1. Adquirir el vocabulario específico de la materia. 2. Identificar los estímulos capaces de activar al sistema inmune. 3. Conocer la diferencia conceptual entre la inmunidad innata y adaptativa. 4. Comprender los mecanismos humorales y celulares que intervienen en la inmunidad innata. 5. Comprender los mecanismos que intervienen en la respuesta humoral y celular de la respuesta inmune adaptativa y su regulación. 6. Explicar los principios de la inmunoprofilaxis 5 7. Comprender los fundamentos de los métodos inmunológicos utilizados para el diagnóstico veterinario. Aptitudes que se Objetivos de Recursos para la Evaluación pretende aprendizaje enseñanza desarrollar Selección de conceptos relevantes Clases teóricas Comprensión e guía Evaluación interrelación de Talleres mediante 1 examen componentes y Taller de parcial escrito y mecanismos integración B1, B2, B3, B4, B5, talleres Comprensión de Uso de libros de B6 Evaluación los mecanismos texto y material formativa durante el inmunitarios más seleccionado por los taller de integración importantes docentes Adquisición y Confección de desarrollo de una glosario personal metodología de estudio Clases prácticas Clases teóricas guía Taller Uso de libros de texto y material seleccionado por los docentes B7 Manejo de material de laboratorio Comprensión del fundamento de las pruebas con base inmunitaria. Evaluación escrita de trabajos prácticos Examen parcial escrito Bibliografía • Tizard I.R. 2009. Introducción a la Inmunología Veterinaria: 8va ed. Elsevier España S. L. ISBN 978-84-8086-431-2. • Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. 2008. 6ta. Ed. Elsevier. ISBN N° 9788480863117 • Fainboim, L., Geffner, J. Editores. 2011. Introducción a la Inmunología Humana. 6ª Ed. Editorial Médica Panamericana. ISBN 978-95-0060-.70-92. • Pennimpede, E., Gomez, C., Stanchi, N. Editores. 2004. Introducción a la Inmunobiología. 1º Ed. Edulp. La Plata. Argentina. ISBN 950-34-0259-x. • Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. 2001. Immunobiology. 5th ed. New York and London: Garland Publishing;. ISBN 0–8153– 3642–X (en inglés). Parham, Peter. 2000. The Immune System. New York and London: Garland Publishing ; ISBN 0-8153-3043-X (en inglés). Regueiro, J.R.; Lopez Larrea C. 1996. Inmunología. Biología y Patología del sistema inmune. 2da Ed. Editorial Medica Panamericana S.A. ISBN 84-7903-403-3 Rojas-Espinosa, O. 1996. Inmunología (de memoria). 1ª Ed. Editorial Médica Panamericana, S.A. de C.V. ISBN 968-7157-72-0 • Material complementario elegido por los docentes. • Guía de Trabajos Prácticos. Curso de Inmunología Básica 2015. Disponible en Fotocopiadora del Centro de Estudiantes. Estará disponible también en la página web del curso. 6 Conocimientos Previos requeridos Se espera de los alumnos tengan conocimiento básico de: • biología celular • anatomía macroscópica • histología del sistema linfático y sanguíneo Estructura de los talleres: Los talleres de Inmunidad Innata y los de Inmunidad Adaptativa serán realizados en grupos reducidos a cargo de un docente. Se trabajará con participación activa de los alumnos, los cuales deberán representar de manera gráfica los conceptos más relevantes de los mecanismos inmunológicos y responder preguntas, teniendo como objetivo mostrar de una manera clara y sencilla un resumen del contenido teórico seleccionado para el taller. Los talleres contarán con una evaluación individual al inicio de los mismos, referida a conceptos clave correspondientes al tema del taller. Estructura del taller de integración: Se realizará luego de la última clase guía, previo al parcial, para reforzar e integrar los conceptos más importantes. Se trabajará respondiendo un cuestionario y luego se discutirán las respuestas entre docentes y alumnos. La presentación verbal de los temas planteados en cada taller a los docentes y al resto de los alumnos ejercitará la expresión oral de los alumnos, fomentará la discusión de los temas, ayudará a la comprensión e integración de los mismos y contribuirá al dominio del vocabulario específico. Estructura de las clases prácticas: Las clases prácticas introducirán a los fundamentos de las principales pruebas inmunológicas utilizadas en diagnóstico veterinario, para lo cual se cuenta con una guía de trabajos prácticos que contiene los fundamentos teóricos del tema a desarrollar y que cada alumno debe traer leída al momento del práctico. Se desarrollarán en 3 comisiones de trabajo en los laboratorios del edificio SAMP e incluirán una explicación de 15 minutos por parte de los docentes, con participación activa de los alumnos, y luego la realización de tareas de laboratorio, lectura de pruebas serológicas y actividades de integración de fundamentos teóricos. Evaluaciones: Trabajos prácticos: serán evaluados mediante un breve cuestionario escrito al final de la actividad de laboratorio y calificados como “aprobado” o “desaprobado”. Examen parcial: será escrito, con preguntas estructuradas, semiestructuradas y a desarrollar. -Condiciones de aprobación del curso: 1) 75% de asistencia y aprobación de actividades obligatorias (mínimo de 7 actividades prácticas aprobadas de un total de 10 que incluyen: 6 trabajos prácticos, 3 talleres y un taller de integración): 2) Aprobación del examen parcial y del examen final. -Para poder recuperar, deben tener un mínimo de 4 actividades prácticas aprobadas, dado que se recupera hasta el 50% de las actividades obligatorias desaprobadas. Los ausentes sin certificado no se recuperan. 7 Los certificados médicos se deben traer dentro de las 48 hs de la inasistencia (hasta martes siguiente inclusive) Un ausente con certificado a una actividad obligatoria se recupera el viernes siguiente Clases de consulta: Se atenderán consultas, con el fin de aclarar temas puntuales, en la oficina de atención de alumnos del edificio SAMP, en los horarios que figuren en cartelera. TRABAJOS PRÁCTICOS TP 1: Toma y conservación de muestras. Proteinograma. Serología. Medición de Ig totales Objetivos: Que el alumno: Conozca las muestras más utilizadas para la detección de anticuerpos y/o antígenos en el diagnóstico serológico, su obtención, remisión y conservación, y los fundamentos de la serología. Reconozca distintas técnicas para evaluar los niveles de Ig totales. Contenido Venas de elección para la extracción de sangre en las diferentes especies. Material necesario, modo de obtención. Toma de muestra con y sin anticoagulantes. Remisión al laboratorio (tiempo y temperatura de remisión). Separación de plasma y suero. Características de una buena muestra. Conservación de la muestra (tiempo y temperaturas adecuadas). Serología, definición y valor diagnóstico. Anticuerpos. Fuerzas de unión entre anticuerpos y antígenos. Toma de otros tipos de muestra: secreciones (leche, calostro, lágrima, mucus, secreción vaginal y prepucial, semen y plasma seminal, líquido articular, etc) y tejidos (biopsias). Observación de diferentes técnicas para evaluar los niveles de Ig totales: Proteinograma electroforético, precipitación de Ig con sales, coagulación con glutaraldehído y densitometría. TP2 : Pruebas de interacción primaria: fundamentos Objetivos: Que el alumno: Comprenda los fundamentos de las principales técnicas serológicas de interacción primaria utilizadas en diagnóstico veterinario. Utilice el material de laboratorio para realizar algunos pasos de las pruebas de ELISA. Interprete diferentes variantes de pruebas de ELISA y sus posibles resultados. Contenido Clasificación de las pruebas serológicas. Técnicas de interacción primaria. Concepto. Fundamentos, conjugado, tipos de marcadores, enzimoinmunoensayo (ELISA), inmunofluorescencia directa e indirecta (IFD, IFI), ensayo de polarización de la fluorescencia (FPA), radioinmunoensayo (RIA), Inmunocromatografía Western Blot, Citometría de flujo. Aplicación en la identificación de células. TP3: Pruebas de interacción primaria: ELISA e inmunocromatografía Objetivos: Que el alumno: Conozca los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprenda la importancia del uso de controles en la pruebas de laboratorio e interprete los resultados. Conozca las etapas de una prueba de inmunocromatografía e interprete los resultados. 8 Contenido Clasificación de las pruebas serológicas. Técnicas de interacción primaria. Concepto. Fundamentos, conjugado, tipos de marcadores, enzimoinmunoensayo (ELISA), Inmunocromatografía. Título de un suero. TP4: Pruebas de interacción secundaria: fundamentos Objetivos: Que el alumno comprenda los fundamentos de las principales técnicas serológicas de interacción secundaria utilizadas en diagnóstico veterinario. Contenido Pruebas de interacción secundaria. Concepto. Fundamento, clasificación (aglutinación en placa, aglutinación en tubo, inmunodifusión radial, inmunodifusión bidimensional), detección de diferentes isotipos de Ig. Fenómeno de prozona. TP5: Pruebas de interacción secundaria: Aglutinación y precipitación Objetivos: Que el alumno: Realice pruebas de aglutinación en placa (rápidas). Observe los resultados de pruebas de aglutinación en tubo (lentas) y de inmunodifusión radial y bidimensional. Realice reacciones de aglutinación cualitativas y semicuantitativas. Identifique el isotipo responsable de la aglutinación, comparando los resultados de la prueba en presencia y ausencia de -mercaptoetanol. Explique el fenómeno de prozona. Contenido Pruebas de interacción secundaria. Fundamento, clasificación (aglutinación en placa, aglutinación en tubo, inmunodifusión radial, inmunodifusión bidimensional), detección de diferentes isotipos de Ig. Fenómeno de prozona. Título de un suero. TP6: Características de la pruebas serológicas. Integración de TP Objetivos: Que el alumno: Discuta conceptos importantes relacionados con la serología. Identifique y describa las pruebas serológicas adecuadas para distintas situaciones. Contenido Conversión serológica o seroconversión, Ac monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de un Ac, reacción cruzada, sensibilidad y especificidad de una prueba serológica. Pruebas de interacción primaria y secundaria. 9 TRABAJO PRÁCTICO Nº1 TOMA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRA – PROTEINOGRAMA – SEROLOGÍA MEDICIÓN DE Ig TOTALES Extracción sanguínea: obtención de plasma y suero, remisión y conservación de la Muestra. La toma de muestra es una etapa esencial para asegurar un buen diagnóstico. En la extracción sanguínea es imprescindible que se utilice material limpio y seco (agujas de calibre adecuado, jeringas, tubos rotulados, tapones) para evitar la contaminación y hemólisis de la muestra. Es importante conocer para qué se utilizará la muestra y qué volumen de muestra es necesario tomar. Si se desea obtener sangre para recuento de células sanguíneas, para analizar la presencia de microorganismos o para obtener plasma, la extracción debe realizarse en tubos con anticoagulante (EDTA o heparina). Para obtener suero, la sangre se deja coagular en determinadas condiciones de tiempo y temperatura. Suero Coágulo Sangre sin anticoagulante Sangre entera Plasma Leucocitos Glóbulos rojos Sangre con anticoagulante Las técnicas de extracción varían de una especie a otra, según el vaso sanguíneo de elección y el espesor, dureza y capa de la piel. En los rumiantes y equinos, la sangre se extrae de la vena yugular o bien de la vena caudal (bovinos). La vena yugular se ingurgita por compresión manual del canal yugular y se introduce la aguja por encima de este punto. La extracción puede realizarse directamente de la aguja al tubo o con jeringa llevando el émbolo hacia atrás lentamente. También puede utilizarse el sistema de tubos al vacío (tipo vacutainer), que presentan mayor facilidad de uso y garantía en cuanto a la asepsia y preservación de las muestras. Este sistema manejado en forma adecuada presenta un menor riesgo de hemólisis de las muestras con respecto al sistema de extracción con jeringa. Si la extracción se practica sin jeringa, para que no se genere turbulencia y se produzca la hemólisis, se saca la aguja y se deja que la sangre fluya lentamente por las paredes del tubo. Cuando la extracción se realiza a partir de la vena caudal, se levanta la cola y se introduce la aguja a 15 cm de la base de la cola en la línea media hasta que penetre en el vaso. En cerdos la muestra se obtiene a partir de la punción de la vena de la oreja. 10 En perros y gatos la muestra se extrae de la vena cefálica antebraquial o de la vena safena. En las aves se realiza por punción de la vena radial (alar). Equino Vena yugular Bovino, ovino, caprino Vena yugular o vena caudal (bovino) Cerdo Vena de la oreja Perro y gato Vena cefálica antebraquial o vena safena Ave Vena radial Cuando la muestra se toma con la adición de anticoagulante, luego de verter la sangre entera en el tubo, se realiza la homogeneización mediante una suave inversión. Cuando la sangre entera no se procesa inmediatamente, debe conservarse refrigerada (4ºC-8ºC) de lo contrario se mantiene a temperatura ambiente (20-22ºC). Para obtener el plasma, la sangre se centrifuga a 1500-2000 r.p.m. durante 10-15 min y se separa la capa líquida (superior). Éste se extrae mediante aspiración con una pipeta y se almacena en viales o tubos. Para la obtención del suero, se deja coagular la sangre en el tubo a temperatura ambiente durante un tiempo mínimo de 1-2 h. y máximo de 12 h. (cuanto más tiempo se deje para que la retracción tenga lugar, mayor cantidad de suero se obtendrá aunque nunca más del 40% del volumen total). La coagulación y retracción se produce más rápido si se incuba la sangre en estufa a 37ºC durante 1-2 hs y luego se lleva a refrigeración durante 30 min. más. El suero obtenido a partir de la retracción del coágulo es separado con la ayuda de una pipeta. Si existieran glóbulos rojos en suspensión deberá centrifugarse a 1500-3000 r.p.m. y obtener el sobrenadante. La coagulación es un proceso que ocurre a temperatura corporal. Para obtener un buen suero la muestra se debe incubar entre 20-37ºC (a menor temperatura mayor tiempo de incubación). Las muestras de suero y plasma (sin células) pueden conservarse refrigeradas (4ºC) si van a utilizarse en corto plazo, de lo contrario si se pretende una conservación por más tiempo se distribuye en alícuotas y se congela a (-20ºC). El fraccionamiento evita las congelaciones y descongelaciones sucesivas las cuales conllevan a la desnaturalización y agregación de las proteínas. Las características deseables de un suero o plasma es que sea translúcido e inodoro. Esto implica que no deben utilizarse en las pruebas serológicas sueros hemolisados o contaminados. Otras muestras de utilidad para el inmunodiagnóstico o diagnóstico serológico Para obtener muestras de secreciones vaginales o de tracto prepucial se realiza la perfusión de solución salina, luego se colecta el líquido del lavado y se centrifuga para eliminar todo tipo de partículas. Cuando se desea obtener plasma seminal debe usarse un electroeyaculador o vagina artificial. Una vez obtenida la muestra debe centrifugarse para obtener el sobrenadante que se retira con pipeta. Las muestras de descargas nasales, lágrimas, secreciones vaginales o prepuciales se realizan mediante hisopado. Luego el hisopo se coloca en solución salina con el agregado de un agente bacteriostático durante 24 h. a 4ºC para permitir la difusión de las moléculas. La eliminación de partículas extrañas se logra mediante centrifugación. La muestra se conserva a (-20ºC). Las muestras de leche o calostro se toman directamente en el tubo y se agrega algún agente bacteriostático. La conservación y remisión de la muestra se realiza a 4ºC. 11 Muestras de tejidos: Las muestras tomadas se procesan hasta obtener el preparado histológico en el portaobjetos. Éste puede utilizarse para la detección de Ag o Ac en pruebas de inmunofluorescencia o inmunohistoquímica. Estas pruebas también pueden desarrollarse sobre frotis o improntas. PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO El proteinograma electroforético (o electroforesis de proteínas del suero) es una técnica simple de laboratorio que permite separar las proteínas séricas en distintas fracciones por medio de la aplicación de un campo eléctrico. Esta prueba es muy usada para evaluar y monitorear distintos cuadros clínicos así como también de gran ayuda en el diagnóstico de distintas enfermedades asociadas a desórdenes proteicos. Fundamento: El plasma contiene muchas proteínas (proteínas transportadoras, enzimas, anticuerpos, etc.). Tanto la carga eléctrica que poseen las proteínas, dada por los aminoácidos que la componen, como su peso molecular afectan su movimiento sobre un soporte cuando se aplica un campo eléctrico. Es decir, pequeñas proteínas altamente cargadas migran más rápido que grandes proteínas, lo que permite que se separen durante la corrida electroforética. La distinta velocidad de migración permite la formación de varias bandas o fracciones en el gel de electroforesis, formadas por grupos de proteínas de tamaño y carga similar. Procedimiento: Se coloca una pequeña muestra de suero en un soporte, que puede ser de distintos tipos: - Soportes tipo 1: acetato de celulosa gelificado o agarosa, donde se observan 5-6 bandas de proteínas plasmáticas (la migración es según relación carga-masa de cada proteína) - Soportes tipo 2: almidón o poliacrilamida, donde se observan 25 o más bandas (la migración es según la relación carga-masa y tamaño). En los laboratorios se usa habitualmente los soportes tipo 1 ya que son más fáciles de interpretar. Se coloca el soporte en la cuba de electroforesis con un buffer de corrida de pH y fuerza iónica determinados tal que las proteínas posean carga eléctrica negativa y migren hacia el ánodo (polo +) cuando se aplica voltaje. Luego de terminada la corrida se retira el soporte y se deja evaporar el solvente. Se fijan las bandas y se colorean con algún colorante para proteínas (según el soporte usado): - Rojo Ponceau (acetato). - Negro Amido (agarosa), etc. Las bandas pueden mirarse a simple vista o leerse con un densitómetro (aparato que permite cuantificar la intensidad y el ancho de cada banda para conocer el porcentaje de cada fracción proteica). Si por otro método se determina la concentración de las proteínas totales del suero, es posible calcular el contenido de cada fracción. Albúmina 12 Fig.1 Gel de un proteinograma de suero normal, y su lectura en densitómetro. Como se observa en la Fig.1, las proteínas se separan normalmente en 5 fracciones: albúmina, y , 2, y globulinas Albúmina: es una proteína que se sintetiza en el hígado, y es la de mayor concentración en el suero. Además de su función de transportadora de algunas sustancias endógenas y exógenas, es de gran importancia en el mantenimiento de la presión coloidosmótica y reservorio móvil de aminoácidos. globulinas: incluye varias proteínas, algunas se mencionan a continuación: globulina: incluye principalmente a la -antitripsina, una proteína de fase aguda. globulina: en esta fracción se encuentra la haptoglobina, una proteína que une hemoglobina intravascular evitando su excreción por el hígado. También se encuentran macroglobulina y ceruloplasmina. En general, los niveles de las proteínas de las fracciones y globulina se incrementan en inflamación. globulinas: incluye proteínas de baja densidad involucradas en el transporte lipídico (lipoproteínas), de hierro (transferrina) y factores del complemento (C3 y C4). globulinas: en esta fracción están incluidos los Ac del isotipo IgG. Es importante aclarar que no todos los anticuerpos migran electroforéticamente con las globulinas, sino que algunos de ellos lo hacen con las y globulinas. (ver fig.2) Fig. 2 22 2222 2 (Fig. extraída de http://inmunologia-online.tripod.com) Los niveles de gamma globulinas pueden estar disminuidos en hipogammaglobulinemias como en agammaglobulinemias, mientras que pueden estar aumentados en enfermedades inflamatorias crónicas (artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico) e infecciones. Además de las gammapatías policlonales, el proteinograma también permite identificar gammapatías monoclonales mediante la detección de bandas estrechas en las fracciones gamma y beta (y, excepcionalmente, en la fracción alfa). Las disminuciones de los niveles de Ig pueden corresponder a estados de inmunodeficiencia. En Medicina Veterinaria se cuantifican inmunoglobulinas por ejemplo, para conocer si un recién nacido ha recibido suficientes Ig maternas (transferencia de inmunidad de la madre al recién nacido = inmunidad natural pasiva). El nivel de Ig alcanzado en el suero del neonato dependerá fundamentalmente de la fuente original de Ig, es decir, el calostro materno (cantidad consumida y contenido en Ig) y del momento de su ingesta. 13 En algunos casos, puede ser necesario evaluar el contenido en Ig del calostro, para saber si es inmunológicamente adecuado o no. En otros, puede interesarnos conocer el nivel de Ig en suero del recién nacido o de un animal cualquiera, independientemente de su edad. En ambos casos, estamos buscando evaluar los niveles de Ig totales. Para ello se cuenta con diferentes técnicas: Precipitación de Ig con sales Coagulación con glutaraldehído Electroforesis Inmunoelectroforesis Inmunodifusión radial cuantitativa ELISA Densimetría PRECIPITACION DE Ig CON SALES (SULFITO DE SODIO O SULFATO DE ZINC) La prueba de precipitación de Ig con sales como sulfito de sodio o sulfato de zinc, es efectiva y rápida, mediante ésta es posible determinar la concentración de inmunoglobulinas maternas en suero del neonato. Permite realizar la prueba varias crías en un mínimo tiempo, y con un equipo básico, lo cual hace posible su utilización en condiciones de campo. Se basa en la precipitación de las Ig del suero con sulfito de sodio o con sulfato de Zinc. Fundamento: Se utilizan sales de metales pesados como el sulfato de zinc (Zn SO4) o sulfito de sodio (Na2 SO3) que en determinada concentración pueden unirse al Fc (fracción cristalizable) de las Ig produciendo un fino precipitado. Se denominan también pruebas turbidimétricas porque la precipitación enturbia la mezcla (mayor turbidez corresponde a una mayor concentración de Ig). COAGULACION CON GLUTARALDEHIDO El glutaraldehído es un reactivo que tiene la propiedad de coagular las proteínas séricas (razón por la cual es una sustancia tóxica). El suero se mezcla con una solución de glutaraldehído y se observa luego si hay formación o no de un coágulo. La formación de un coágulo firme y adherente indica un nivel adecuado de Ig. DENSITOMETRIA El calostro es rico en Ig. Dentro de las fracciones proteicas del calostro, las Ig son las que sufren mayor variación cuantitativa. Por lo tanto, la densidad del calostro varía más en función del contenido en Ig que por otros factores. Midiendo la densidad del calostro, se puede tener una idea aproximada de su contenido en Ig. La densidad puede estimarse fácilmente mediante el uso de un calostrómetro. 14 concentración en inmunoglobulinas (g/l) 80 60 40 20 1030 1040 1050 1060 1070 densidad del calostro SEROLOGÍA La serología es la ciencia que estudia la detección de anticuerpos (Ac) en los distintos líquidos corporales tales como lágrimas, secreciones bronquiales, líquido sinovial, leche, calostro, plasma seminal, moco vaginal, suero sanguíneo, plasma, etc. Aunque la palabra "serología" se refiere al suero (y más precisamente, al suero sanguíneo), se utiliza en un sentido amplio abarcando todas las técnicas empleadas para identificar Ac en cualquier humor o tejido del organismo. Por ej., en el diagnóstico de algunas enfermedades, resulta importante detectar Ac en plasma seminal, en moco vaginal, en leche o suero lácteo. Los Ac son elaborados por las células plasmáticas en respuesta a la estimulación producida por una molécula extraña para el organismo llamada Ag. Estos Ag se hallan en las bacterias, los virus, parásitos, hongos, partículas del polvo ambiental, células eucarióticas, etc. Los Ag poseen sitios de unión (epitopes o determinantes antigénicos) a los cuales se unen los Ac en forma específica. El número de epitopes constituye la valencia del Ag. Estos pueden ser iguales o diferentes entre sí, pueden estar repetidos en un mismo Ag (Figura 2). Figura 3 El suero contiene Ac dirigidos contra los distintos epitopes (1, 2, 3, 4) Fuerzas de unión Ag-Ac Factores que afectan la unión Las fuerzas de unión que participan en la interacción Ag-Ac son de tipo no covalente (Figura 4). Si bien cada una de éstas por sí sola es débil, la sumatoria de las mismas crea una unión estable y reversible. Los factores que influyen en esta unión son: - pH - temperatura 15 - tiempo de incubación - agitación - concentraciones relativas de Ag-Ac - concentración de electrolitos Anticuerpo Antígeno H O Enlace de hidrógeno O N N H Enlace electrostático Fuerzas de van der Waals - + - + - + - + + - + - Fuerzas hidrofóbicas agua excluida Figura 4. Fuerzas de interacción atractivas. Extraído de: Regueiro J.R., López Larrea C. “Inmunología. Biología y Patología del sistema inmune”. Editorial Médica Panamericana. 1996. 16 TRABAJO PRÁCTICO Nº2 PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA: FUNDAMENTOS Clasificación de las pruebas serológicas Las pruebas serológicas pueden clasificarse en tres categorías principales: Pruebas de interacción primaria: Detectan la unión Ag-Ac, es decir la formación del complejo inmune. - inmunofluorescencia - ensayo de polarización de luz fluorescente - radioinmunoensayo - enzimoinmunoensayo - inmunocromatografía Pruebas de interacción secundaria: Detectan la consecuencia de la unión Ag-Ac que se observa como un aglutinado o precipitado de acuerdo a las características físicas del Ag (particulado o soluble). - aglutinación - precipitación Pruebas de interacción terciaria: La unión Ag-Ac desencadena un fenómeno biológico visible in vitro (ej: lisis de glóbulos rojos en la prueba de fijación del complemento) o in vivo (ej: reacción intradérmica) gracias a la acción de otros efectores solubles o celulares. - Fijación de complemento - Pruebas intradérmicas Título de un suero El título es una forma de expresar la potencia de un suero inmune. Si en una prueba se enfrenta al Ag con distintas diluciones del suero a analizar, se puede determinar el título del suero. El título se expresa como la inversa de la máxima dilución del suero que dio reacción positiva. PRUEBAS DE INTERACCION PRIMARIA: Las pruebas de laboratorio que detectan la unión directa (o interacción molecular) entre un Ag determinado y el Ac específico para ese Ag se conocen como pruebas de interacción primaria. Estas pruebas pueden ser utilizadas para detectar tanto Ag como Ac en muestras problema. Estas pruebas se basan en el reconocimiento de un Ag por parte de los Ac, formando inmunocomplejos. Normalmente, uno de los dos componentes (Ag o Ac) está adsorbido (inmovilizado, fijado) en una fase sólida, como por ejemplo un tubo de poliestireno, una placa multipocillos de plástico, un portaobjetos conteniendo tejidos o células, o una membrana de nitrocelulosa; y el otro reactivo está "marcado" para facilitar la detección del inmunocomplejo formado. Luego de producida la interacción entre el Ag y el Ac (para lo cual se incuba determinado tiempo), se separara el reactivo marcado libre (en exceso) de aquel que está formando parte de los inmunocomplejos fijos a la fase sólida, para lo cual se realizan sucesivos lavados. El "marcado" del Ag o del Ac se realiza mediante la unión covalente con elementos que emiten una señal característica y observable. A este reactivo (Ag o Ac) marcado se lo denomina conjugado. 17 Las sustancias marcadoras más comúnmente utilizadas para la fabricación de conjugados son isótopos radiactivos, enzimas o colorantes fluorescentes; siendo la señal emitida detectada mediante contadores de radiactividad, a simple vista y/o con espectrofotómetros, fluorocitómetro y/o microscopio de fluorescencia, respectivamente. En algunas de estas pruebas se utilizan los anticuerpos anti-inmunoglobulinas. ¿Cómo se obtienen estos reactivos?: cuando inmunoglobulinas (Ig) purificadas provenientes de una determinada especie animal (ej. bovino) se inyectan en un animal de otra especie (ej. conejo), éstas se comportan como Ag (son reconocidas como extrañas). En este caso, el sistema inmune del conejo reacciona formando anticuerpos (anti-inmunoglobulinas) contra las Ig bovinas, los cuales se purifican para utilizarlos como reactivo en el laboratorio. Entre las pruebas de interacción primaria más utilizadas en el diagnóstico de enfermedades se encuentran Inmunofluorescencia (IF) Enzimoinmunoensayo (Enzyme linked immunosorbent assay o ELISA) INMUNOFLUORESCENCIA Es una técnica utilizada para la detección de moléculas (tanto Ag como Ac, dependiendo del diseño) usando reactivos con colorantes fluorescentes, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), la rhodamina o la ficoeritrina (PE). Estas sustancias al ser excitadas con luz de longitud de onda del rango ultravioleta (190-380 nm), emiten luz visible de longitud de onda mayor que se observa como una fluorescencia amarillo-verdosa (FITC, 495 nm) o anaranjadorojiza (PE y rhodamina, 480-565 nm). Existen dos variantes de esta técnica: la IF directa y la IF indirecta. Inmunofluorescencia Directa (IFD) En esta técnica se utiliza un Ac marcado con una sustancia fluorescente para detectar la presencia del Ag en una muestra de tejido o células o en frotis de cultivos de microorganismos (ver Fig 1A). La muestra es previamente fijada sobre un portaobjetos con un solvente (metanol-acetona). Esta fijación además permeabiliza la membrana de las células para facilitar la entrada del Ac. En un paso posterior se incuba la muestra con el conjugado y luego se elimina el reactivo excedente por medio de lavados con solución salina tamponada. La muestra se examina en un microscopio de fluorescencia con luz azul o verde observándose la fluorescencia generada por el conjugado en los lugares en que ha quedado unido al Ag de la muestra; el resto del campo permanece oscuro. Fig 1A. Inmunofluorescencia directa 18 Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) Esta variante de la IF utiliza como conjugado un Ac anti-Ig marcado con sustancias fluorescentes, para detectar la unión entre un Ac no marcado con su Ag específico (ver Fig 1B) El procedimiento es similar al de IFD, excepto que al corte de tejido (o a las células) fijado al portaobjetos conteniendo un Ag determinado (microorganismo, receptores, etc), se le agrega una muestra problema (conteniendo potencialmente Ac que reconocerán al Ag). Los inmunocomplejos formados luego de la incubación de estos dos componentes serán detectados por la adición del conjugado (la anti-Ig marcada). Luego de los lavados necesarios para la eliminación del conjugado libre, la muestra se observa con microscopio de fluorescencia. Fig 1B. Inmunofluorescencia indirecta ENSAYO DE POLARIZACIÓN DE LUZ FLUORESCENTE (FPA) Se basa en que una molécula en solución rota con una velocidad inversamente proporcional a su tamaño. Si esa molécula está unida a un marcador fluorescente (por ej. FITC) y se lo excita con luz polarizada, se puede evaluar la tasa de rotación de la molécula según en qué direcciones emita la luz. Esto es medido por un detector que lo traduce en una señal. Para la detección de Ac, se hace reaccionar la muestra (por ejemplo suero o sangre) con un Ag de pequeño tamaño marcado con una sustancia fluorescente. Si en la muestra hay Ac específicos contra ese Ag, se unirán al Ag marcado por lo cual este complejo (Ac + Ag marcado), al tener mayor tamaño molecular, tendrá una menor velocidad de rotación que el Ag libre, y esto podrá ser medido mediante un lector de polarización de fluorescencia. Las principales ventajas de este ensayo son que no es necesario separar los complejos Ag-Ac del reactivo en exceso, es una prueba rápida (el resultado se obtiene en menos de 10 minutos habitualmente) y de fácil automatización. En veterinaria se ha estandarizado para el diagnóstico de unas pocas enfermedades infecciosas, y es utilizada más ampliamente en la detección de drogas y metabolitos en distintos fluidos. RADIOINMUNOENSAYO (RIA) El RIA es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador del conjugado. El más común es el 125I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar concentraciones muy pequeñas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), Los radioinmunoensayos pueden realizarse en fases fluidas (RIA) o sólidas. Por ejemplo, en 19 endocrinología permite la cuantificación de hormonas mientras que en clínica se usa para el diagnóstico de enfermedades atópicas detectando la presencia de IgE y alergenos (RIST y RAST). Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de sustancias radiactivas. ENZIMOINMUNOENSAYO (EIA) El enzimoinmunoensayo es una técnica versátil y muy sensible, que puede utilizarse para detectar y medir en una muestra tanto Ag como Ac. Los conjugados que se emplean tienen como marcadores a diversas enzimas. Las enzimas más utilizadas son la peroxidasa, la fosfatasa alcalina y la ß-galactosidasa. Esta técnica recibe diferentes nombres de acuerdo al soporte sobre el que se realiza: cuando es en placa, se denomina ELISA; sobre tejidos, inmunohistoquímica y sobre células, inmunocitoquímica. ELISA (en placa) La prueba se realiza en placas de plástico (poliestireno) de 8 cm x 12 cm que contienen 96 pocillos, cada uno de aprox. 1 cm de profundidad y 0,7 cm de diámetro (Fig. 2) Fig. 2 Placa de ELISA con 96 pocillos Existen muchas variantes del ELISA y su diseño depende de lo que se quiera determinar. La más utilizada es el ELISA indirecto que se usa para determinar la presencia de Ac en una muestra problema, utilizando como conjugado un Ac anti-Ig marcado con una enzima (Fig 3). Para detectar la presencia de este conjugado, se agrega a la reacción un sustrato específico de dicha enzima y un cromógeno que permita observar la acción de la enzima sobre su sustrato. Si luego de la reacción inmunológica y de los posteriores lavados, el reactivo marcado permanece unido a la fase sólida, al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno la enzima actuará sobre su sustrato, modificándolo, y este producto inducirá un cambio de color en el cromógeno soluble sobrenadante (Fig 2). La intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de anti-Ig marcada que se haya captado, y ésta a su vez será proporcional a la cantidad de Ac que se encuentren en la muestra problema. La intensidad de color se puede estimar a simple vista (cualitativo), o lo que es más adecuado, mediante espectrofotometría, expresándose como densidad óptica. Si uno deseara determinar el título de un suero debería incubar la placa en la que se encuentra fijado el Ag con diferentes diluciones del suero problema. La inversa de la última reacción que da reacción positiva es el título del suero. 20 Inmunohistoquímica (IHQ) e inmunocitoquímica (ICQ) Cuando el enzimoinmunoensayo se realiza sobre tejidos o células, hablamos de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, respectivamente. Estas pruebas se realizan sobre cortes de tejido de un modo similar a las IF, pudiendo ser directas o indirectas. En este caso, el conjugado es una inmunoglobulina marcada con una enzima que al actuar sobre su sustrato, lo modifica, y este producto induce un cambio en el cromógeno, convirtiéndolo en un producto de reacción coloreado. Esta prueba se lee con microscopio de luz observándose una reacción positiva como un precipitado de color sobre las estructuras histológicas o las células que contengan el Ag buscado (Fig. 4). Fig. 4. Esquema de una Inmunohistoquímica. INMUNOCROMATOGRAFÍA (CROMATOGRAFIA DE FLUJO LATERAL) La inmunocromatografía es un tipo de prueba de interacción primaria que se utiliza en ensayos sencillos y de lectura rápida. En esta prueba uno de los componentes está marcado con nanopartículas coloreadas, por ejemplo con metales pesados (oro o selenio coloidal, generando bandas de color rosa o azul respectivamente). Otros marcadores pueden ser partículas de látex coloreadas o de carbón. La reacción se lleva a cabo sobre una tira de un material poroso (por ejemplo, nitrocelulosa). En las tiras reactivas se pueden distinguir 5 zonas: 1. Zona de siembra de la muestra 2. Zona del conjugado 3. Zona de detección 4. Zona de control 5. Región absorbente El procedimiento es muy sencillo: la muestra con el Ag a analizar se coloca en la zona de siembra de la muestra, y fluye por capilaridad hasta la zona del conjugado, en donde el Ac específico marcado (conjugado) se encuentra inmovilizado. Al pasar la muestra solubiliza al conjugado, y en caso de haber Ag en la muestra forma inmunocomplejos. Estos inmunocomplejos formados siguen migrando lateralmente hasta la zona de detección, en la cual se hallan fijados a la membrana Acs específicos contra otro epitope del Ag, de manera que los inmunocomplejos son fijados en esta zona de detección, formando una banda coloreada, rosa o azul dependiendo del metal utilizado en el conjugado. La muestra fluye por capilaridad hasta la zona de control. Aquí el exceso de conjugado es capturado por un Ac anti-conjugado, formándose una banda coloreada tanto si el Ag está presente en la muestra como si no lo está. Este control indica que la prueba ha sido realizada correctamente y todos los reactivos funcionan bien. Finalmente el resto de la muestra es absorbida en la región absorbente (ver figura 1). 21 Esta prueba puede ser utilizada también para la detección de Acs. En este caso, el conjugado es el Ag específico marcado. En la zona de detección está fijado un Ac anti-Ig (dependiendo de la especie en la cual se buscan los Acs), el cual capturará los complejos inmunes formados si la muestra posee Acs específicos. En la zona de control un Ac específico para el conjugado (en este caso el Ag marcado) captura el exceso de Ag solubilizado por la muestra. Aplicaciones: En medicina humana se utiliza este test para detectar la gonadotrofina coriónica (test de embarazo). En medicina veterinaria se utiliza para detectar antígenos (Virus de la leucemia felina, parvo y rotavirus, parásitos como Dirofilaria inmitis, y bacterias) o anticuerpos (anticuerpos antivirus de la inmunodeficiencia felina). Zona de la muestra Zona del conjugado Zona de detección Zona de control Fig 1: Esquema de una prueba de inmunocromatografía para detección de antígeno. En la parte superior se esquematiza la prueba positiva, dando una banda en la zona de detección y una segunda banda en la zona de control. En la parte inferior, se esquematiza la prueba negativa, donde sólo se observa reacción en la zona de control. ……………………… La siguiente tabla resume los marcadores utilizados en algunas de las pruebas de interacción primaria más importantes y los equipos utilizados para la lectura o visualización de los resultados. Marcador del conjugado Lectura de la prueba Inmunofluorescencia Fluorocromo Microscopio de fluorescencia Polarización de luz fluorescente Fluorocromo Lector de polarización de fluorescencia Radioinmunoensayo Radioisótopo Contador de radiactividad Enzima Espectrofotómetro o a simple vista Microscopio óptico Microscopio óptico Nanopartículas coloreadas A simple vista Técnica EIA ELISA Inmunohistoquímica Inmunocitoquímica Inmunocromatografía 22 Fig 3. Enzimo inmuno ensayo (ELISA) indirecto 23 24 25 26 TP3: PRUEBAS DE INTERACCIÓN PRIMARIA: ELISA E INMUNOCROMATOGRAFÍA ELISA INDIRECTO: procedimiento e interpretación de resultados Objetivos: conocer los pasos de una prueba de ELISA indirecto, comprender la importancia del uso de controles en la pruebas de laboratorio e interpretar los resultados. Se utilizará la técnica de ELISA indirecto para determinar la presencia/ ausencia y título de los Acs específicos contra un virus. Materiales necesarios: - Placas de 96 pocillos o tiras de 8 pocillos, recubiertas con Ag. - Suero control negativo (sin Acs específicos) y positivo (con Acs específicos) - Diluyente para las muestras y controles - Conjugado (Ac anti-Ig bovina marcado con peroxidasa) - Solución de lavado - Mezcla de sustrato-cromógeno - Servilletas de papel - Micropipetas mono y multicanal - Espectrofotómetro lector de ELISA Procedimiento: A continuación se detalla el procedimiento completo. En el TP terminaremos una prueba comenzada por los docentes (a partir del paso 3) 1. Colocar los reactivos a TA con 30 minutos de anticipación. 2. Incubación de las muestras y controles en los pocillos recubiertos con Ag, según los siguientes diseños: a. Diseño utilizado para detectar presencia/ausencia de Acs específicos. En este caso tanto los controles como la muestra problema se colocan a una dilución determinada, por ejemplo 1:10. En los pocillos que no se coloca muestra (blancos) se coloca solamente el diluyente de muestras. POCILLO A B C D E F G H MUESTRA Ctrl. positivo Ctrl. positivo Ctrl. negativo Ctrl. negativo M. problema M. problema COLOR DO 405 nm RESULTADO b. Diseño utilizado para determinar el título de un suero. Se analizan varias diluciones de una muestra problema (MP) POCILLO A1 B1 C1 D1 E1 MUESTRA Ctrl. positivo Ctrl. positivo Ctrl. negativo COLOR DO 405 nm RESULTADO 27 F1 G1 H1 A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 Ctrl. negativo MP 1:25 MP 1:25 MP 1:50 MP 1:50 MP 1:100 MP 1:100 MP 1:200 MP 1:200 MP 1:400 MP 1:400 Incubación durante 1 hora a 37ºC. 3. Lavar 4 veces con solución de lavado (Invertir las tiras y eliminar el líquido, llenar los pocillos con solución de lavado. Repetir este procedimiento 4 veces. Invertir la tira sobre una servilleta de papel para escurrir) 4. Agregar 100 µl/pocillo de conjugado. Incubar 15 minutos a 37ºC. 5. Lavar 4 veces con solución de lavado (Idem paso 3). 6. Agregar 150 µl/pocillo de mezcla sustrato/cromógeno (ABTS/H2O2) 7. Incubar de 20 a 30 min a temperatura ambiente. Observar el desarrollo o no de color en los distintos pocillos. Registrar los resultados en la tercera columna de la tabla. 8. Realizar lectura espectrofotométrica a 405 nm. Registrar los valores obtenidos en la cuarta columna de la tabla. 9. Interpretación de resultados: ¿A qué se debe el desarrollo de color en los pocillos C y D? ¿Por qué no se desarrolla color en los pocillos E y F? ¿Cuál es el título de la muestra problema? INMUNOCROMATOGRAFIA: procedimiento e interpretación de resultados Objetivos: Conocer las etapas de una prueba de inmunocromatografía e interpretar los resultados. Se utilizará un test comercial de inmunocromatografía para detectar la presencia de una hormona (gonadotrofina coriónica humana) en orina. Se seguirán las instrucciones provistas por el fabricante. Se interpretarán los resultados obtenidos y se discutirán otros posibles resultados. 28 TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 PRUEBAS DE INTERACCION SECUNDARIA: FUNDAMENTOS Precipitado formado (mg) Estas pruebas comprenden dos etapas. En la primera se forman rápidamente los complejos Ag-Ac (complejos primarios), los cuales no pueden observarse directamente. Luego, en la segunda etapa o reacción secundaria, los complejos se van agregando hasta hacerse visibles como precipitado o aglutinado. La temperatura acelera esta segunda etapa, que además es dependiente de la concentración de electrolitos (generalmente la reacción se realiza en solución fisiológica). Las uniones entre los complejos primarios dan origen a estructuras tridimensionales en forma de red (enrejado de Marrack). La formación de estos agregados es una consecuencia de la bivalencia de los Ac y la multivalencia de los Ag, ya que si no se cumplen estos requisitos, la red no puede formarse. Además, los reactivos deben estar en proporciones óptimas, dado que la concentración en exceso tanto del Ag como del Ac origina complejos solubles (Fig. 1). Si a la preparación antigénica se le agrega un exceso de Ac no se produce reacción. Este fenómeno se denomina prozona. Zona de exceso de anticuerpos Zona de proporciones óptimas 0,3 1 Zona de exceso de antígeno 3 2 1 0 1,5 Antígeno (mg) Figura 1: Curva de precipitación cuantitativa. Modificado de Tizard, I. Inmunología Veterinaria. Ed. Interamericana, Méjico. 1995. Cuando los Ac se combinan con Ag solubles (toxinas, proteínas, extractos de pared bacteriana) en soluciones con condiciones apropiadas, los complejos precipitan (REACCION DE PRECIPITACION). Si los Ag son particulados (bacterias, eritrocitos) y están en suspensión, entonces se aglutinan al unirse a los Ac específicos en condiciones adecuadas (REACCION DE AGLUTINACION). Un mismo Ac puede dar aglutinación y precipitación, por ejemplo, con una suspensión bacteriana y con un lisado de la misma, respectivamente. PRUEBAS DE AGLUTINACION Se pueden leer a simple vista o bajo aumento (microscopio óptico o lupa). La reacción positiva (presencia de aglutinado o grumos) indica que Ag y Ac están presentes en la reacción (y en proporciones óptimas). En la figura 2 se muestra un esquema de los resultados obtenidos en dos pruebas de aglutinación en tubo. La primera (Fig. 2a) se realizó con suero del primer muestreo de un animal, ensayando las diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640. Se ve que la reacción 29 es positiva sólo en los 2 primeros tubos (1/20 y 1/40). La segunda prueba (Fig. 2b), realizada con suero de un muestreo del mismo animal a los 40 días del primero, muestra reacción positiva hasta una dilución 1/320. Esto indica que hubo seroconversión (conversión serológica), ya que el título del suero en el primer muestreo fue 40 y en el segundo fue 320. 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Figura 2a: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 y 1/40. 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Figura. 2b: Aglutinación en tubo. Reacción positiva en diluciones 1/20 a 1/320. Las pruebas de aglutinación pueden clasificarse según: Los elementos reactivos, en: - directas: cuando el Ag es particulado. - indirectas o pasivas: cuando el Ag soluble se acopla a partículas (por ejemplo: partículas de látex, glóbulos rojos) para que la reacción con Ac específicos sea una aglutinación en vez de una precipitación. el tiempo de realización, en: - rápidas: si se pueden realizar en pocos minutos. - lentas: si se requiere una incubación de horas o días. el grado de detección, en: - cualitativas: si sólo detectan presencia o ausencia de Ac. - semicuantitativas: si permiten estimar la concentración de Ac en la muestra (título del suero). el soporte, en: -en placa (corresponde a las pruebas rápidas). - en tubo (corresponde a las pruebas lentas). Aplicaciones: - Diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas. - Identificación de serotipos bacterianos. - Tipificaciones de sueros sanguíneos (para determinación de grupos sanguíneos). 30 - Identificación del isotipo de Ig (IgG o IgM) al que pertenecen los Ac presentes en el suero: mediante el tratamiento previo del suero con -mercaptoetanol se despolimeriza la IgM, perdiendo su capacidad de aglutinar. Este procedimiento permite conocer en qué etapa de la respuesta inmune del animal se obtuvo la muestra. - Valoración de anticuerpos “incompletos” o bloqueantes (prueba de Coombs): ciertos Ac (monovalentes desde el punto de vista funcional), al estar en presencia de las partículas correspondientes, se unen a ellas pero no las aglutinan. Esta unión bloquea a las partículas, impidiendo la aglutinación por Ac específicos bivalentes. Para valorar estos Ac bloqueantes, luego de que éstos se han unido a las partículas, se agrega una antiglobulina la cual producirá la aglutinación por unión a los Ac bloqueantes. Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos en suero que reaccionan con antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos como ocurre en la isoeritrolisis neonatal del potrillo. PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN Se utilizan para detectar tanto Ag como Ac, en forma cuali o cuantitativa. Pueden realizarse en medio líquido (en tubos) o en medio semisólido (en tubos, placas, portaobjetos). Cuando se realizan en medio semisólido (gel de agar o agarosa) reciben el nombre de inmunodifusión. Al difundir y ponerse en contacto el Ag con el Ac, precipitarán formando una banda o halo cuando estén en la relación óptima. El número de bandas de precipitación indica la cantidad mínima de sistemas reaccionantes presentes. Es decir que, si las soluciones contienen varios Ag y Ac diferentes, se producirá una línea de precipitación separada para cada grupo interactuante de Ag y Ac. En las pruebas de inmunodifusión se preparan, por ejemplo, placas de Petri con una capa de gel de agar o agarosa donde se realizan pequeños orificios. En la inmunodifusión radial (Fig. 3) uno de los reactivos (por ejemplo, el Ac) se añade al gel antes de preparar la placa, y en los orificios se siembra el otro reactivo a analizar (por ejemplo, muestras conteniendo o no al Ag), colocando siempre controles positivos. Al difundir en forma radial y enfrentarse el Ag con el Ac correspondiente, se formará un halo o anillo de precipitación alrededor del orificio. La lectura se realiza midiendo el área del anillo de precipitación, y comparándola con los valores de una curva estándar, siendo el diámetro del halo proporcional a la cantidad de reactivo sembrado en el pocillo (Fig. 4). anticuerpos disueltos en el gel antígeno en los pocillos Figura. 3: Inmunodifusión radial 31 Figura 4. Curva estándar para determinación de la concentración de Ig mediante inmunodifusión radial En la inmunodifusión doble bidimensional (prueba de Ouchterlony) ambos reactivos (Ag y Ac) son sembrados en orificios enfrentados y los dos difunden en el gel. La presencia de una banda de precipitación entre los dos orificios, indica una reacción positiva (Fig. 5). 1 Pocillos 2, 4 y 6: controles sueros positivos. Pocillos 1, 3 y 5: problema sueros a. Pocillo central: Ag 6 2 Ag 3 5 Agantígeno. 4 Figura 5: Inmunodifusión doble bidimensional De acuerdo a las leyes de la difusión, la distancia a la que una sustancia difunde está en relación directa con su concentración y en relación inversa con su peso molecular. Es decir que, si uno de los reactivos está en exceso, la banda se formará cerca del pocillo del reactivo presente en menor concentración (Fig. 6, reactivo a) y si uno de los reactivos tiene moléculas de distinto peso molecular, éstas difundirán con distinta velocidad, dando lugar a la formación de más de una banda (Fig. 7). a b Figura 6 c d Figura 7 32 Aplicaciones: - Las reacciones en medio líquido se aplican al diagnóstico e identificación de distintas proteínas animales en productos alimenticios (análisis bromatológicos) o en medicina forense. - Las pruebas de inmunodifusión se aplican en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y para la determinación de Ig, C3, transferrina y otras proteínas. También se utilizan para el análisis de la pureza de una preparación antigénica y de las reacciones cruzadas entre distintos Ag. En esta última aplicación se investiga el grado de identidad que presentan dos Ag entre sí, enfrentándolos con un suero específico para uno de ellos. Pueden obtenerse distintos resultados: Ag x Ag x Ag x Ag x-y Ac x + Ac y Ac x a)Identidad total b) Identidad parcial Figura 8 Ag x Ag y Ac x + Ac y c) No identidad La identidad total indica que ambos Ag son idénticos, es decir, no pueden ser diferenciados entre sí por el antisuero utilizado. Las bandas de precipitación se funden en una sola línea (Fig. 8 a). La identidad parcial indica que existe una cierta relación entre los Ag, pero que uno de ellos (Ag x-y) presenta componentes antigénicos (epitopes) no compartidos con el otro. Las bandas de precipitación se funden parcialmente en una línea, apareciendo una prolongación o espolón (Fig. 8 b). La no identidad expresa que no hay ninguna característica compartida entre ambos Ag. Cada sistema reacciona independientemente, originando bandas de precipitación que se cruzan (Fig. 8 c). 1) ¿Cuáles son las condiciones necesarias para que ocurra una reacción de aglutinación? ¿Y una de precipitación? 2) ¿Qué ocurre si en una precipitación se emplea un suero con exceso de Ac? 3) Esquematice una reacción de aglutinación con IgG, otra con IgM. ¿Qué ocurre en ambos casos si el suero se trata con -mercaptoetanol? 4) ¿Cómo se calcula el título de un suero? 33 TRABAJO PRÁCTICO Nº5 PRUEBAS DE INTERACCIÓN SECUNDARIA: AGLUTINACIÓN Y PRECIPITACIÓN PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN: Objetivo: realizar pruebas de aglutinación en placa (rápidas) y observar resultados de pruebas de aglutinación en tubo (lentas). Realizar reacciones de aglutinación cualitativas y semicuantitativas (empleando distintas diluciones de un suero para determinar el título del mismo). Identificar el isotipo responsable de la aglutinación, comparando los resultados de la prueba en presencia y ausencia de -mercaptoetanol. Explicar el fenómeno de prozona. Materiales: Sueros Suspensiones de antígenos Tubos Pipetas Pro-pipetas Solución fisiológica Aglutinoscopio Procedimiento/Protocolo: Aglutinación en placa: 1) Colocar sobre el vidrio 30 l de la suspensión antigénica y un volumen igual del suero sin que se mezcle con la suspensión. Repetir el procedimiento utilizando 30 l de solución fisiológica en vez de suero (control negativo). Mezclar el suero con el antígeno, y por otro lado, la solución fisiológica con el antígeno. El resultado se expresa como positivo (+) cuando se forma un aglutinado o negativo (-) cuando esto no ocurre. Esta es entonces una reacción cualitativa. Describa cómo observa una reacción positiva y una negativa. 2) Emplear el suero puro y también realizar las siguientes diluciones, empleando solución fisiológica como diluyente: puro Soluc. fisiol.: Suero: 80l 1/2 40l 40l Diluciones 1/4 1/8 40l 40l 1/16 40l 40l 40l 40l 40l Esta es una reacción semicuantitativa. Observar hasta cuál dilución hay aglutinación. Calcular el título (inversa de la máxima dilución que dio resultado positivo). Aglutinación en tubo: Esta prueba es lenta, ya que luego de mezclar en el tubo la suspensión del antígeno con el suero, debe incubarse en estufa a 37ºC durante 48 h. Por lo tanto observaremos el resultado de pruebas realizadas con anterioridad. Considerar que todos los tubos tienen el mismo volumen de antígeno y que las diluciones del suero son: 1/25, 1/50, 1/100, 1200 (Esta es una reacción semicuantitativa). Observar aglutinado en el fondo del tubo y líquido claro (reacción positiva). Diferenciar con botón y líquido turbio (reacción negativa). 34 1) ¿Cuál sería el resultado si ocurre el fenómeno de prozona con un determinado suero? 2) Calcular el título de uno de los sueros en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol. 3) Realizar un esquema de lo que ocurre en presencia y en ausencia de -mercaptoetanol si la aglutinación se debe a la presencia de IgM específica contra ese antígeno. Dibujar las moléculas de antígeno y los anticuerpos. PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN (INMUNODIFUSIÓN): Objetivo: Conocer cómo se realiza una inmunodifusión doble bidimensional, realizando la siembra de sueros y soluciones de antígenos. Observar la presencia de bandas en reacciones preparadas con anterioridad. Observar reacciones de inmunodifusión radial. Conocer los factores que influyen sobre la velocidad de difusión y las causas que originan una doble banda de precipitación. 1) Realizar un esquema de: a) una prueba de inmunodifusión doble bidimensional realizada para determinar la presencia de anticuerpos contra un antígeno determinado. b) una prueba de inmunodifusión radial c) una prueba de inmunodifusión doble bidimensional que evidencia identidad parcial entre 2 antígenos. Realice también el esquema para identidad total y no identidad. 2) Sobre una placa conteniendo un gel de agarosa, sembrar 5 l de la solución del antígeno en el pocillo central y 5 l de cada suero en los demás pocillos. Haga además un esquema de resultados a obtener si algunos de los sueros contienen anticuerpos específicos contra ese antígeno. 35 TRABAJO PRÁCTICO Nº6 CARACTERÍSTICAS DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS. INTEGRACIÓN DE TP Repaso y discusión de conceptos importantes: conversión serológica o seroconversión, Ac monoclonales, afinidad, avidez, especificidad de un Ac, reacción cruzada, sensibilidad y especificidad de una prueba serológica. El suero es una fuente heterogénea de Ac producto del contacto con diferentes antígenos (Ag). Si deseamos investigar la presencia de Ac específicos contra un Ag determinado debemos utilizar una prueba serológica adecuada. El resultado de la prueba nos permitirá establecer si el animal tuvo contacto con el Ag en cuestión. La presencia de Ac para un determinado Ag no implica que el animal esté enfermo. Para determinar si ocurre una evolución de la respuesta inmunitaria (humoral), deben compararse los títulos de dos muestras de suero tomadas con un intervalo de 3 semanas, y si el título de la segunda muestra es mayor (mínimo 4 veces) que la primera se dice que ocurrió seroconversión o conversión serológica. Por lo anteriormente expuesto se dice que la serología cumple un papel complementario en la confirmación de un diagnóstico. La respuesta del sistema inmune a cualquier antígeno, aún el más simple, es policlonal. Esto significa que el sistema fabrica anticuerpos contra un gran rango de epitopes del Ag. Los sueros policlonales obtenidos luego de la inoculación de un Ag en un animal, son comúnmente utilizados como herramientas en serología, diagnóstico e investigación. Los anticuerpos monoclonales (ANEXO 1) son anticuerpos idénticos de especificidad única sintetizados por un único clon de células plasmáticas modificadas artificialmente para que pueda hacérselos crecer indefinidamente. Los Ac monoclonales son hoy ampliamente usados como reactivos de diagnóstico e investigación. Afinidad – La afinidad de un Ac es la fuerza de reacción entre un epitope simple y un sitio individual de combinación con el Ag sobre un Ac. Es la sumatoria de las fuerzas de atracción y repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de unión al Ag del Ac. (figura 5) Alta afinidad Baja afinidad Ac Ac Figura 5. Avidez Avidez es la medida de la fuerza total de unión de Ac multivalentes con un Ag que presenta varios determinantes antigénicos. 36 Por lo tanto, la afinidad se refiere a la fuerza de unión de un solo determinante antigénico y un sitio de combinación para el Ag en un anticuerpo individual, mientras que la avidez se refiere a la fuerza de unión total entre varios antígenos y anticuerpos polivalentes. La avidez es influenciada por las valencias del anticuerpo y del antígeno. Afinidad: 104 Avidez: 106 Avidez: 1014 Figura 6 Especificidad de un Ac: se refiere a la capacidad de un Ac de reaccionar con un solo epitope a través de un sitio individual de unión con el Ag. También puede decirse de un conjunto de moléculas de Ac que tiene la capacidad de reaccionar con solo un Ag. En general, existe un alto grado de especificidad en las uniones Ag-Ac. Reacción cruzada: se refiere a la capacidad de de un Ac individual o de un conjunto de Ac de reaccionar con más de un Ag. La reacción cruzada puede originarse por el reconocimiento de Ag que comparten epitopes con el Ag original o epitopes similares al del Ag original (Figura 7). Reacción cruzada Ac Anti-A Ag A Ac Anti-A Ac Anti-A Ag B Ag C Epitope compartido Epitope similar Figura 7 Dos conceptos importantes: Sensibilidad y especificidad Para interpretar una prueba serológica se deben tener en cuenta los conceptos de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad de una prueba serológica es la capacidad para detectar la mínima cantidad de Ag o Ac presente en la muestra (Tabla 3). La especificidad de una prueba serológica está dada por la capacidad de la prueba para detectar uniones Ag-Ac específicas. 37 Pruebas Valores Ac (mg/ml) Pruebas de unión primaria Radioinmunoensayo competitivo ELISA 0,00005 0,0005 Pruebas de unión secundaria Neutralización de antitoxina Inhibición de la hemaglutinación Aglutinación bacteriana Hemaglutinación pasiva Prueba de precipitación en anillo Precipitación en gel 0,00005 0,005 0,05 0,01 18 30 Pruebas de unión terciaria Prueba de fijación de complemento 0,05 Tabla 3. Cantidad mínima de anticuerpo detectable con ciertas pruebas inmunológicas. Extraído de: Tizard I. “Inmunología Veterinaria”. Editorial Interamericana. 1996. Cuestionario para la integración de TP 1) Para cada uno de los siguientes objetivos, elija una prueba serológica y describa cómo la realizaría para: a) determinar si en las muestras de suero de 3 animales hay Ac contra cierta bacteria b) conocer cuál es el título de esos sueros c) determinar el isotipo de esos Ac (si son IgM o IgG) d) detectar la presencia de una bacteria en un tejido e) conocer en qué células de un tejido está presente determinada proteína f) cuantificar IgM total en un suero canino g) determinar si un animal está respondiendo a un determinado Ag h) detectar la presencia de Ac incompletos o monovalentes 2) En una prueba de interacción secundaria, ¿en qué situaciones puede haber formación de complejos inmunitarios sin formación de la red de Marrack? ¿Cómo se podrían confirmar las distintas hipótesis? 38 ANEXO 1 ANTICUERPOS MONOCLONALES Los anticuerpos generados en un animal por inmunización activa, (natural o artificial), son heterogéneos ya que tienen diferentes especificidades y afinidades. Proceden de distintos clones de linfocitos B estimulados, por lo que constituyen un conjunto policlonal de anticuerpos. Esta respuesta policlonal representa una ventaja adaptativa, permitiendo disponer de Ac capaces de unirse a una gran variedad de antígenos, de expresar diferentes funciones biológicas y de evolucionar adaptándose al curso de la respuesta inmunitaria. Por ser reactivos específicos (hacia un antígeno), los Ac pueden ser también utilizados por el hombre para diversos fines, por ejemplo, para diagnóstico, en terapéutica o para separar moléculas con fines industriales. Tradicionalmente, un Ac hacia un antígeno se obtiene inmunizando animales y obteniendo su suero, fuente principal de Ac. Los conejos y los caballos han sido y aún son muy usados como productores de sueros inmunes. Recordemos que éstos son reactivos policlonales. Para algunos usos, sin embargo, la heterogeneidad de los Ac de un suero puede ser una desventaja. Además, cada preparación de suero es diferente, aún cuando se usen animales genéticamente idénticos, inmunizados con la misma preparación de antígeno y con el mismo protocolo de inmunización. Dicho en otros términos: cada respuesta inmunitaria es única. Por lo tanto es imposible usar reactivos serológicos idénticos en una larga serie de pruebas. Estas desventajas pueden ser salvadas por los anticuerpos monoclonales, que, como su nombre lo indica, derivan de un único clon de linfocitos B y son por lo tanto específicos para un epitope determinado e idénticos entre sí, constituyendo una población homogénea. Como no es posible purificarlos a partir de un suero policlonal, G. Köhler y C. Milstein desarrollaron en 1975 un método para su preparación, que se basa en la fusión de un linfocito B normal con una célula plasmática tumoral (célula de mieloma). La célula híbrida resultante (llamada hibridoma) hereda de la célula de mieloma la capacidad de crecer indefinidamente in vitro, y del linfocito B la de secretar anticuerpos. Luego de la fusión, las células híbridas deben separarse de las que no se fusionaron y de las que se fusionaron con otra célula del mismo tipo. Esto se logra usando células de mieloma deficientes en una enzima requerida para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos por una vía alternativa que reutiliza las purinas. Por lo tanto, si luego de la fusión las células se cultivan en un medio que contiene un inhibidor de la vía de síntesis de novo de los nucleótidos (medio HAT), sólo podrán desarrollar las células que puedan utilizar la vía de síntesis alternativa (es decir, los hibridomas, porque heredan del linfocito la capacidad de utilizar esta vía). Las células de mieloma que no se fusionaron o se fusionaron entre ellas no se multiplicarán porque no poseen la vía alternativa, y a su vez, los linfocitos B que no se fusionaron o se fusionaron entre ellos tampoco se multiplicarán ya que no tienen la capacidad de crecer indefinidamente in vitro. El paso siguiente es la selección de los clones que secreten el Ac con la especificidad deseada, para lo cual se analiza el sobrenadante del cultivo de cada hibridoma mediante pruebas serológicas como ELISA y RIA. Una vez detectados los hibridomas productores del Ac deseado, y controlada su clonalidad, cada clon se cultiva para producir el Ac monoclonal deseado. El cultivo puede hacerse in vitro (en medios apropiados para células) o bien in vivo, inyectando intraperitonealmente las células del hibridoma en ratones y obteniendo tiempo después el líquido ascítico acumulado, que contendrá una elevada concentración del Ac monoclonal. Los hibridomas por su parte, se conservan indefinidamente por congelación, pudiendo descongelarse y cultivarse todas las veces que se desee, obteniendo siempre el mismo Ac. Como cada hibridoma es un clon derivado de la fusión de un único linfocito B, todas las moléculas de Ac que produce son idénticas en estructura y por lo tanto tienen el mismo sitio de unión al antígeno e isotipo. 39 Antígeno Aislar células del bazo Selección Fusión Suero Linfoblastos Cél. de mieloma Hibridomas Ac4 Ac1 Ac1 Ac1 Ac2 Ac3 Ac4 Ac3 Ac2 Ac3 Ac2 Ac4 Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales Epitopes que reconocen Ac policlonales (suero) Ac monoclonales Varios * Unico Especificidad Varía entre animales y entre sangrías. Afinidad Variable entre sangrías. Rendimiento Concentración media 1 mg/ml Volumen variable (según especie) Fija Bajo en cultivo de tejidos. Alto (hasta 20 mg/ml) en líquido ascítico) Costo relativo Bajo Alto No varía. Alta especificidad. *Sin embargo, cada uno de los Ac presentes en el suero reconoce un único epitope. Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales - - Investigación (purificación y detección de antígenos). Diagnóstico in vitro (de preñez, microorganismos patógenos, medición del nivel de ciertas drogas en sangre, estudios de histocompatibilidad, detección de antígenos tumorales) e in vivo (detección de antígenos tumorales). Fines terapéuticos (inmunotoxinas compuestas por Ac monoclonales específicos de células tumorales unidos a una toxina letal). Bibliografía: - Kuby, J. 1997. Immunology. 3rd. ed. W. H. Freeman and Company, New York. p. 131-135. - Campbell, A. M. 1984. Monoclonal antibody technology. 1st. ed. Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam. p. 1-30. 40 ANEXO 2 Pruebas de interacción primaria Enzimo Inmuno Ensayo Dentro de las pruebas de interacción primaria, las pruebas de ELISA han sido de las más difundidas. Pueden utilizarse para detectar o cuantificar tanto antígenos como anticuerpos, pueden aplicarse fácilmente a diversos fluidos como leche u orina, requieren pequeños volúmenes de muestra y son relativamente rápidas. Otra propiedad importante es que la señal (color) puede ser cuantificada por aparatos específicos (espectrofotómetro) dando un resultado objetivo que puede ser fácilmente automatizado. En el desarrollo de los TP Nº3 y 4, se discutió el ejemplo de prueba de ELISA llamado ELISA indirecto. Dependiendo de la secuencia en que se empleen los diferentes reactivos (anticuerpos, antígeno y conjugado), podemos generar gran cantidad de variantes de esta prueba. A continuación se describen algunas de ellas, como son el ELISA de captura o sandwich y el ELISA competitivo (fig. 1 y 2) Fig 1. ELISA de captura o sandwich 41 Este tipo de ELISA puede utilizarse tanto para la detección de Ag como la de Ac. En este ejemplo se utiliza para la detección de un AgX en una muestra compuesta por diferentes proteínas. Los Ac del isotipo. Fig. 2: ELISA competitivo. El ELISA competitivo puede utilizarse para determinar la concentración tanto de Ag como Ac. En el ejemplo de la Fig. 2, se determina la concentración de Ag de una muestra utilizando un Ac específico inmovilizado en la placa. El método se basa en la competencia por la unión con el Ac de captura entre el Ag de la muestra y un Ag marcado con enzima. Cuanto menor sea la intensidad del color generado, es decir menor absorbancia medida con el espectrofotómetro, mayor será la concentración de Ag en la muestra problema. El Ag de la muestra (Ag sin marcar) desplaza al conjugado (Ag marcado), que se elimina con los lavados, disminuyendo así la cantidad de enzima presente en el pocillo y por consiguiente la cantidad de color generado al agregar la mezcla de sustrato-cromógeno. Las concentraciones del Ag en la muestra se calculan a partir de una curva patrón construida con concentraciones conocidas del Ag. 42 Veamos algunos de los reactivos que se utilizan en las pruebas de interacción primaria: Anticuerpos policlonales, obtenidos a partir del suero de animales inmunizados con el antígeno de interés. Anticuerpos monoclonales, es decir, producidos por un único clon de células plasmáticas, por lo tanto con única especificidad. Investigue en la bibliografía como se obtienen los anticuerpos monoclonales. Anticuerpos anti-inmunoglobulina, obtenidos por inmunización con inmunoglobulinas de una especie determinada en un animal de otra especie. Por ejemplo: anticuerpos generados en conejo anti-IgG bovina (conejo anti IgG bovina) Por su practicidad y relativo bajo costo, las pruebas de ELISA son de fácil implementación en programas de control y erradicación de enfermedades infecciosas y en relevamientos serológicos. Aplicaciones del ELISA Hay una gran variedad de infecciones en animales domésticos en las que el ELISA puede ser aplicada para su detección. A continuación se resumen algunas de las aplicaciones de esta técnica tanto en la detección de Ag como de Ac en enfermedades infecciosas (Cuadro 1) y no infecciosas. En el cuadro 2 se muestran las aplicaciones de la técnica de ELISA en otras áreas distintas a las enfermedades infecciosas. Enf. Virales Detección de Ac Detección de Ag Enf. Bacterianas Enf. parasitarias Rotavirus Leptospira Trichinella spiralis Parvovirus Salmonella Tripanosoma Coronavirus Brucella abortus Babesia Rabia Campylobacter Toxoplasma fetus gondii Leucosis aviar Haemophilus Leucosis bovina Toxina tetánica Fasciola hepatica Aftosa Enterotoxina de Echinococus sp. E. coli Parvovirus Brucella abortus Toxoplasma gondii Anemia Infecciosa Equina Rotavirus Cuadro 1: Aplicaciones de la técnica de ELISA para el diagnóstico de enfermedades infecciosas. 43 Hormonas Insulina Estrógenos Progesterona Hormonas tiroideas Enf. Autoinmunes Ac anti tiroglobulina Ac anti eritrocitos Complejos inmunes Ac anti ADN Inmunoglobuli Bromatología nas IgG especie de origen de las carnes IgA IgE IgM Cuadro 2: Otras aplicaciones de la técnica de ELISA. Otras pruebas de interacción primaria utilizadas tanto en investigación como para el diagnóstico de enfermedades se enumeran a continuación: Radio Inmuno Análisis (RIA) Test de adsorción inmune (Radio Inmuno Sorbent Test o RIST) Test de adsorción de alergeno (Radio allergo Sorbent test o RAST) Western Blot Inmunofluorocitometría Radioinmunoanálisis (RIA) El RIA es una prueba de interacción primaria que utiliza un radioisótopo como marcador. El más común es el 125I. Esta prueba es muy sensible y permite cuantificar concentraciones muy pequeñas de una sustancia (hasta el orden de pg/ml), por ejemplo, en endocrinología permite la cuantificación de hormonas (Fig 3). En clínica se usa para el diagnóstico de enfermedades atópicas detectando la presencia de IgE total y específica para un determinado antígeno (RIST y RAST, respectivamente). El soporte sólido utilizado en ambos casos es un disco de celulosa. RIST (radioinmunosorbent test) es un RIA competitivo en el cual se detecta la cantidad total de IgE del suero de un paciente alérgico sin importar su especificidad. Los niveles séricos de IgE son generalmente bajos. Una respuesta de Ac en la que se elevan significativamente las concentraciones séricas de IgE sugiere una predisposición genética a padecer alergia, pero no aporta datos sobre el Ag que provoca esa respuesta. Se detectan asimismo niveles aumentados de IgE en animales parasitados. RAST (radio allergo sorbent test) es un radioinmunoensayo donde se detecta IgE específica para un determinado Ag o alergeno. Estas pruebas deben ser ejecutadas por personal autorizado y experimentado, debido a los potenciales peligros para la salud y la contaminación ambiental que supone el manipuleo de sustancias radioactivas. 44 Fig. 3 Radioinmunoensayo competitivo Western Blot Mientras que el ELISA detecta los anticuerpos contra un determinado Ag presentes en líquidos biológicos, dando resultados negativos, positivos o indeterminados, el Western Blot es un test más específico. Esta técnica permite identificar un Ag o Ac determinado en una muestra de composición heterogénea. Por ejemplo, se pueden identificar los Acs generados contra diferentes fracciones de un patógeno, que componen una respuesta policlonal contra el mismo. El Western Blot combina la separación de proteínas de una mezcla de acuerdo a su peso molecular, con la detección inmunológica de Ag individuales mediante el uso de Ac específicos para esos Ag. (Fig. 4). 45 Dada su alta especificidad, el Western Blot se utiliza en muchos casos como prueba confirmatoria (p.e.: SIDA) y ha probado ser una herramienta muy útil para identificar los Ag más importantes en microorganismos complejos y parásitos. Fig. 4 Western Blot 46 CD4-CD8+ Doble positivo (CD4+CD8+) CD4+CD8- CD4-CD8- 1 10 100 1000 PE (CD8) FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) o Citometría de flujo Fluorescence activated cell sorting (FACS o Citometría de flujo) es una técnica que permite analizar ciertas propiedades físicas y químicas de células o partículas a las que se les ha unido uno o mas Ac monoclonales marcados con colorantes fluorescentes, capaces de reconocer epitopes sobre antígenos de superficie celular (por ejemplo CD4, CD8 y CD3). (Fig. 5). Estas células o partículas se encuentran en suspensión y fluyen, una a una, frente a un rayo láser. A su paso frente al rayo, la luz es desviada en un ángulo determinado, el cual es proporcional al tamaño de esa célula. A su vez, los fluorocromos (colorantes fluorescentes) de los anticuerpos unidos a la célula son activados por la luz del rayo láser, emitiendo fluorescencia, que es colectada por sensores, filtrada y almacenada en una computadora. 1 Histograma 10 100 1000 FITC fluoresc. (CD4) Diagrama de puntos Fig. 5. Esquema de funcionamiento del Citómetro de flujo y gráficos de resultados El análisis de poblaciones celulares mediante citometría de flujo ha impactado enormemente en inmunología dada su capacidad para diferenciar y cuantificar simultáneamente sub-poblaciones 47 celulares. Los resultados obtenidos de este análisis pueden graficarse de diferentes formas, entre ellas en forma de histograma y en forma de diagrama de puntos. En el histograma se representa la cantidad de células con una alta intensidad de fluorescencia (área sombreada) debida a la unión del conjugado con moléculas de la superficie celular comparada con una población control negativa (area blanca). En el ejemplo presentado para el diagrama de puntos se analizan, mediante el uso de dos conjugados (Ac anti CD8 marcados con Phicoeritrina (PE), y Ac anti CD4 marcados con fluoresceína (FITC), las subpoblaciones de linfocitos T colaboradores (CD4+), citolíticos (CD8+) e inmaduros (CD4+CD8+) de una suspensión de timocitos. Entre las aplicaciones de esta prueba se pueden nombrar medición de la intensidad de expresión de moléculas de superficie, contenido de ADN, ARN y proteína, tamaño, viabilidad, granularidad y pH. 48 Preguntas sobre temas de clases 49 INTRODUCCIÓN AL SISTEMA INMUNITARIO 1. ¿Qué es el sistema inmune?¿Qué ocurre en ausencia de un sistema inmunitario funcional? 2. ¿La vigilancia inmunitaria se cumple sólo frente a agentes externos al organismo? 3. Indique las barreras naturales que posee un animal, clasificándolas en físicas, químicas y biológicas. Identifique algunos factores que puedan alterarlas. 4. Frente a las siguiente situaciones, indique en qué caso espera obtener mayor respuesta inmune del animal inyectado y justifique su respuesta. I Un bovino al que se le inyecta: a) Una proteína de ratón b) Una proteína de ovino II Un bovino al que se le inyecta : a) Una proteína de 200 KDa b) Un pequeño péptido, proveniente de la digestión de esta proteína. III Un bovino al que se le inyecta : a) Una proteína b) Un lípido 5. ¿Cuáles células del sistema inmune derivan de la línea mieloide y cuáles de la línea linfoide? Para cada uno de los tipos celulares mencionados, indique la función y la principal localización. 6. ¿Qué diferencias existen en el reconocimiento de material por parte de la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. ¿Qué estructuras son reconocidas por la inmunidad innata? Indique los receptores que las reconocen y su localización. 7. Realice un esquema de los pasos del proceso de fagocitosis. Indique las células y moléculas involucradas. 8. ¿Cuáles son las diferencias entre la actividad fagocítica de los macrófagos y de los neutrófilos? 9. Indique cuáles son los mecanismos bactericidas más importantes que se desencadenan tras la fagocitosis. 10. ¿En qué tipo de infecciones participan las células NK? Glosario Dar una definición de los siguientes términos. Puede incluir en la lista otros términos nuevos para su vocabulario. Antígeno Microorganismos comensales Epitope Epitope Inmunógeno Epitope secuencial y conformacional Hapteno Opsoninas Barreras naturales Quimioquinas Paratope Bibliografía : Escriba los datos del /los libros o material utilizado citando: Autor/es del capítulo si corresponde (apellido e iniciales de cada uno separados por “;”). Año de publicación. Nº de Capítulo. Título completo del capítulo. Página inicial y final. Editor/es o autor del libro (apellido e iniciales ). Título completo del libro. Nº de Edición. Editorial, lugar de publicación. Ejemplo: Coffin, J.M. (1996). Capítulo 26. Retroviridae: the viruses and their replication, pp 763843. En: B.N. Fields; D.M. Knipe; P.M. Howley; et al. Fundamental Virology. 3ra edición. Lippincott – Raven Publishers, Philadelphia. En el caso de ser material encontrado en Internet citar: Nombre del sitio. Año de actualización. Título del artículo. Dirección completa del sitio.Ejemplo: ONUSIDA-OPS. 2004. Vigilancia del SIDA en las Américas. Disponible en http://www.unaids.org. 50 COMPONENTES HUMORALES DE LA INMUNIDAD INNATA 1) Complete el siguiente cuadro sobre el sistema del complemento: a)…………………………………………………………………………………… Vías de b)…………………………………………………………………………………….. Activación c)………………………………………………………………………………………. Funciones del a)……………………………………./………………………………………… C´/ Factores b) ……………………………………./………………………………………… involucrados c) ……………………………………./………………………………………… d) ……………………………………./………………………………………… 2) Teniendo en cuenta las distintas funciones del complemento, esquematice las células y moléculas que intervienen en los siguientes mecanismos: a) fagocitosis b) inflamación 3) Complete el siguiente cuadro teniendo en cuenta solo los interferones relacionados con la inmunidad innata: Tipo interferón de Nombre Principal célula que lo Función produce 4) ¿A qué se llama respuesta de fase aguda? ¿Qué componentes y mecanismos intervienen? ¿qué signos y síntomas se presentan a nivel sistémico? 5) ¿Cuál es la función de la respuesta inflamatoria? ¿Por qué se desencadena esta respuesta? ¿Cómo se relaciona con otros componentes de la respuesta inmunitaria? 6) ¿Cuáles son los signos característicos de la inflamación local y qué los provoca? 7) Indique cuáles son las citoquinas proinflamatorias. ¿Qué células las producen? ¿Sobre qué tejidos/órganos actúan y qué efecto tienen sobre los mismos? Glosario Respuesta de fase aguda Interferones de tipo I Interleuquinas proinflamatorias Virus Inflamación Proteínas de fase aguda Bibliografía utilizada: 51 ORGANIZACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO. CÉLULAS DE LA INMUNIDAD ADAPTATIVA. 1) Describa la organización celular del tejido linfoide en el ganglio linfático ¿Cómo circulan los linfocitos en este órgano? 2) Qué procesos se llevan a cabo en : a. zona paracortical del ganglio b. folículo secundario c. centro germinativo d. médula e. vénula de endotelio alto 3) ¿Qué rol tiene la bolsa de Fabricio y cuál es su equivalente en otras especies? 4) Complete el siguiente cuadro: Propiedad Órgano donde madura Distribución Circulación Receptores de Ag Tipo de Ag que reconocen Células diferenciadas Productos secretados Linfocitos B Linfocitos T 5) Ordene en una lista las siguientes células en relación con el desarrollo. Identifique al lado de cada célula el órgano en el cual se las encuentra y además si en el mismo hay contacto con antígeno o no. a. Linfocito B virgen b. Progenitor linfoide común c. Linfocito T citotóxico d. Plasmocito e. Célula troncal pluripotente f. Linfocito T virgen. 6) a)¿Qué componentes del sistema inmunitario se verán afectados en un animal cuya médula ósea es destruída por irradiación? b)¿Cuál sería el efecto de una timectomía (extirpación del timo) en un animal recién nacido? 7) Realice un esquema de los mecanismos que se llevan a cabo en el timo indicando las células y moléculas de superficie involucradas más importantes. ¿Cuál es la consecuencia de la falla de estos procesos? 8) Indique que tipo de selección interviene y su consecuencia sobre los LT inmaduros en los siguientes casos: a. No hay TCR b. TCR + MHC+ autoantígeno c. TCR + MHC de diferente haplotipo d. TCR + MHC +Ag X extraño 9) Realice un esquema de una molécula de inmunoglobulina e identifique sus diferentes componentes y regiones. Glosario Timocitos Selección positiva Selección negativa Selección clonal Haplotipo Centro germinal Células dendríticas Células dendríticas foliculares Vénulas de endotelio alto (HEV) LT autorreactivo Tolerancia Células M Órganos linfoides primarios Órganos linfoides secundarios 52 RECEPTORES DE ANTÍGENO. PROCESAMIENTO Y PRESENTACIÓN DE ANTÍGENO. 1) ¿A qué se denomina Ag? Explique las características que debe poseer una sustancia para comportarse como Ag. Cite ejemplos de sustancias antigénicas y no antigénicas para cada una de esas características. 2) ¿Qué diferencias existen en el reconocimiento del Ag por el LT y el LB? Describa los receptores involucrados en el reconocimiento. 3) ¿Qué camino debe seguir un Ag para ser reconocido y activar a un LT? Mencione células, receptores más importantes y moléculas que participan. Indique el lugar anatómico donde ocurre la activación del LT. 4) ¿Cuántos péptidos diferentes puede presentar una misma célula presentadora? ¿Cuántos epitopes diferentes puede reconocer un LB? ¿Y un LT? Explique 5) ¿Cómo el sistema inmunitario puede reconocer y responder específicamente a una gran variedad de antígenos (y al mismo tiempo preservar su identidad sin agredirse)? Glosario Antígeno Hapteno Repertorio TCR BCR CMH Restricción del CMH Coestimulación Especificidad Diversidad Bibliografía utilizada: 53 RESPUESTA INMUNITARIA HUMORAL 1) En la respuesta inmunitaria en relación a un antígeno T-dependiente (que es procesado por la vía endosómica): a) ¿Qué células son capaces de procesar y presentar este antígeno? b) ¿Cómo es reconocido este antígeno por los linfocitos B y T? Indique las moléculas y células involucradas. ¿Cómo son los epitopes reconocidos en cada caso (LB y LT)? c) ¿Qué subpoblación de linfocitos T interviene? ¿Cómo lo hace? d) ¿Cuáles son las consecuencias de la activación de los linfocitos B específicos? 2) La respuesta humoral frente a un antígeno T-dependiente evoluciona en 2 fases denominadas respuesta primaria y secundaria. a) ¿Por qué se llaman 1aria y 2aria? b) Realice una curva que represente los niveles e isotipos de anticuerpos a través del tiempo (días) para esas 2 respuestas c) Observando el gráfico indique cuál de las 2 respuestas: - tiene mayor duración - tiene menor nivel (es decir que alcanza una menor concentración de anticuerpos) - tiene a la IgG como isotipo predominante - tiene a la IgM como isotipo predominante - es más rápida Explique el por qué de cada una de esas características. 3) ¿Qué características tienen los antígenos T-independientes (TI)? Dé ejemplos. Esquematice cómo interacciona un antígeno TI con las células que intervienen y las características de la respuesta humoral que éste genera. Realice un cuadro señalando las diferencias con la respuesta humoral que genera un antígeno T-dependiente. 4) Identifique los mecanismos en los que los anticuerpos intervienen para eliminar o limitar la acción de un agente patógeno. Realice esquemas en los que se representen estas funciones biológicas de los anticuerpos. Glosario Antígenos T dependientes Antígenos T independientes Maduración (aumento) de la afinidad Procesamiento de Ag Inmunidad humoral Centro germinal Cooperación celular Cambio isotópico Selección clonal Clase o isotipo de Ig Moléculas coestimulatorias Bibliografia utilizada: 54 RESPUESTA INMUNITARIA CELULAR 1) Mencione las distintas subpoblaciones de linfocitos T y qué factores influencian su diferenciación 2) Elabore un cuadro indicando receptores celulares de las subpoblaciones de linfocitos T, vías de presentación que las activan, función y principal citoquina/s que liberan. 3) Identifique los elementos celulares y humorales que intervienen en la respuesta inmune frente a un antígeno que es procesado por la vía citosólica a. Describa el mecanismo de presentación del antígeno, indicando las moléculas de membrana que intervienen. b. ¿Cuáles son los requerimientos para la activación de la célula efectora? c. ¿Cuáles son las consecuencias de la activación de la célula efectora? ¿Cómo lleva a cabo la eliminación del antígeno? 4) Elabore un cuadro comparando las vías de activación y mecanismo de citotoxicidad de los linfocitos T citotóxicos y de las células NK (naturales asesinas). 5) ¿Cómo se diferencian la vía de citotoxicidad mediada por FAS de la mediada por perforinas? 6) ¿Qué mecanismos llevan a la activación de los macrófagos? ¿Cuáles son las consecuencias de su activación? Glosario Linfocitos Th1 Linfocitos Th2 Linfocitos Th0 Apoptosis FAS/ ligando de FAS Perforinas Citotoxicidad INF Macrófago activado citotoxinas Células naturales asesinas o NK Bibliografia utilizada 55 RESPUESTA INMUNE EN ACCIÓN 1) Cite al menos 2 ejemplos de BACTERIAS EXTRACELULARES, de importancia en Medicina Veterinaria, que sean productoras de EXOTOXINAS. Identifique sus principales factores de virulencia. 2) Ante la primera entrada de una bacteria productora de exotoxinas, identifique: a. Las barreras naturales debe vencer para establecer una infección b. Los principales mecanismos de la inmunidad innata que intervienen. ¿Cómo actúan estos mecanismos para la eliminación y neutralización del microorganismo? c. Los mecanismos de la inmunidad adquirida que son importantes para la eliminación de la infección y para la protección frente a una nueva invasión del mismo microorganismo. Explique brevemente como se inducen esos mecanismos, indicando cuál es la vía de procesamiento principal del antígeno, poblaciones y subpoblaciones celulares que intervienen y principales citoquinas liberadas. ¿Cómo actúan estos mecanismos para la eliminación y neutralización del microorganismo? 3) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideración BACTERIAS de vida INTRACELULAR FACULTATIVA de importancia en Medicina Veterinaria. 4) Conteste las preguntas 1 y 2, pero tomando en consideración un VIRUS. Con la información obtenida, complete el siguiente cuadro: Tipo de microorganismo Mecanismos Bacteria extracelular Bacteria intracelular toxigénica Mec. solubles efectores de la II celulares Virus Vía de procesamiento principal del Ag Principal subpoblación de LT colaborador que actúa Mec. Solubles efectores de la IA Celulares Glosario: Virus Endotoxina Endotoxina respuesta protectora mecanismos de evasión de la respuesta inmune Bibliografía utilizada: 56 INMUNOPREVENCIÓN 1) Complete el siguiente cuadro con los términos escritos en negrita: Tipo de inmunidad activa/pasiva/ natural/artificial Efectores involucrados inducidos/transferidos células/Ac Duración de la protección corta/larga Generación de memoria si/no Vacunación Sueroterapia Infección o enfermedad Transferencia de Ig vía placentaria Transferencia de Ig vía calostral 2) Indique en el siguiente cuadro las ventajas y desventajas del uso de vacunas convencionales vivas y muertas. Tipo de vacunas Ventajas Desventajas/riesgos Vivas/ atenuadas Muertas/inactivadas/inertes 3) ¿En qué tipo de vacunas deben usarse adyuvantes? ¿Cómo actúan estas sustancias sobre el sistema inmunitario? Cite los adyuvantes de mayor empleo en medicina veterinaria. 4) ¿Qué es una anavacuna/anacultivo/vacuna integral? 5) ¿Con qué propósito vacunaría una hembra gestante? ¿Qué tipo de vacuna utilizaría y en qué momento antes del parto lo haría? Fundamente sus respuestas. 6) ¿Cómo será la respuesta a una vacuna en la cual el Ag es un polisacárido de la cápsula de un microorganismo? ¿Cómo se denominan este tipo de antígenos? ¿Qué tipo de vacuna sería más adecuado si se quiere desarrollar una respuesta más eficiente y duradera contra ese Ag? 7) Ud. recibirá en clase un frasco de vacuna. En base al estudio del mismo complete este informe: Se trata de una vacuna: combinada o mixta monovalente / polivalente viva / inerte liofilizada / en suspensión o solución El contenido es monodosis / varias dosis (¿cuántas?) ¿Por qué vía se aplica? ocular / subcutánea / intramuscular./ oral/ intranasal ¿Contiene adyuvante? SI-NO ¿cuál? ¿Qué tipo de antígenos incluye? Somas bacterianos / somas virales / toxoides / lisados / otros ¿Hay indicaciones respecto de su conservación? Tiene etiqueta de aprobación oficial (SENASA). ¿Qué información hay en la misma? ¿A qué controles debió haberse sometido esta vacuna? Glosario: Bibliografía utilizada: 57 REGULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNITARIA 1) Describa en qué se fundamenta la tolerancia hacia los propios tejidos. 2) ¿Por qué están regulados los mecanismos de la inmunidad innata? 3) ¿Por qué la respuesta inmunitaria frente a un Ag determinado no aumenta indefinidamente? Explique. 4) Identificar los procesos (incluidos los de regulación) que ocurren en cada etapa de la respuesta inmune humoral (1-2-3). 2 1 3 5) ¿Por qué 2 animales pueden desarrollar una respuesta inmunitaria diferente frente a una misma vacuna? 6) Compare las siguientes curvas de respuesta frente a vacunas atenuadas (vivas) e inactivadas (muertas). ¿A qué se debe la diferencia? Relacione con las funciones de los adyuvantes. Rta. a vacuna inactivada 7) a) b) c) Rta. a vacuna atenuada Discuta cuáles componentes incluiría en vacunas que protejan contra: una potente exotoxina una bacteria de vida intracelular facultativa un virus 8) Discuta cómo debería ser el esquema de vacunación para proteger a un ternero contra enfermedades que podría presentar en sus primeras semanas de vida. ¿Vacunaría al ternero recién nacido? Justifique su respuesta. Glosario: Bibiografía utilizada: 58
