Tesis _versión pdf - Instituto de Investigaciones Biotecnológicas

Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y
Biotecnología
UNSAM. Universidad Nacional de San Martín
IIB-INTECH. Instituto de Investigaciones BiotecnológicasInstituto Tecnológico de Chascomús
Título: “Caracterización de la actividad β-xilosidasa en frutos
climatéricos y no-climatéricos. Análisis de su expresión y
regulación hormonal”
Nombre: Claudia A. Bustamante
Directores: Gustavo A. Martínez y Pedro M. Civello
Año: 2009
ÍNDICE
Contenido
Página
Índice
1
Abreviaturas
4
Neologismos y palabras tomadas del inglés
6
1. Resumen
8
2. Introducción general
10
2.1. Maduración de frutos carnosos
10
2.1.1. Regulación de la maduración
10
2.1.2. Actividad respiratoria
11
2.1.3. Cambios de color
11
2.1.4. Cambios de sabor
12
2.1.5. Aroma
12
2.1.6. Factores determinantes de la firmeza del fruto
13
2.2. Pared celular
13
2.2.1. Componentes estructurales de la pared celular
14
2.2.2. Enzimas y proteínas que modifican la pared celular
19
2.3. β-xilosidasas
23
3. Objetivos
25
3.1. Objetivo general
25
3.2. Objetivos particulares
25
3.2.1. Frutilla
25
3.2.2. Tomate
25
4. Materiales y métodos
27
4.1. Material vegetal
27
4.2. Disección de frutos
27
4.3. Búsqueda en una biblioteca de ADNc
27
4.4. Clonado del ADNc completo
28
4.5. Extracción de ADN genómico
28
4.6. Clonado de la región promotora
29
4.7. Secuenciación de ADN y análisis bioinformático
29
4.8. Extracción de ARN total de frutilla y northern blot
30
4.9. Extracción de ARN total de tomate y RT-PCR semicuantitativa
30
1
4.10. Preparación de las sondas
31
4.11. Medida de actividades enzimáticas
32
4.12. Expresión heteróloga
33
4.13. Tratamiento térmico
34
4.14. Producción del anticuerpo anti-FaXyl1
34
4.15. Purificación del anticuerpo anti-FaXyl1
34
4.16. Extracción de proteínas totales y western blot
35
4.17. Cromatografía de exclusión molecular en frutilla
35
4.18. Cromatografía de exclusión molecular en tomate
36
4.19. Medida de proteínas totales
36
4.20. Tratamientos con hormonas en frutilla
37
4.21. Tratamientos con hormonas en tomate
38
4.22. Contenido de antocianinas
38
4.23. Medidas de clorofilas
38
4.24. Análisis estadístico
39
APÉNDICE
41
5. Capítulo I: “Caracterización de la actividad β-xilosidasa en frutilla
42
(Fragaria x ananassa). Análisis de su expresión y regulación hormonal”
5.1. Introducción
43
5.1.1. El fruto de frutilla
43
5.1.2. Degradación de la pared celular en frutillas
44
5.1.3. Regulación hormonal en frutilla
46
5.2. Resultados
49
5.2.1. Clonado del ADNc completo de FaXyl1
49
5.2.2. Purificación de cuerpos de inclusión y obtención del anticuerpo
51
anti-FaXyl1
5.2.3. Actividad β-xilosidasa y expresión de FaXyl1 durante la
52
maduración
5.2.4. Análisis por cromatografía de exclusión molecular
55
5.2.5. Localización de la actividad enzimática y de FaXyl1
56
5.2.6. Actividad y estabilidad de la enzima recombinante
58
5.2.7. Clonado de la región promotora de FaXyl1
61
5.2.8. Efecto de hormonas sobre la expresión de FaXyl1 y la actividad β-
63
xilosidasa
5.2.8.1. Auxinas y giberelinas
64
5.2.8.2. Acido abscísico
66
2
5.2.8.3. Etileno
67
5.2.8.4. Oxido nítrico
69
5.2.8.5. Acido salicílico
70
5.3. Discusión
72
5.4. Conclusiones
82
6. Capítulo II: “Caracterización de la actividad β-xilosidasa en tomate
83
(Solanum Lycopersicum). Análisis de su expresión y regulación hormonal”
6.1. Introducción
84
6.1.1. El fruto de tomate
84
6.1.2. Degradación de la pared celular en tomate
85
6.1.3. Actividad β-xilosidasa en tomate
87
6.1.4. Regulación hormonal en tomate
88
6.1.5. Mutantes de tomate y línea ACC-sintasa antisentido
91
6.2. Resultados
94
6.2.1. Actividad β-xilosidasa durante la maduración
94
6.2.2. Expresión de LeXyl1 y LeXyl2 durante la maduración
95
6.2.3. Análisis por cromatografía de exclusión molecular
96
6.2.4. Efecto de hormonas sobre la actividad β-xilosidasa y la expresión
97
de LeXyl1 y LeXyl2
6.2.4.1. Etileno
97
6.2.4.2. Auxinas y giberelinas
97
6.2.4.3. Acido abscísico
99
6.3. Discusión
100
6.4. Conclusiones
105
7. Conclusión general
107
8. Referencias
109
3
ABREVIATURAS
1-MCP: 1-metilciclopropeno
32P-dATP:
desoxiadenosina trifosfato marcada con
32P
α-Af: α-arabinofuranosidasa
β-Gal: β-galactosidasa
β-Xil: β-xilosidasa
ABA: ácido abscísico
ACC: ácido 1-aminociclopropanocarboxílico
ACO: ACC-oxidasa
ACS: ACC-sintasa
ACSas: ACC-sintasa antisentido
ADN: ácido desoxirribonucleico
ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario
ARN: ácido ribonucleico
ARNasa: ribonucleasa
ARNm: ácido ribonucleico mensajero
BSA: albúmina sérica bovina
CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio
DEPC: dietil pirocarbonato
DO: densidad óptica
DPA: días post-antesis
EDTA: ácido etilendiamintetracético
EGasa: endoglucanasa
GA3: ácido giberélico
IAA: ácido 3-indol acético
IPTG: isopropil-tio-β-D-galactósido
NAA: ácido naftalén acético
PAL: fenilalanina amonio-liasa
PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction)
PG: poligalacturonasa
PL: pectato liasa
PME: pectin metilesterasa
PVP: polivinilpirrolidona
PVPP: polivinilpolipirrolidona
4
RT-PCR: transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (reverse
transcription and polimerase chain reaction)
SA: ácido salicílico
SAM: S-adenosil-L-metionina
SAR: resistencia sistémica adquirida
SDS: dodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
SNP: nitroprusiato de sodio
TCA: ácido tricloroacético
UV: ultravioleta
Xln: xilanasa
XTH: xiloglucano endotransglucosidasa/hidrolasa
5
NEOLOGISMOS Y PALABRAS TOMADAS DEL INGLÉS
Buffer: solución amortiguadora de pH, constituida por un par ácido-base
conjugados.
Kit: conjunto de piezas o instrumentos que sirven para realizar alguna función o
desarrollar alguna actividad.
Northern blot: técnica para detectar ARNm específicos en una mezcla.
Western blot: técnica para detectar proteínas específicas en una mezcla.
6
1. RESUMEN
7
1. RESUMEN
Las β-xilosidasas son exo-enzimas responsables de la hidrólisis de los
xilanos presentes en la pared celular, liberando residuos de β-D-xilosa. A pesar
del número creciente de trabajos relacionados con la degradación de la pared
celular en frutos, es muy escasa la información referente al metabolismo de
xilosa durante la maduración, tanto de frutos climatéricos como no-climatéricos.
En este trabajo de tesis, intentamos profundizar en el estudio del
metabolismo de los componentes de la pared celular que contienen xilosa
utilizando frutilla como modelo de fruto no-climatérico y tomate como modelo de
fruto climatérico.
En frutilla, aislamos un clon de ADNc que codifica para una β-xilosidasa
específica de fruto (FaXyl1) perteneciente a la familia 3 de las glicosil-hidrolasas.
FaXyl1
actuaría
en
la
matriz
extracelular
y
sería
procesada
post-
traduccionalmente como otras β-xilosidasas de plantas superiores. La proteína
codificada por FaXyl1 posee elevada estabilidad térmica y actividad β-xilosidasa
frente a sustratos artificiales. La comparación de variedades de firmeza
contrastante indica que habría una clara correlación entre la expresión, los
niveles de proteína y la actividad β-xilosidasa, y la velocidad de ablandamiento
del fruto. La expresión del gen estaría bajo la influencia de hormonas implicadas
en el proceso de ablandamiento del fruto. Los niveles de transcripto y proteína de
FaXyl1 serían regulados positivamente por ABA y negativamente por NAA, GA3 y
etileno. Si bien nuestros resultados sugieren un posible rol de FaXyl1 en el
ablandamiento del fruto, se requiere de trabajo adicional para poder establecer la
acción in vivo de la enzima.
En tomate, la actividad β-xilosidasa parece estar involucrada en los
cambios que se producen en la pared celular durante el crecimiento del fruto,
más que durante la maduración del mismo. Hasta el momento, se han clonado
dos genes que codifican para β-xilosidasa en tomate, LeXyl1 y LeXyl2. Ambas
isoenzimas podrían sufrir modificaciones post-traduccionales (procesamiento Cterminal) como ocurre con otras β-xilosidasas de plantas superiores, incluyendo
frutilla. Los transcriptos de LeXyl1 y LeXyl2 serían regulados de manera
diferencial durante el proceso de maduración del fruto. La expresión de ambas
isoenzimas estaría regulada positivamente por etileno, y negativamente por
auxinas y giberelinas, mientras que ABA regularía positivamente a LeXyl1 y no
tendría efecto sobre la expresión de LeXyl2.
8
2. INTRODUCCIÓN
GENERAL
9
2. INTRODUCCIÓN GENERAL
2.1. Maduración de frutos carnosos
En las plantas superiores, una vez ocurrida la polinización y fecundación
se produce el desarrollo de los frutos. Estos presentan una elevada diversidad en
cuanto a formas y tamaños dado que cada especie vegetal los desarrolla a partir
de distintas partes de la flor. De esta manera se pueden generar desde cápsulas
secas, que permiten la dispersión de semillas, hasta frutos carnosos que han
desarrollado colores brillantes y aromas complejos para atraer animales y
pájaros que facilitan la dispersión de sus semillas (Barry y Giovannoni, 2007).
Algunos de ellos, tales como tomate y uva, provienen del ovario, mientras que
otros, tales como frutilla, ananá y manzana, derivan del receptáculo o de la
expansión de los sépalos. El proceso de maduración está generalmente asociado
con
cambios
de
color,
alteraciones
en
el
metabolismo
de
azúcares,
ablandamiento del fruto y cambios en la textura, síntesis de compuestos
relacionados con el aroma, y aumento en la susceptibilidad al ataque por
patógenos. Los numerosos cambios organolépticos que sufren los frutos carnosos
durante la maduración los convierte en aceptables para su consumo, siendo la
modificación de la textura y el ablandamiento progresivo uno de los cambios más
notorios (Adams-Phillips y col., 2004a; Adams-Phillips y col., 2004b; Giovannoni,
2004).
2.1.1. Regulación de la maduración
Históricamente se ha clasificado a los frutos en climatéricos y noclimatéricos de acuerdo a la presencia o ausencia, respectivamente, de un
incremento en la producción de etileno y en la actividad respiratoria durante la
maduración. El aumento en la síntesis de etileno en los frutos climatéricos está
asociado con el incremento en la expresión de los genes que codifican para
enzimas involucradas en su síntesis (ACC-sintasa y ACC-oxidasa). Asimismo, el
etileno dispara la transcripción de numerosos genes asociados con el proceso de
maduración (Theologis y col., 1993). Sin embargo, a pesar de que el etileno es la
hormona central y principal en la regulación de la maduración de estos frutos,
existe un grupo de genes con regulación independiente de etileno (Alexander y
Grierson, 2002; Lelievre y col., 1997). La presencia de estos genes no
10
dependientes de etileno y el descubrimiento de factores de transcripción de tipo
MADS-box de características similares en frutos climatéricos y no-climatéricos
sugiere la existencia de mecanismos reguladores comunes de la maduración en
ambos tipos de frutos (Vrebalov y col., 2002). Además, el análisis de especies
mutantes con la maduración alterada, y de la expresión de genes asociados al
proceso de maduración sugiere la existencia de una compleja cascada de
regulación que aún no ha sido dilucidada completamente (Giovannoni, 2004).
La regulación de la maduración en frutos no-climatéricos es aún motivo de
controversias. La frutilla ha sido considerada como el modelo a utilizar en el
estudio de los frutos no-climatéricos. Durante mucho tiempo se ha considerado
que el etileno no tiene un rol central en la maduración de frutilla, a la vez que se
comprobó que las auxinas producidas en los aquenios reprimen la maduración
del receptáculo y que la disminución de su concentración activa dicho programa
(Given y col., 1988). Otros autores han sugerido que la disminución en la
concentración de auxinas y el aumento simultáneo de ácido abscísico (ABA) son
los factores determinantes de la maduración (Archbold y Dennis, 1984; Jiang y
Joyce, 2003). Sin embargo, el reciente clonado de genes que codifican para
receptores de etileno (Trainotti y col., 2005), el hallazgo de una pequeña
producción de etileno al inicio de la maduración (Iannetta y col., 2006) y el
retraso de algunos procesos de la maduración por acción del 1-metilciclopropeno
(1-MCP) (Tian y col., 2000) han llevado a cuestionar la afirmación de que el
etileno no tiene ningún rol en la maduración de frutilla.
2.1.2. Actividad respiratoria
Durante la maduración, los frutos climatéricos muestran un pico en la
actividad respiratoria (climaterio respiratorio), el cual está ausente en los frutos
no-climatéricos. Los principales sustratos respiratorios encontrados en el fruto
son los azúcares y los ácidos orgánicos. Ambos sustratos se localizan en la
vacuola y contribuyen al sabor final del fruto. Los azúcares más comunes son
fructosa, glucosa y sacarosa, y los ácidos orgánicos más relevantes, málico y
cítrico (Tucker, 1993).
2.1.3. Cambios de color
La maduración de los frutos involucra, en la mayoría de los casos, la
11
modificación del color externo e interno de los mismos, provocada por la
variación del contenido de pigmentos. Los principales pigmentos hallados en
diversos frutos son clorofilas, antocianinas y carotenoides. En algunos frutos, al
producirse
la
degradación
de
clorofilas
se
desenmascaran
pigmentos
preexistentes responsables del color del fruto maduro. Sin embargo, en la
mayoría de los casos la desaparición de clorofilas es acompañada de la
biosíntesis de otros pigmentos, usualmente carotenoides o antocianinas (Tucker,
1993).
Las antocianinas son compuestos flavonoides sintetizados mediante la vía
de los fenilpropanoides. Las mismas son hidrosolubles y se encuentran
localizadas en la vacuola de la célula vegetal (Timberlake, 1981), y pueden
adoptar diversos colores (desde el rojo al azul) según el pH del medio donde se
encuentran. La antocianina más abundante en frutilla es pelargonidin-3glucósido, aunque también han sido detectados pelargonidin-3-galactósido y
cianidin-3-glucósido (Van Buren, 1970).
Los carotenoides son compuestos terpenoides que se localizan en los
cromoplastos y que son responsables de los colores rojo, anaranjado y amarillo
de muchos frutos. Entre los carotenoides más frecuentes encontramos a βcaroteno y licopeno. En tomate, el carotenoide más abundante es el licopeno, el
cual forma cristales dentro de los cromoplastos (Tucker, 1993).
2.1.4. Cambios de sabor
Los azúcares y los ácidos orgánicos contribuyen principalmente al sabor
del fruto. En general, los niveles de ácidos orgánicos disminuyen durante la
maduración debido a que los mismos son utilizados como sustrato de la
respiración (Ulrich, 1970). Por el contrario, los niveles de azúcares dentro del
fruto aumentan debido a un incremento en la importación de azúcares desde la
planta o a la degradación de almidón dentro del fruto, dependiendo del tipo de
fruto y de si el mismo maduró ligado a la planta o separado de ella.
2.1.5. Aroma
Los compuestos volátiles son responsables del aroma característico de los
frutos. La naturaleza de estas sustancias es diversa e incluye alcoholes,
aldehídos, ésteres y muchos otros grupos de compuestos químicos (Nursten,
12
1970). El perfil de compuestos volátiles de un fruto es complejo. En frutilla se
han identificado más de 360 compuestos volátiles, siendo los ésteres los que más
contribuyen al aroma final del fruto (Menager y col., 2004).
2.1.6. Factores determinantes de la firmeza del fruto
El adecuado nivel de firmeza del fruto es un aspecto de calidad evaluado
por el consumidor, a la vez que representa uno de los principales factores que
determinan la vida post-cosecha del producto. La firmeza de los frutos está
condicionada por varios factores, siendo uno de los principales la rigidez
mecánica determinada por las paredes celulares (Harpster y col., 1997). La pared
celular vegetal está formada por una red de microfibrillas de celulosa inmersas
en una compleja matriz de pectinas y hemicelulosas (Brummell y Harpster,
2001). Durante la maduración, la acción combinada de diferentes proteínas y
enzimas hidrolíticas sobre los componentes de la pared celular produce una
disminución del contenido, solubilización y depolimerización de los mismos. La
disminución y relajación de esta barrera mecánica no solo disminuye la firmeza
del fruto sino que permite el ataque de los patógenos, particularmente en
estadios de madurez avanzados.
2.2. Pared celular
Las células vegetales se encuentran encapsuladas dentro de una compleja
y fibrosa pared cuyas propiedades son fundamentales para determinar la forma y
función de las células y tejidos vegetales. La pared celular actúa como un
exoesqueleto que controla la forma celular y permite que se desarrolle una alta
presión de turgencia. Además, participa en la adhesión, señalización celular,
defensa y numerosos procesos de crecimiento y diferenciación (Cosgrove, 1997).
Las paredes celulares se clasifican en primarias y secundarias. Las
paredes celulares primarias se forman en las células en crecimiento y se las
considera relativamente no especializadas y similares en arquitectura molecular
en todos los tipos celulares. Por el contrario, las paredes celulares secundarias se
forman luego de que el crecimiento celular ha cesado y pueden ser altamente
especializadas en estructura y composición (Taiz y Zeiger, 1998).
En la pared celular primaria, las microfibrillas de celulosa se encuentran
embebidas en una matriz amorfa altamente hidratada (Figura 1). La matriz está
13
formada por dos grupos de polisacáridos denominados hemicelulosas y pectinas,
más una pequeña cantidad de proteínas estructurales.
Figura 1. Diagrama esquemático de los principales componentes estructurales de la
pared celular primaria. RGI: ramnogalacturonano I. Adaptado de Taiz y Zeiger, 1998.
2.2.1. Componentes estructurales de la pared celular
La pared celular primaria está compuesta aproximadamente por un 25%
de celulosa, 25% de hemicelulosas, 35% de pectinas y entre 1 y 8% de proteínas
estructurales, sobre la base de peso seco. Sin embargo, estos valores pueden
sufrir grandes variaciones de acuerdo a la especie y tejido analizado. En frutos
carnosos, en general el contenido de pectinas puede ser mayor, llegando hasta
un 50% (Fischer, 1991).
La
celulosa
está
formada
por
cadenas
lineales
de
(1→4)-β-D-
glucopiranosa asociadas entre sí a través de uniones no-covalentes, dando lugar
a la formación de microfibrillas. Las microfibrillas poseen un grosor de 4 a 10 nm
y están organizadas en dominios altamente cristalinos unidos a regiones amorfas
menos organizadas (Figura 2). La celulosa posee una alta resistencia a los
14
esfuerzos de tensión, es insoluble, químicamente estable y relativamente
resistente al ataque enzimático (Cosgrove, 1997).
Figura 2. Modelo estructural de una microfibrilla de celulosa. La microfibrilla posee
regiones
altamente
cristalinas
unidas
a
regiones
menos
organizadas.
Algunas
hemicelulosas pueden quedar atrapadas dentro de la microfibrilla o estar unidas a su
superficie. Adaptado de Taiz y Zeiger, 1998.
Las hemicelulosas comprenden un grupo heterogéneo de polisacáridos
flexibles que se unen a la superficie de la celulosa a través de puentes de
hidrógeno (Figura 3). En la pared celular primaria de las dicotiledóneas, la
hemicelulosa más abundante es el xiloglucano, constituido por un polímero
lineal de (1→4)-β-D-glucopiranosa con cadenas laterales cortas conteniendo
xilosa, galactosa y, frecuentemente, una fucosa terminal (Figura 3 A) (Mc Neil y
15
col., 1984; Fry, 1989). Dado que los xiloglucanos son más largos que el espacio
entre las microfibrillas de celulosa, los mismos tienen el potencial de unirse a
dos o más microfibrillas, contribuyendo a su entrelazamiento. Dependiendo de la
etapa de desarrollo y de la especie, la fracción de hemicelulosas de la pared
también contiene otros polisacáridos importantes tales como los xilanos y
glucomananos.
(A) Xiloglucano
α- Fuc
1
→
2
β- Gal
1
→
α- Xil
1
α- Xil
1
2
α- Xil
1
→
→
→
6
6
6
-(1→4)-β- Glc -(1→4)-β- Glc -(1→4)-β- Glc -(1→4)-β- Glc -(1→4)-β- Glc -(1→4)-β- Glc -(1→4)-β-
(B) Xilanos
1
4-O-Me-β- GlcA
→
→
-(1→4)-β- Xil -(1→4)-β- Xil -(1→4)-β- Xil -(1→4)-β- Xil -(1→4)-β- Xil -(1→4)-β- Xil -(1→4)-β- Xil 2
2
1
α- Ara
(C) Glucomananos
-β- Glc -(1→4)-β- Man -(1→4)-β- Man -(1→4)-β- Glc -(1→4)-β- Man -(1→4)-β- Man-(1→4)-
Figura 3. Estructura de las hemicelulosas. (A) El xiloglucano está formado por una
cadena lineal de (1→4)-β-D-glucopiranosa con cadenas laterales conteniendo xilosa (Xil),
galactosa (Gal) y fucosa (Fuc). (B) Los xilanos están constituidos por una cadena lineal de
(1→4)-β-D-xilosa. Pueden tener también cadenas laterales de arabinosa (Ara), ácido 4-Ometilglucurónico (4-O-Me-β-GlcA), u otros azúcares. (C) Los glucomananos poseen una
cadena lineal que alterna un residuo de β-D-glucosa (Glc) con dos residuos de β-Dmanosa (Man).
16
Los xilanos están formados por una cadena lineal de (1→4)-β-D-xilosa
asociada a cadenas laterales de ácido 4-O-metilglucurónico y arabinosa, las
cuales
están
presentes
en
cantidades
variables
en
glucuronoxilanos
y
arabinoxilanos, respectivamente (Figura 3 B). Los glucomananos se encuentran
frecuentemente
en
las
paredes
celulares
secundarias,
especialmente
de
coníferas. Poseen una cadena lineal que alterna un residuo de β-D-glucosa con
dos residuos de β-D-manosa (Figura 3 C) (Taiz y Zeiger, 1998).
Las pectinas forman un gel en el cual la red celulosa-hemicelulosa está
embebida. Al igual que las hemicelulosas, las pectinas también constituyen un
grupo heterogéneo de polisacáridos que contienen característicamente azúcares
ácidos tales como los ácidos galacturónico y glucurónico (Figura 4). Algunas
pectinas contienen una estructura primaria relativamente simple tal como el
homogalacturonano (Figura 4 A), formado por un polímero lineal de ácido (1→4)α-galacturónico. El ramnogalacturonano I (RG I) (Figura 4 B) está formado por
un disacárido de ramnosa y ácido galacturónico que se repite, y cadenas
laterales
largas
de
arabinanos,
galactanos,
arabinogalactanos
y
homogalacturonano (Figura 4 C). Otras pectinas menos abundantes y altamente
complejas son los ramnogalacturonanos II (RG II), los cuales contienen al menos
diez azúcares diferentes y un patrón complicado de uniones (Darvill, 1978).
Las proteínas estructurales son clasificadas de acuerdo a su composición
predominante
de
aminoácidos
en
glicoproteínas
ricas
en
hidroxiprolina,
proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, etc. (Tabla 1). La mayoría de
estas proteínas están glicosiladas. Las mismas poseen estructuras primarias
altamente repetitivas y se convierten en insolubles durante la maduración celular
o en respuesta a heridas.
Tabla 1. Proteínas estructurales de la pared celular
Clase
% de carbohidratos
Localización
HRGP (glicoproteína rica en prolina)
~ 55
Floema, cámbium
PRP (proteína rica en prolina)
~ 0-20
Xilema, fibras, córtex
GRP (proteína rica en glicina)
0
Xilema
17
(A) Homogalacturonano
-α- GalA -(1→4)-α- GalA -(1→4)-α- GalA -(1→4)-α- GalA -(1→4)-α- GalA -(1→4)-α- GalA -(1→4)-
(B) Ramnogalacturonano I (RG I)
-α- GalA -(1→2)-α- Rha -(1→4)-α- GalA -(1→2)-α- Rha -(1→4)-α- GalA -(1→2)-α- Rha -(1→4)X
X
Cadenas laterales de arabinano y galactano
(C) Cadenas laterales en RGI
1- Arabinanos
1
α- Ara
1
α- Ara
→
→
→
-α- Ara -(1→5)-α- Ara -(1→5)-α- Ara -(1→5)-α- Ara -(1→5)-α- Ara -(1→5)-α- Ara -(1→5)-α- Ara 3
3
2
1
α- Ara
2- Arabinogalactano I
-β- Gal -(1→4)-β- Gal -(1→4)-β- Gal -(1→4)-β- Gal -(1→4)-β- Gal -(1→4)-β- Gal -(1→4)-β- Gal →
3
→
3
1
α- Ara -(1→5)-α- Ara -(1→5)-α- Ara
1
α- Ara
Figura 4. Estructura de las pectinas más comunes. (A) El homogalacturonano consiste
de una cadena lineal de ácido (1→4)-α-galacturónico (GalA). Los residuos carboxilo se
encuentran con frecuencia metil-esterificados. (B) El ramnogalacturonano I (RG I) es una
pectina muy grande y heterogénea, compuesta de una cadena lineal de ácido (1→4)-αgalacturónico (GalA) y (1→2)-α-ramnosa (Rha). Las cadenas laterales, de longitud muy
variable, están unidas a los residuos de ramnosa y están compuestas principalmente de
arabinanos
y
galactanos.
Los
residuos
de
ácido
galacturónico
se
encuentran
frecuentemente metil-esterificados. (C) Ejemplos de cadenas laterales en RG1. 1:
Arabinanos: son moléculas altamente ramificadas compuestas principalmente de
arabinosa (Ara). 2: Arabinogalactano I: tiene una cadena lineal de residuos de galactosa
(Gal) y cadenas laterales conteniendo arabinosa (Ara).
18
Las
proteínas
estructurales
varían
en
cuanto
a
su
abundancia
dependiendo del tipo celular, el estadio de desarrollo y la estimulación previa de
la planta (heridas, ataque de patógenos, etc.). La pared celular contiene además
otro tipo de proteínas estructurales denominadas proteínas con arabinogalactano
(AGP), las cuales son solubles en agua, están altamente glicosiladas y podrían
participar en diversos procesos del desarrollo (Pennell y Roberts, 1990).
2.2.2. Enzimas y proteínas que modifican la pared celular.
En los últimos años, se han estudiado en profundidad numerosas enzimas
y proteínas que pueden actuar sobre polímeros de la pared celular de los frutos,
en búsqueda de aquellas que pudieren considerarse claves en el proceso de
ablandamiento (Brummell y Harpster, 2001; Giovannoni, 2001; Buchanan y col.,
2000; Lashbrook, 2005).
Entre
las
enzimas
que
depolimerizan
pectinas
y
favorecen
su
solubilización se incluyen:
- Poligalacturonasas (PG): son enzimas que catalizan la hidrólisis de
uniones galacturónido y pueden ser del tipo endo (EC 3.2.1.15) o exo (EC
3.2.1.67). Aunque ambos tipos de enzima se encuentran en fruto, sólo las
enzimas de tipo endo son específicas de la maduración (Hadfield y Bennett,
1998). Los homogalacturonanos son los principales sustratos de PG. Los mismos
son secretados a la pared celular con un alto porcentaje de metil-esterificación en
el C-6, por lo que deben ser de-esterificados antes de convertirse en sustrato
para las poligalacturonasas (Jarvis, 1984; Carpita y Gilbeaut, 1993).
- Pectin metilesterasas (PME): los poligalacturonanos son incorporados a
la pared celular con un elevado porcentaje de metil-esterificación. Las PME (EC
3.1.1.11) de-esterifican los poliurónidos removiendo los grupos metilo de la
posición C-6 de los residuos de ácido galacturónico presentes en pectinas de alto
peso molecular. La de-metilación cambia el pH y la carga en la pared celular,
permite el agregado de poliurónidos a través de puentes de calcio y torna
susceptibles a los poliurónidos frente a la acción de las poligalacturonasas
(Carpita y Gilbeaut, 1993; Pressey y Avants, 1982).
19
- Pectato liasas (PL): las PLs (EC 4.2.2.2) catalizan la ruptura de pectinas
de-esterificadas a través de un mecanismo de β-eliminación. Las mismas
requieren la presencia de iones calcio para ejercer su acción y producen
oligosacáridos con residuos de ácido galacturónico no-saturado en el extremo noreductor de los mismos (Carpita y Gilbeaut, 1993).
- β-Galactosidasas (β-Gal): uno de los mayores cambios que se producen
en la pared celular durante la maduración de los frutos es la pérdida de residuos
de galactosa (Gross, 1984). Este proceso sería catalizado por exo-β-Dgalactosidasas (EC 3.2.1.23), las cuales remueven residuos de β-D-galactosa a
partir del extremo no-reductor de β-D-galactósidos. Los posibles sustratos in vivo
de estas enzimas son los (1→4)-β-galactanos, presentes en las fracciones
pécticas, y residuos β-D-galactosilo presentes en las cadenas laterales del
xiloglucano (Balasubramaniam y col., 2005).
-
α-Arabinofuranosidasas
(α-Af):
las
α-L-arabinofuranosidasas
(EC
3.2.1.55) actúan sobre diferentes fracciones pécticas y hemicelulósicas liberando
residuos de arabinosa a partir del extremo no-reductor (Tateishi y col., 1996). La
previa acción de esta enzima sería necesaria para la hidrólisis completa de
algunos polímeros de la pared, tales como los arabinoxilanos, por xilanasas y βxilosidasas. En pera japonesa, se demostró que la expresión de un gen
codificante para una α-L-arabinofuranosidasa es específica de fruto y que se
incrementa durante la maduración (Tateishi y col., 2005).
A pesar de que PG y PME están claramente asociadas al catabolismo de
pectinas, trabajos realizados en líneas transgénicas antisentido de tomate con
actividad reducida o nula de PG y PME han mostrado que la expresión de ambas
enzimas no es necesaria ni suficiente para inducir el ablandamiento (Brummell y
Harpster, 2001). Sin embargo, dado que en general los frutos de distintas
especies presentan características distintivas, el efecto de un tipo de enzima
puede ser altamente dependiente de la especie en estudio, por lo que las
generalizaciones a otras especies pueden no ser válidas (Buchanan y col., 2000).
Otras pectinasas, como PL de frutilla (Jiménez-Bermúdez y col., 2002) y β-Dgalactosidasa II de tomate (Smith y col., 2002) juegan papeles críticos en la
pérdida de firmeza de esos frutos, aunque probablemente no constituyen la
única causa del ablandamiento de los mismos.
20
Entre las enzimas responsables del metabolismo de las hemicelulosas se
pueden mencionar:
- Endo-β-1,4-glucanasas (EGasa): estas enzimas catalizan la hidrólisis de
enlaces internos de cadenas de glucanos unidos por enlaces β-1,4 adyacentes a
residuos no-sustituidos. En la pared celular, se piensa que el sustrato natural de
EGasa (EC 3.2.1.4) es el xiloglucano (Palomer y col., 2006).
- Xiloglucano endotransglicosidasas (XET): estas enzimas hidrolizan las
uniones internas de las cadenas de (1→4)-β-D-glucano del xiloglucano y
transfieren el nuevo extremo reductor formado a la posición C-4 de la unidad de
glucosa en el extremo no-reductor de otro polímero u oligosacárido de
xiloglucano, con retención de la configuración anomérica del enlace glucosídico.
Las XETs (EC 2.4.1.207) son altamente específicas del xiloglucano tanto como
sustrato dador como aceptor, aunque el grado de sustitución de la subunidad
aceptora afecta fuertemente la eficiencia de la reacción (Fry y col., 1992).
- Xilanasas (Xln): son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4glicosídicos entre residuos de D-xilosa adyacentes en la cadena principal de los
xilanos para producir xilooligosacáridos. La mayoría de las Xln (EC 3.2.1.8)
hidrolizan la cadena principal en regiones donde el sustrato no está sustituido
(Ronen y col., 1991).
- β-Xilosidasas (β-Xil): las β-Xil (EC 3.2.1.37) liberan residuos de xilosa a
partir del extremo no-reductor de los xilooligosacáridos producidos por Xln,
conservando la configuración β (Ronen y col., 1991).
- Endo-β-mananasas: son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4 entre
residuos de
manosa presentes
en la cadena
principal
de
mananos
y
heteromananos no-sustituidos (Mo y Bewley, 2003). En tomate, la actividad
mananasa ha sido implicada en la degradación de la pared celular del
endosperma, rica en mananos, durante la germinación de las semillas (Mo y
Bewley, 2002).
- β-Galactosidasas (β-Gal): como se describió previamente, las βgalactosidasas liberan residuos de galactosa a partir de polímeros pécticos, así
21
como también hemicelulósicos.
- α-Arabinofuranosidasas (α-Af): como fue mencionado anteriormente, las
α-L-arabinofuranosidasas actúan sobre diferentes polímeros, tanto pécticos como
hemicelulósicos, liberando residuos de arabinosa.
En tomate, la expresión de al menos dos EGasas, LeCel1 y LeCel2,
se
incrementa con la maduración. Sin embargo, la supresión de cada uno de estos
genes no produce diferencias detectables en la firmeza del fruto (Brummell y col.,
1999; Lashbrook y col., 1998). Si bien la actividad XET ha sido detectada en
tomate, su rol en el ablandamiento del fruto no ha sido claramente establecido.
De hecho, la supresión antisentido del gen LeXETB1, relacionado con la
maduración en tomate, no produjo cambios en el ablandamiento del fruto con
respecto a plantas control (Brummell y Harpster, 2001). La completa hidrólisis de
los xilanos requiere la acción de endo-β-1,4-xilanasas y β-xilosidasas. Estas
enzimas que degradan polisacáridos ricos en xilosa pueden estar involucradas en
el proceso de maduración, permitiendo no sólo la solubilización o movilización de
polímeros hemicelulósicos de la pared celular, sino su reorganización en otros
polímeros de menor peso molecular que podrían participar como sustratos en
otros caminos metabólicos (Buchanan y col., 2000). Las xilanasas y las βxilosidasas no han sido estudiadas en detalle en frutos, aunque ambas
actividades han sido registradas en paltas maduras (Ronen y col., 1991). La
presencia de β-xilosidasa ha sido además verificada en tomate (Itai y col., 2003),
pera japonesa (Itai y col., 1999), durazno (Bounaris y Niavis, 1992), aceituna
(Bolaños y col., 1995) y frutilla (Martínez y col., 2004).
Las expansinas son proteínas de la pared celular sin actividad hidrolítica
conocida, que poseen la capacidad de provocar la extensión de paredes celulares
aisladas (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). Se postula que las mismas actúan
en la interfase celulosa-hemicelulosa debilitando las uniones no-covalentes
(principalmente puentes de hidrógeno) establecidas entre ambos polímeros
(McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). En frutos, se ha propuesto la participación
de las mismas en el proceso de ablandamiento (Brummell y col., 1999) y se ha
descrito el incremento de la expresión de expansinas específicas durante la
maduración de numerosos frutos, incluidos tomate (Rose y col., 1997) y frutilla
(Civello y col., 1999).
22
2.3. β-Xilosidasas
La estructura química de los arabinoxilanos y los xilanos de la pared
celular está sujeta a modificaciones durante el crecimiento y el desarrollo de las
plantas. Particularmente, se ha descrito la modificación de estos componentes
durante la germinación de las semillas, la abscisión de órganos y el desarrollo y
maduración de los frutos (Beldman y col., 1996; Cleemput y col., 1995). Los
xilanos consisten de una cadena lineal de (1→4)-β-D-xilopiranosa asociada a
cadenas laterales de ácido 4-O-metilglucurónico y arabinosa que están presentes
en cantidades variables en glucuronoxilanos y arabinoxilanos, respectivamente
(Carpita y McCann, 2000). La degradación de los xilanos, cuya cantidad es
variable entre distintas especies, ocurre a través de la acción coordinada de una
variedad de enzimas, incluyendo las endo-β-1,4-xilanasas (EC 3.2.1.8), las
cuales hidrolizan los enlaces β-1,4-glicosídicos entre residuos de D-xilosa
adyacentes en la cadena principal para producir xilooligosacáridos, y las βxilosidasas (EC 3.2.1.37), que hidrolizan xilooligosacáridos para liberar xilosa
(Cleemput y col., 1997).
Si bien los genes que codifican para β-xilosidasas han sido extensivamente
estudiados en hongos y bacterias (Margolles-Clark y col., 1996; Pérez-González y
col., 1998; van Peij y col., 1997), es muy escasa la información disponible de
estas enzimas en plantas. Recientemente, se clonaron genes de pera y frutilla,
específicos de fruto, que codificarían para una de ellas (Itai y col., 1999; Martínez
y col., 2004). Asimismo, en Arabidopsis thaliana se ha demostrado que un gen
putativo
de
β-xilosidasa
(AtBXL1)
está
fuertemente
involucrado
en
el
metabolismo de hemicelulosas de la pared celular secundaria y en el desarrollo
de la planta (Goujon y col., 2003).
23
3. OBJETIVOS
24
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
El objetivo general del trabajo es caracterizar el patrón de expresión de la
enzima β-xilosidasa durante la maduración de un fruto no-climatérico (frutilla) y
de otro climatérico (tomate). Esta enzima está involucrada en el catabolismo de
componentes de la pared celular que contienen xilosa, y ha sido poco estudiada,
particularmente en frutos.
3.2. Objetivos particulares
3.2.1. Frutilla
▪ Obtener el ADNc completo de FaXyl1 y realizar la búsqueda de nuevos
genes de β-xilosidasa.
▪ Expresar FaXyl1 en E. coli y obtener anticuerpos.
▪ Caracterizar la expresión de FaXyl1 durante la maduración de
variedades de frutilla con firmeza contrastante.
▪ Estudiar el efecto de distintos reguladores de crecimiento sobre la
expresión de FaXyl1.
3.2.2. Tomate
▪ Analizar la actividad β-xilosidasa y los niveles de ARNm de LeXyl1 y
LeXyl2 durante la maduración de variedades de tomate silvestres, mutantes y
antisentido para la enzima ACC-sintasa.
▪ Estudiar el efecto del etileno y de otras hormonas sobre la actividad βxilosidasa y los niveles de ARNm de LeXyl1 y LeXyl2.
25
4. MATERIALES
Y
MÉTODOS
26
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Material vegetal
Se utilizaron frutillas (Fragaria x ananassa Duch.) de las variedades
Camarosa
y
Toyonoka
cuyos
frutos
poseen
tasas
de
ablandamiento
contrastantes. Los estadios de madurez se clasificaron de acuerdo al tamaño y
coloración externa del fruto en: verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco
(B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R), 75% rojo (75% R) y 100% rojo (100% R).
Se trabajó con tomates (Solanum lycopersicum) de la variedad Rutgers,
silvestre y las líneas mutantes rin, nor y Nr las cuales tienen un patrón de
maduración alterado; asimismo, se utilizó la variedad VF36, silvestre y una línea
antisentido para la ACC-sintasa de modo de poseer frutos con producción
reducida de etileno. Los estadios de madurez analizados fueron verde maduro
(VM) y rojo maduro (M), correspondientes a 48 y 56 días post-antesis,
respectivamente.
Los frutos se cosecharon y usaron inmediatamente o se congelaron en N2 (l)
y se guardaron a -20 ºC hasta su empleo.
4.2. Disección de frutos de frutilla
Se obtuvieron discos de la zona ecuatorial de frutos de Toyonoka en
estadio VG, B, 50% R y 100% R, y los mismos se dividieron en dos zonas
diferentes (externa e interna). La zona externa se obtuvo separando el tercio
externo del receptáculo, mientras que la zona interna se definió como los dos
tercios centrales remanentes (Vicente y col., 2005). Las muestras se congelaron
en N2 (l) y se guardaron a -20 ºC hasta su empleo.
4.3. Búsqueda en una biblioteca de ADNc de frutilla
Utilizando como sonda un fragmento de FaXyl1 marcado con α-32P-dATP
(ver punto 4.10) se inició la búsqueda del ADNc completo de FaXyl1, así como
también de nuevos genes de β-xilosidasa, en una biblioteca de ADNc de frutos
maduros (Fragaria x ananassa Duch., cv Chandler). Para ello, se obtuvieron 5 x
105 placas de lisis las cuales se transfirieron a membranas de nailon Hybond-N+
(Amersham-Pharmacia). Las membranas se incubaron durante 4 h a 42 ºC con
27
una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 5X, Denhardt’s 1X, SDS
0,2% p/v y ADN de esperma de salmón 150 μg ml-1 y luego se hibridaron
durante toda la noche a 42 ºC con el agregado de la sonda marcada. Las
membranas se lavaron con 25 ml de SSC 1X y SDS 0,1% p/v una vez a 42 ºC y
dos veces a 50 ºC durante 30 min, y se expusieron a una placa radiográfica (XOMAT AR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -80 ºC. Las placas positivas
se purificaron por medio de dos rondas adicionales de plaqueo. Finalmente, se
provocó la liberación in vivo de los fagémidos de acuerdo a las instrucciones del
fabricante (Stratagene) y los clones se secuenciaron mediante el servicio de
secuenciación
del
Instituto
de
Investigaciones
Biotecnológicas
(UNSAM,
Argentina).
4.4. Clonado del ADNc completo de FaXyl1
La obtención del extremo 5’ de FaXyl1 se llevó a cabo utilizando el sistema
BD SmartTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) a partir de ARN de frutos de
Toyonoka 75% R. La amplificación de dicho extremo se llevó a cabo utilizando los
oligonucleótidos GSP1 y NGSP1, específicos de FaXyl1, el oligonucleótido
universal UPM provisto en el kit (Tabla 2, pág. 40) y BD Advantage 2 Polymerase
Mix (Clontech), de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. El producto de
PCR se purificó a partir de un gel de agarosa 0,8% p/v por medio de columnas
GFX (Amersham Biosciences), se clonó en el plásmido pGEM-T easy vector
(Promega) y se secuenció.
4.5. Extracción de ADN genómico de frutilla
Un gramo de hojas jóvenes de la variedad Toyonoka se trituraron en N2 (l).
Se agregaron 10 ml del siguiente medio de extracción precalentado a 65 ºC:
CTAB 3% p/v, PVP 2% p/v, Tris-HCl 1 M (pH 8,0), EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M y βmercaptoetanol 2% v/v. Se incubó a 65 ºC durante 30 min mezclando por
inversión cada 5 min. A 750 µl de esta mezcla se le agregó igual volumen de
cloroformo:alcohol isoamílico en relación 24:1 y se mezcló por inversión. Se
centrifugó a 16000 x g durante 10 min a temperatura ambiente y se colectó el
sobrenadante. Se agregó igual volumen de isopropanol y se incubó a -20 ºC
durante 2 h. Luego de ese periodo, se centrifugó a 16000 x g por 10 min y se
secó el precipitado. El mismo se disolvió en 100 µl de H2Od estéril a 65 ºC y se
28
agregó 1 µl de ARNasa A (usb) 10 mg ml-1. Se incubó a 37 ºC y luego de 15 min,
la reacción se detuvo con el agregado de 100 µl de cloroformo:alcohol isoamílico
en relación 24:1. Se centrifugó a 16000 x g durante 10 min y el ADN se precipitó
durante 2 h a -20 ºC con el agregado de 2,5 volúmenes de etanol. Se centrifugó a
16000 x g por 20 min, se secó el precipitado y se disolvió en 35 µl de H2Od a 65
ºC. La integridad de las muestras de ADN genómico se verificó en un gel de
agarosa 0,7% p/v.
4.6. Clonado de la región promotora de FaXyl1
A partir de ADN genómico de frutilla, se aisló un fragmento perteneciente a
la región promotora de FaXyl1 utilizando el sistema BD Genome Walker
Universal Kit (Clontech). La amplificación del fragmento se realizó utilizando
oligonucleótidos específicos de FaXyl1 (X1 y X2), oligonucleótidos específicos de
secuencias que actúan como adaptadores (AP1 y AP2) y la enzima Platinum Taq
DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen), de acuerdo a las instrucciones del
fabricante (Tabla 2, pág. 40). El producto de PCR se purificó a partir de un gel de
agarosa 1,5% p/v por medio de columnas GFX (Amersham Biosciences), se clonó
en el plásmido TOPO TA Cloning Vector (Invitrogen) y se secuenció.
4.7. Secuenciación de ADN y análisis bioinformático
La secuenciación se realizó con un secuenciador Applied Biosystems ABI
377 (Servicio de secuenciación del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas,
UNSAM, Argentina).
Los análisis de secuencia se llevaron a cabo usando los programas EditSeq y Megalign (DNASTAR 4.05). Los dominios glicosil-hidrolasa se identificaron
en la base de datos GenBank. La predicción de la localización subcelular y el
péptido señal de la proteína FaXyl1 se realizó mediante la utilización de los
programas
PSORT
(http://psort.nibb.ac.jp/form.html)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP).
glicosilación
se
localizaron
Los
mediante
sitios
el
y
SIGNALP
potenciales
programa
de
N-
NetNGlyc
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGlyc). La región promotora de FaXyl1 se
analizó
mediante
la
utilización
de
los
programas
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)
PLANTCARE
y
PLACE
(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/).
29
4.8. Extracción de ARN total de frutilla y análisis mediante northern blot
Se extrajo ARN total de frutilla utilizando el método del borato en caliente
(Wan y Wilkins, 1994). Cada muestra de ARN (10 μg) se analizó por electroforesis
en geles desnaturalizantes de agarosa 1,1% p/v y formaldehído 1% v/v. Los geles
se tiñeron con bromuro de etidio para evaluar la cantidad de ARN a través del
nivel de fluorescencia de cada calle frente a la exposición a luz UV. La intensidad
de las bandas correspondientes a los ARN ribosomales se utilizó como control de
carga.
Luego de la corrida electroforética, el ARN se transfirió por capilaridad a
membranas de nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia) durante toda la noche
usando una solución SSC 20X. Al día siguiente, el ARN se fijó a la membrana por
incubación durante 2 h a 80 ºC, seguida por la exposición a radiación UV (UVStratalinker Modelo 1800; Stratagene). Las membranas se incubaron con 25 ml
de una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 5X, Denhardt’s 1X, SDS
0,2% p/v y ADN de esperma de salmón 150 μg ml-1, y posteriormente se
hibridaron toda la noche a 42 ºC con el agregado de la sonda marcada
radioactivamente (ver punto 4.10). Las membranas se lavaron con 25 ml de SSC
1X y SDS 0,1% p/v una vez a 42 ºC y dos veces a 50 ºC durante 30 min y se
expusieron a una placa radiográfica (X-OMAT AR, Kodak) con una pantalla
intensificadora a -80 ºC. En algunos casos, las membranas se hibridaron con
una sonda para detectar ARNr 18S de modo de establecer un control de carga.
4.9. Extracción de ARN total de tomate y RT-PCR semicuantitativa
Se extrajo ARN total de tomate utilizando el protocolo adaptado por Chang
y col. (1993). La integridad de las muestras de ARN se verificó por electroforesis
en geles desnaturalizantes de agarosa 1% p/v y formaldehído 1% v/v.
La síntesis de la primera hebra de ADNc se llevó a cabo usando la
siguiente mezcla de reacción: 2 μg de ARN, 330 pmoles de oligonuclétidos al azar
(Biodynamics) y H2Od tratada con DEPC en cantidad necesaria para un volumen
final de 18,3 μl. La mezcla se desnaturalizó a 70 ºC durante 10 min y se enfrió
rápidamente en hielo. Posteriormente, se agregaron los demás componentes: 200
U de transcriptasa reversa M-MLV (Promega), buffer de reacción de la enzima 1X
y dNTPs 30 μM en un volumen final de 25 μl. La reacción se realizó a 37 ºC
durante 90 min y luego se incubó a 90 ºC durante 10 min para inactivar la
30
enzima. El ADNc obtenido se guardó a -20 ºC hasta su utilización.
Los productos de ADNc se amplificaron por PCR usando 1 μl del producto
de transcripción reversa como molde, 2,5 μl de buffer de reacción de la enzima,
MgCl2 1,5 mM, dNTPs 50 μM, 10 pmoles de oligonucleótidos y 0,625 U de Taq
polimerasa (Fermentas) en un volumen final de 25 μl. Para LeXyl1 se usaron los
oligonucleótidos TF1 y TR1 (Tabla 2, pág. 40) y el siguiente programa de PCR: un
ciclo de 5 min a 94 ºC; 16, 22, 28 y 34 ciclos de 45 s a 94 ºC, 45 s a 62 ºC y 1
min a 72 ºC; un ciclo a 72 ºC durante 7 min. En el caso de LeXyl2, se utilizaron
los oligonucleótidos TF2 y TR2 (Tabla 2, pág. 40) y el programa de PCR consistió
en: un ciclo de 5 min a 94 ºC; 16, 22, 28 y 34 ciclos de 45 s a 94 ºC, 45 s a 56 ºC
y 1 min a 72 ºC; un ciclo a 72 ºC durante 7 min. Para corregir diferencias de
carga se utilizó ARNr 17S, el cual se amplificó con los oligonucleótidos Rib5 y
Rib3 (Tabla 2, pág. 40) y el siguiente programa de PCR: un ciclo de 5 min a 94
ºC; 15, 20, 25, 30 y 35 ciclos de 45 s a 94 ºC, 45 s a 60 ºC y 1 min a 72 ºC; un
ciclo a 72 ºC por 7 min.
Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa
1% p/v, se desnaturalizaron con una solución NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante
30 min, se neutralizaron durante 30 min en una solución conteniendo NaCl 1,5
M, Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5), y se transfirieron por capilaridad a una membrana de
nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia) durante toda la noche utilizando una
solución SSC 20X. El ADN se fijó por irradiación UV usando un UV-Stratalinker
Modelo 1800 (Stratagene). Las membranas se incubaron con 25 ml de una
solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 5X, Denhardt’s 1X, SDS 0,2%
p/v y ADN de esperma de salmón 150 μg ml-1 y posteriormente se hibridaron
toda la noche a 42 ºC con el agregado de la sonda marcada radioactivamente (ver
punto 4.10). Las membranas se lavaron con 25 ml de SSC 1X y SDS 0,1% p/v
una vez a 42 ºC y dos veces a 50 ºC durante 30 min y se expusieron a una placa
radiográfica (X-OMAT AR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -80 ºC.
La intensidad de las bandas se analizó con el programa Gel-Pro Analyzer
(Media Cybernetics, Maryland, EEUU) para determinar la zona de linealidad de
los productos de amplificación. Se eligieron los ciclos 28 para LeXyl1 y LeXyl2 y
25 para ARNr 17S, respectivamente.
4.10. Preparación de las sondas
La sonda para detectar FaXyl1 se preparó a partir del clon de ADNc
31
(Número de acceso: AY486104). Para ello, se procedió a la digestión del mismo
con la enzima EcoRI (Promega), dando lugar a un fragmento de 736 pb que se
purificó a partir de un gel de agarosa 1,2% p/v por medio de columnas GFX
(Amersham Biosciences); el fragmento purificado se utilizó como molde para
sintetizar la sonda radiactiva mediante la técnica de cebado al azar (“random
priming”). A tal fin, se usaron 100 ng de ADN molde (previamente calentado a
100 ºC durante 5 min y enfriado en hielo por 5 min), 5 μl de buffer de reacción
de la enzima 10X, dCTP 20 μM, dGTP 20 μM, dTTP 20 μM, 558 pmoles de
oligonucleótidos al azar (Biodynamics), 2 μl de BSA acetilada 10 mg ml-1, 5 U de
fragmento Klenow (Promega) y 4 μl de α-32P-dATP 10 mCi ml-1 en un volumen
final de 50 μl. La reacción se llevó a cabo a 37 ºC durante 1 h. Luego de este
periodo, la sonda radioactiva se separó del α-32P-dATP no incorporado usando
una columna de Sephadex G-50 equilibrada con buffer TE. Finalmente, la sonda
marcada radioactivamente se desnaturalizó a 100 ºC durante 5 min y se enfrió
rápidamente en hielo por 5 min antes de ser agregada al tubo de hibridación
correspondiente.
En el caso de FaCel1, la sonda se preparó de modo similar a partir de un
fragmento de 318 pb obtenido por PCR de acuerdo a Harpster y col. (1998).
Las sondas para detectar LeXyl1 y LeXyl2 se prepararon a partir de los
clones de ADNc cedidos gentilmente por Itai (Itai y col., 2003). La sonda LeXyl1
se preparó por amplificación de un fragmento de 423 pb utilizando los
oligonucleótidos TF1 y TR1, y la sonda LeXyl2 se obtuvo por amplificación de un
fragmento de 296 pb usando los oligonucleótidos TF2 y TR2 (Tabla 2, pág. 40).
Dichos fragmentos se purificaron y utilizaron como molde en la producción de
una sonda marcada con
32P.
La sonda para detectar ARNr 18S se preparó por amplificación de un
fragmento de 193 pb a partir del clon de frutilla (Número de acceso: X15590) y
los oligonucleótidos Rib5 y Rib3 (Tabla 2, pág. 40).
La sonda para detectar ARNr 17S se preparó por amplificación de un
fragmento de 191 pb a partir del ADNc obtenido en el punto 4.9 y los
oligonucleótidos Rib5 y Rib3 (Tabla 2, pág. 40).
4.11. Medida de actividades enzimáticas
Diez gramos de tejido (frutos de frutilla o tejido de pericarpio de tomate) se
homogeneizaron con 30 ml de buffer NaAc/HAc 0,05 M, NaCl 1 M, PVPP 1% p/v,
32
pH 6,0. La suspensión obtenida se agitó durante 2 h a 4 ºC y luego se centrifugó
30 min a 9000 x g. Se aisló el sobrenadante y se utilizó para determinar
actividad β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y/o α-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55).
Para medir la actividad β-xilosidasa, se preparó la siguiente mezcla de
reacción: p-nitrofenil-β-D-xilopiranósido 5 mM, NaCl 1 mM, NaAc/HAc 0,05 M
(pH 6,0) y 750 μl de extracto en un volumen total de 1500 μl. La cinética de
reacción se llevó a cabo a 55 y 37 ºC para frutilla y tomate, respectivamente,
tomando alícuotas de 150 μl a distintos tiempos. La reacción se detuvo con la
adición de 500 μl de Trizma base 1% p/v.
La actividad α-arabinofuranosidasa se determinó a partir de la siguiente
mezcla
de
reacción: p-nitrofenil-α-L-arabinofuranósido
3
mM,
citrato
de
sodio/ácido cítrico 0,15 M (pH 4,5) y 250 μl de extracto en un volumen total de
550 μl. Se incubó a 37 ºC y se tomaron alícuotas de 130 μl a distintos tiempos.
La reacción se detuvo con el agregado de 150 μl de Na2CO3.
La cantidad de p-nitrofenol liberada en cada reacción se determinó
midiendo la absorbancia a 410 nm. La curva de calibración se construyó con
cantidades variables de p-nitrofenol 1 mM. Los resultados se expresaron como
nmoles de p-nitrofenol liberados por minuto.
4.12. Expresión heteróloga de FaXyl1
Los ADNc truncado y completo de FaXyl1 se amplificaron con los
oligonucleótidos
XILFtBam
y
XILRtXho,
y
XILFcBam
y
XILRcXho,
respectivamente (Tabla 2, pág. 40). Los productos obtenidos se cortaron con las
enzimas de restricción BamHI y XhoI (Promega) y se clonaron en el vector pET24a(+)
(Novagen)
cortado
previamente
con
las
mismas
enzimas.
Las
construcciones se transfirieron a células de E. coli, cepa BL21 (DE3) (Stratagene).
Las células transformadas se crecieron hasta una DO600=0,5 y se indujo la
producción de las proteínas recombinantes con el agregado de IPTG 1 mM. Luego
de 0, 1, 3 y 6 h a 37 ºC, las células se colectaron por centrifugación a 8000 x g
durante 10 min. Las mismas se resuspendieron en buffer PBS 1X y se agregó
lisozima (Sigma) 2 mg ml-1. Luego de 1 h a 25 ºC, las células se sonicaron (130
Watt Ultrasonic Processor, Vibra Cell, Sonics & Materials UK; amplitud 30%, 3 x
15 s) y las muestras se clarificaron por centrifugación a 8000 x g durante 20 min
a 4 ºC. El precipitado obtenido luego de 3 h de inducción de la proteína truncada
se utilizó para purificar cuerpos de inclusión, mientras que los sobrenadantes se
33
sometieron a tratamiento térmico y a medidas de actividad β-xilosidasa y αarabinofuranosidasa, de modo similar a lo descrito en 4.11.
4.13. Tratamiento térmico
Los sobrenadantes de los lisados bacterianos obtenidos luego de la
inducción de las proteínas truncada y completa con IPTG durante 3 h se
incubaron durante 10, 20 y 30 min a 50, 55 y 60 ºC. Luego de cada tratamiento,
se centrifugó a 9000 x g por 20 min. Se descartó el precipitado y se midió
actividad β-xilosidasa en el sobrenadante. Se realizaron tres experimentos de
inducción independientes y las medidas de actividad se llevaron a cabo por
duplicado para cada tiempo y temperatura de incubación. Los resultados de las
medidas de actividad enzimática se expresan como la media ± desviación
estándar.
4.14. Producción del anticuerpo anti-FaXyl1
La producción de FaXyl1 truncada en E. coli dio lugar a la formación de
cuerpos de inclusión. La proteína truncada recombinante se purificó a partir de
los mismos utilizando el protocolo de Marston (1986) y se usó en la producción
del anticuerpo anti-FaXyl1 en conejo de acuerdo al régimen de inmunización
descrito por Catty (1988).
4.15. Purificación del anticuerpo anti-FaXyl1
La proteína truncada recombinante, purificada a partir de los cuerpos de
inclusión, se sembró en ocho pocillos (10 μg de proteína por pocillo) y se analizó
mediante SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida 12% (Laemmli, 1970). A
continuación, se realizó la transferencia de la proteína a membranas de
nitrocelulosa
(Amersham-Pharmacia)
utilizando
una
cuba
de
electro-
transferencia (Mini-Protean II; BioRad) y el buffer Tris-HCl 25 mM, glicina 192
mM, SDS 0,1% p/v, pH 8,3. La membrana conteniendo la proteína recombinante
se bloqueó con TBS 1X y BSA 5% p/v durante 1 h. Luego de ese período, se
realizaron tres lavados con TBS 1X durante 15 min y se agregó 400 µl de suero.
Después de 1 h de incubación, se recuperó el suero y se lavó la membrana con
TBS 1X durante 15 min. Para eluir el anticuerpo anti-FaXyl1, la membrana se
34
lavó tres veces con glicina 25 mM (pH 3,0) durante 5 min, conservando luego de
cada periodo la solución de lavado remanente. Posteriormente, se lavó una vez
con TBS 1X durante 15 min y se procedió al segundo paso de elución. Para ello,
se realizaron tres lavados con Tris-HCl 25 mM (pH 10,0) durante 5 min. Se
juntaron todas las fracciones de lavado y la mezcla resultante se liofilizó durante
toda la noche. El producto final, conteniendo el anticuerpo anti-FaXyl1
purificado, se disolvió en 100 µl de H2Od.
4.16. Extracción de proteínas totales y western blot
Tres gramos de frutillas se homogeneizaron con 9 ml de Tris-HCl 50 mM
(pH 7,0), SDS 2% p/v, β-mercaptoetanol 2% v/v, EDTA 1 mM, sacarosa 5% p/v y
PVPP 1% p/v. La suspensión obtenida se agitó durante 40 min a 4 ºC y se
centrifugó a 9000 x g durante 30 min a 4 ºC. Se colectó el sobrenadante, se
agregó 0,1 volúmenes de TCA 100% p/v y se dejó la mezcla a 4 ºC durante 30
min para provocar la precipitación de las proteínas. Se centrifugó a 9000 x g
durante 5 min, se lavó el precipitado con acetona 80% v/v, se dejó evaporar la
acetona a temperatura ambiente y se disolvió en NaCl 0,1 M y SDS 1% p/v.
Alícuotas de extractos conteniendo 10 μg de proteína se analizaron por
SDS-PAGE
en
geles
de
poliacrilamida
12%
(Laemmli,
1970)
y
se
electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham-Pharmacia), como
se describió en el punto 4.15. La inmunodetección se realizó usando un kit
comercial (ECL Western botting analysis system; Amersham-Pharmacia) y una
dilución 1:1000 del anticuerpo anti-FaXyl1 de Fragaria x ananassa.
4.17. Cromatografía de exclusión molecular en frutilla
Aproximadamente 10 g de tejido de fruto, proveniente de las variedades
Camarosa y Toyonoka en distintos estadios de desarrollo y maduración, se
homogeneizaron con 3 volúmenes de Tris-HCl 50 mM (pH 7,0), SDS 2% p/v, βmercaptoetanol 2% v/v, EDTA 1 mM, sacarosa 5% p/v y PVPP 1% p/v. La
suspensión se agitó durante 40 min a 4 ºC, se centrifugó a 9000 x g por 30 min,
y el sobrenadante se concentró por precipitación con sulfato de amonio. El
(NH4)2SO4 sólido se agregó lentamente hasta alcanzar un 45% de saturación.
Luego de 1 h de suave agitación, se centrifugó a 9000 x g durante 30 min. Se
descartó el precipitado y se llevó el sobrenadante a un 85% de saturación con el
35
agregado de (NH4)2SO4 sólido. Se incubó toda la noche a 4 ºC y posteriormente se
centrifugó a 9000 x g por 30 min. El precipitado se disolvió en NaAc/HAc 50 mM
(pH 6,0) y NaCl 1 M, y se dializó contra la misma solución toda la noche a 4 ºC.
Un volumen de 1,6 ml del extracto proteico resultante se fraccionó en una
columna (40 cm x 1,6 cm) de Sephacryl S-100 (Amersham-Pharmacia) preequilibrada con una solución NaAc/HAc 50 mM (pH 6,0) y NaCl 1 M. La elución
se realizó con la misma solución a una velocidad de flujo de 0,4 ml min-1. Se
colectaron fracciones de 0,8 ml, y 0,75 ml de las mismas se utilizaron para medir
actividad β-xilosidasa.
4.18. Cromatografía de exclusión molecular en tomate
Diez gramos de tejido de pericarpio de tomate, proveniente de las
variedades VF36 (silvestre y antisentido para la ACC-sintasa) y Rutgers (silvestre
y las líneas mutantes rin, nor y NR) en estadio VM y M, se homogeneizaron con
30 ml de NaAc/HAc 0,05 M (pH 6,0), NaCl 1 M, β-mercaptoetanol 5 mM y PVPP
1,5% p/v. Luego de agitar durante 30 min a 4 ºC, se centrifugó a 9000 x g
durante 30 min y se concentró el sobrenadante por precipitación con sulfato de
amonio. Se agregó lentamente (NH4)2SO4 sólido hasta alcanzar un 45% de
saturación. Luego de 1 h de suave agitación, se centrifugó a 9000 x g durante 30
min. Se descartó el precipitado y se llevó el sobrenandante a un 85% de
saturación con el agregado de la droga sólida. Se incubó toda la noche a 4 ºC y
posteriormente se centrifugó a 9000 x g durante 30 min. El precipitado se
disolvió en NaAc/HAc 50 mM (pH 6,0) y NaCl 1 M, y se dializó contra la misma
solución toda la noche a 4 ºC. Un volumen de 1,6 ml del extracto proteico
resultante se fraccionó en una columna (40 cm x 1,6 cm) de Sephacryl S-100
(Amersham-Pharmacia) pre-equilibrada con una solución NaAc/HAc 50 mM (pH
6,0) y NaCl 1 M. La elución se realizó con la misma solución a una velocidad de
flujo de 0,4 ml min-1. Se colectaron fracciones de 0,8 ml, y 0,75 ml de las mismas
se utilizaron para medir actividad β-xilosidasa.
4.19. Medida de proteínas totales
La concentración de proteínas totales se determinó por el método de Lowry
(Potty, 1969). Se utilizó albúmina bovina para realizar la curva de calibración.
36
4.20. Tratamientos con hormonas en frutilla
En los tratamientos con NAA, GA3, ABA, etefón, 1-MCP y SNP se utilizaron
al menos 10 frutos de la variedad Camarosa en estadio blanco. Para el
tratamiento con SNP también se usaron frutos 75% R. En el caso de
tratamientos con ácido salicílico (SA), se usaron frutos de la variedad Toyonoka.
Para todos los tratamientos se emplearon frutos de tamaño similar y con
ausencia de daño físico. Los pedúnculos se cortaron a una longitud uniforme de
3 cm y se colocaron en tubos eppendorff de 1,5 ml en contacto con la solución
correspondiente. Los tratamientos con NAA, GA3 y ABA se realizaron por
absorción a través del pedúnculo; los tratamientos con etefón, SA y SNP se
llevaron a cabo por contacto de los frutos con soluciones de las hormonas, y el
tratamiento con 1-MCP se realizó por incubación en una atmósfera conteniendo
el inhibidor en estado gaseoso. Para los tratamientos con NAA y GA3, los frutos
se incubaron con NAA 1 mM y GA3 1 mM durante 3 d a 20 ºC, respectivamente.
Los frutos control se mantuvieron en contacto con H2Od. Para estudiar el efecto
de auxinas endógenas, se eliminaron los aquenios en una mitad del fruto,
dejando la otra mitad intacta como control, y los mismos se incubaron durante 3
d a 20 ºC con el pedúnculo sumergido en H2Od. Durante el tratamiento con ABA,
los frutos se incubaron con una solución acuosa de ABA 1 mM con 2% v/v de
etanol por 3 d a 20 ºC. Los frutos control se incubaron con etanol 2% v/v. En el
caso del tratamiento con etefón, los frutos se sumergieron por 5 min en una
solución acuosa conteniendo etefón 2 mM, Tween 0,02% v/v y etanol 1% v/v. Los
controles se llevaron a cabo sumergiendo los frutos en una solución de Tween
0,02% v/v y etanol 1% v/v. El tratamiento con 1-MCP se llevó a cabo incubando
los frutos con 1-MCP 1 ppm (5,44 mg del compuesto en un recipiente de 80 l; la
liberación del compuesto gaseoso se realizó mediante el agregado de 10 ml de
H2Od). El tratamiento se realizó durante 10 h a 20 ºC, mientras que los frutos
control se incubaron en las mismas condiciones en ausencia del inhibidor. Para
el tratamiento con SA, los frutos se sumergieron durante 5 min en SA 1 mM
mientras que los controles respectivos se sumergieron en H 2Od. El tratamiento
con SNP (agente dador de NO) se realizó sumergiendo los frutos en SNP 5 µM y
10 μM durante 2 h, utilizando un tratamiento similar con H2Od como control.
Luego de los tratamientos con etefón, 1-MCP, SA y SNP, los frutos se incubaron
durante 2 d a 20 ºC con el pedúnculo sumergido en H2Od para evitar la
deshidratación. Finalmente, se removió el cáliz y el pedúnculo de los frutos y los
37
mismos se congelaron en N2 (l) y se guardaron a -80 ºC.
4.21. Tratamientos con hormonas en tomate
Se utilizó el sistema de discos de pericarpio de tomate descrito por
Campbell y col. (1990). Tomates de la variedad VF36 en estadio VM se
esterilizaron superficialmente durante 10 min en hipoclorito de sodio 1% v/v, se
lavaron en H2Od estéril y se secaron en el flujo laminar donde se realizó el resto
de las operaciones. Se prepararon discos de 13 mm de diámetro y 6 mm de
espesor a partir de tejido de pericarpio. Los mismos se lavaron en H2Od estéril y
se secaron sobre papel de filtro estéril durante 1 min. Los discos se mezclaron al
azar y se colocaron en placas de cultivo. Utilizando una micropipeta, se
distribuyeron sobre cada disco 10 µl de cada una de las soluciones de hormonas
y los discos se incubaron durante 2 d a 20 ºC. Para los tratamientos con NAA y
GA3, los discos se incubaron con soluciones 0,1 mM de cada una de las
hormonas, usando H2O como control. Para estudiar el efecto de ABA, los discos
se incubaron en una solución acuosa de ABA 0,1 mM en etanol 2% v/v. Los
frutos control se incubaron con etanol 2% v/v. Los tratamientos con etefón se
realizaron incubando los discos con una solución de etefón 100 ppm, Tween
0,02% v/v, etanol 1% v/v. Los frutos control se llevaron a cabo incubando los
discos con Tween 0,02% v/v, etanol 1% v/v. Después de cada tratamiento, los
discos se congelaron en N2 (l) y se guardaron a -80 ºC.
4.22. Contenido de antocianinas
Frutillas congeladas se trituraron en presencia de N2
(l).
Se tomó
aproximadamente 0,3 g de tejido triturado y se agregó 3 ml de HCl-metanol 1%
v/v. Se incubó durante 10 min a 0 ºC y se centrifugó a 1500 x g durante 10 min
a 4 ºC. Se separó el sobrenadante y se midió la absorbancia a 515 nm. La
cantidad de antocianinas se expresó como nmoles de pelargonidina-3-glucósido
por gramo de fruto, usando un Emolar= 36.000 M-1 cm-1 (Woodward, 1972). Las
medidas se realizaron por cuadriplicado para cada tratamiento analizado.
4.23. Medida de clorofilas
Se utilizó el protocolo basado en Inskeep y Bloom (1985). Para ello, los
38
discos de tomate se trituraron en N2 (l) y 0,5 g del tejido triturado se incubaron en
presencia de 3 ml de dimetilformamida toda la noche a 4 ºC. La suspensión
resultante se clarificó por centrifugación y se midió la absorbancia a 647 y 664,5
nm. El contenido de clorofila total se expresó en mg l-1, usando la siguiente
relación: Clorofila total= 17,90 x A647 + 8,08 x A664,5. Las medidas se realizaron
por cuadriplicado para cada tratamiento analizado.
4.24. Análisis estadístico
Los datos del contenido de pigmentos y la actividad β-xilosidasa se
analizaron por medio del test t de Student con un nivel de confianza de 0,05.
39
Tabla 2. Secuencias de oligonucleótidos.
Nombre
Secuencia
GSP1
5’-ATCGCTTCTGCCGCCGCTTCCTC-3’
NGSP1
5’-GATTGAAGGAAGCGGCGGTGGTGATG-3’
UPM
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
X1
5’-CTTCTCCTGCAGTGTCAGCCGTCCGAT-3’
X2
5’-GACGCGCATGTACCAGATTAAACAACA-3’
AP1
5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’
AP2
5’-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3’
TF1
5’-TTTGCCTGCCCTGTGTCTC-3’
TR1
5’-TGAAAGAAGCAGCAGTGAG-3’
TF2
5’-AGCCACACTGTTTTGTTGTTC-3’
TR2
5’-TCCCTTTTCCCTTTTGAG-3’
Rib5
5’-ACCGTAGTAATTCTAGAGCT-3’
Rib3
5’-CCACTATCCTACCATCGAAA-3’
XILFtBam
5’-AAAGGATCCCACGAGTGGAAGCTC-3’
XILRtBam
5’-ACGCTCGAGCTGATCTAATTTCTC-3’
XILFcBam
5’-TTTGGATCCCCACCCTTTGCGTG-3’
XILRcXho
5’-TTGCTCGAGGTGATGCTCCAGAT-3’
40
APÉNDICE
- Denhardt’s 50X
Ficoll 1% p/v
PVP 1% p/v
BSA 1% p/v
- PBS 1X
NaCl 137 mM
KCl 2,7 mM
NaH2PO4 10 mM
KH2PO4 2 mM
pH 7,4
- SSC 20X
Citrato de sodio 0,3 M
NaCl 3 M
pH 7,0
- SSPE 20X
NaH2PO4 0,2 M
NaCl 3 M
EDTA 20 mM
pH 7,4
- TBS
Tris-HCl 20 mM
NaCl 137 mM
pH 7,6
- TE
Tris-HCl 10 mM
EDTA 1 mM
pH 8,0
41
5. CAPÍTULO I
“Caracterización de la actividad β-xilosidasa en
frutilla (Fragaria x ananassa). Análisis de su
expresión y regulación hormonal”
42
5.1. INTRODUCCIÓN
5.1.1. El fruto de frutilla
Desde el punto de vista botánico, un fruto verdadero es el órgano
proveniente de la transformación del tejido ovárico de la flor, conteniendo en su
interior a la semilla desarrollada a partir del óvulo. Si se tiene en cuenta
estrictamente esta definición, la frutilla (Fragaria x ananassa, Duch.) constituye
un “fruto falso”, dado que la mayor parte de la misma proviene del desarrollo del
receptáculo y no de las paredes del ovario (Perkins-Veazie, 1995). Los frutos
verdaderos son los aquenios, ubicados en gran número en la parte externa del
receptáculo, al cual se encuentran ligados mediante conexiones vasculares
(Figura 5).
hv
m
a
a
m
Figura 5. Sección transversal de frutos de frutilla en estadios verde y maduro. Se
observa como los haces vasculares (hv) conectan los aquenios (a) con el interior del
receptáculo o médula (m).
El incremento en el tamaño del fruto se debe a una combinación del
aumento en el número de células y una mayor expansión celular. La división
celular se detiene a los 7 días de la caída del pétalo (Knee y col., 1977) y a los 15
días post-antesis (Cheng y Breen, 1992). Como resultado, la expansión celular
contribuye en un 90% al crecimiento del fruto post-antesis (Harvis, 1943).
El desarrollo de los aquenios se produce con anterioridad al crecimiento
final del receptáculo (Thompson, 1963, 1969). Con la maduración del embrión,
se incrementa la velocidad de crecimiento del receptáculo y se inicia la
43
maduración global del fruto. Las fases de desarrollo del fruto usualmente se
clasifican de acuerdo al tamaño y color externo del fruto en: verde pequeño,
verde grande, blanco, 25% rojo, 50% rojo, 75% rojo y 100% rojo (Figura 6). El
fruto alcanza su máximo peso, longitud y diámetro en el estadio 100% rojo
(Huber, 1984).
VP
VG
B
25% R
50% R
75% R
100% R
Figura 6. Los estadios de desarrollo y maduración de frutilla se clasifican en: verde
pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R), 75%
rojo (75% R) y 100% rojo (100% R).
Durante el proceso de maduración, se produce la acumulación de sólidos
solubles (principalmente azúcares) y de compuestos relacionados con el aroma y
el sabor, disminuye la acidez titulable, cambia la composición de pigmentos
(degradación de clorofila y acumulación de antocianinas) y se observan
modificaciones en la textura del fruto (Perkins-Veazie, 1995).
En los últimos años, se ha puesto mucha atención sobre varios aspectos
del crecimiento y la maduración de frutilla. Siendo la firmeza uno de los
principales factores determinantes de la calidad del fruto, se ha prestado
particular atención al estudio de las enzimas que degradan la pared celular dado
que las mismas serían responsables de modificar la textura del fruto durante la
maduración.
5.1.2. Degradación de la pared celular en frutillas
La frutilla se ha convertido en el sistema modelo más estudiado dentro de
los frutos no-climatéricos con alta tasa de ablandamiento. El fruto presenta una
maduración acelerada, lo cual facilita el ataque de patógenos y determina una
44
vida comercial en post-cosecha muy breve. En este fruto se ha descrito un
número importante de enzimas y proteínas que intervienen en el catabolismo de
la pared celular, así como la expresión de sus respectivos genes (Goulao y
Oliveira, 2008).
Respecto al metabolismo de pectinas, se ha detectado un importante
incremento en la solubilidad de las mismas durante la maduración (Rosli y col.,
2004), si bien el grado de depolimerización alcanzado sería dependiente de la
variedad de fruto en estudio y de la fracción de pectina analizada (Nogata y col.,
1996; Rosli y col., 2004). Nogata y col. (1996) sugirieron que el aumento de la
solubilidad de las pectinas durante la maduración se debe a la hidrólisis de las
cadenas laterales presentes, lo cual ha sido posteriormente sustentado por la
observación de que el contenido de galactosa y arabinosa unidas a pectinas
disminuye a medida que avanza la maduración (Redgwell y col., 1997; Koh y
Melton, 2002). Se clonaron y caracterizaron genes codificantes para β-Gals,
aunque sólo uno de ellos se expresa preferentemente en frutos maduros
(Trainotti y col., 2001). La arabinosa es uno de los azúcares simples que más se
elimina de la pared celular durante la maduración de frutillas (Koh y Melton,
2002). Recientemente, se clonaron tres genes codificantes para α-Afs que se
expresan activamente durante el desarrollo y la maduración de frutilla (Rosli y
col., 2009). En otros frutos, la solubilización de pectinas ha sido atribuida
principalmente a reacciones enzimáticas que conllevan a su depolimerización. En
el caso de frutillas, se clonaron genes que codifican para PG (Redondo-Nevado y
col., 2001; Villarreal y col., 2008), PL (Jiménez-Bermúdez y col., 2002) y PME
(Castillejo y col., 2004), cuya expresión se incrementa durante la maduración. En
variedades de frutilla con distinta velocidad de ablandamiento se observó un
patrón de expresión diferencial para dos transcriptos relacionados con PG, que
provendrían aparentemente de un mismo gen a través de un mecanismo de
“splicing” alternativo (Villarreal y col., comunicación personal). Uno de ellos,
FaPG1, se expresa preferentemente en la variedad más blanda, mientras que el
otro, T-PG, presenta mayores niveles de transcripto en las variedades de mayor
firmeza. Dado que T-PG daría lugar a la producción de una proteína truncada e
inactiva, se propuso que la expresión diferencial de ambos genes contribuiría a
las diferencias observadas en la velocidad de ablandamiento de los frutos entre
variedades (Villarreal y col., 2008). En el caso de pectato liasa (PL), plantas de
frutilla transgénicas con expresión de PL reducida presentaron un significativo
retraso en el ablandamiento del fruto, lo cual sugiere que el metabolismo de las
45
pectinas es un factor importante en este proceso (Jiménez-Bermúdez y col.,
2002).
En este fruto se ha descrito también un importante número de expansinas
(siete en total), de las cuales tres de ellas son específicas de fruto (Civello y col.,
1999; Harrison y col., 2001) y se expresan con mayor intensidad en variedades
con una elevada velocidad de ablandamiento (Dotto y col., 2006).
La maduración de frutilla está también asociada a una significativa
reducción en el contenido de hemicelulosas (Koh y Melton, 2002; Rosli y col.,
2004). Varios genes que codifican para EGasas, específicas de fruto, incrementan
su expresión durante la maduración (Harpster y col., 1998; Llop-Tous y col.,
1999; Trainotti y col., 1999; Woolley y col., 2001), lo cual apoya su posible
participación en la degradación del xiloglucano. Sin embargo, líneas transgénicas
de frutilla con expresión reducida de EGasa no presentaron retraso en el
ablandamiento (Woolley y col., 2001; Palomer y col., 2006). Además de los
xiloglucanos, las plantas dicotiledóneas contienen cantidades reducidas de otros
polímeros hemicelulósicos, tales como los β-1,4-xilanos. Aunque la cantidad de
xilanos no ha sido determinada directamente en la pared celular de los frutos de
frutilla, se ha reportado una elevada relación xilosa:glucosa en la fracción
hemicelulósica (Huber, 1984; Redgwell y col., 1997; Koh y Melton, 2002),
sugiriendo la presencia de polímeros conteniendo xilosa. Dentro del grupo de
enzimas que participan en la degradación de los xilanos, encontramos a las
xilanasas y a las β-xilosidasas, cuya actividad enzimática ha sido reportada en
frutos de frutilla (Rosli y col., 2007; Martínez y col., 2004).
5.1.3. Regulación hormonal en frutilla
El proceso de maduración de frutos se halla bajo el control de una
compleja regulación hormonal. Diversos reguladores del crecimiento influyen
acelerando o retardando la maduración de distintos frutos.
Durante mucho tiempo, los frutos de frutilla se clasificaron como noclimatéricos dado que no exhiben un aumento en la respiración, ni un pico en la
producción de etileno durante la maduración (Balogh y col., 2005). Sin embargo,
estudios recientes han puesto en duda este concepto (Ianetta y col., 2006). Si
bien se ha detectado producción de etileno durante la maduración de frutilla, el
rol del mismo en este proceso no ha sido claramente establecido (Tian y col.,
2000). Las frutillas pueden madurar sin la aplicación de etileno exógeno; sin
46
embargo, la aplicación de etileno exógeno estimula el desarrollo de color y el
ablandamiento del fruto (Wills y Kim, 1995; Tian y col., 2000). Recientemente,
Trainotti y col. (2005) clonaron y caracterizaron varios genes involucrados en el
metabolismo del etileno y sugirieron un posible rol de la hormona en el proceso
de maduración de frutilla.
Por el contrario, es ampliamente aceptada la acción de las auxinas
(principalmente ácido 3-indol acético, IAA) producidas en los aquenios (fruto
verdadero) como reguladores del crecimiento y la maduración del receptáculo,
siendo estas fitohormonas claves en ambos procesos (Given y col., 1988). Las
auxinas estimulan la expansión del receptáculo durante el desarrollo del fruto, y
más tarde inhiben la maduración (Perkins-Veazie, 1995). La hipótesis actual es
que la disminución en el nivel de las auxinas, a medida que el fruto madura,
estimula la expresión de genes relacionados con este proceso (Manning, 1994,
1998). En los aquenios, se detectan auxinas libres a los 4 días post-antesis,
mientras que en el receptáculo, solo se detectan pequeñas cantidades 11 días
post-antesis (Archbold y Dennis, 1984). Antes del estadio B, se observa un pico
de producción en ambos tejidos, disminuyendo rápidamente en el receptáculo y
gradualmente en los aquenios hasta que el fruto alcanza el estadio 100% R.
Estudios previos sobre la fisiología de la maduración de frutilla indicaron
que el ácido giberélico (GA3) (Martínez y col., 1994), el ácido abscísico (ABA)
(Jiang y Joyce, 2003), el ácido salicílico (SA) (Babalar y col., 2007) y el óxido
nítrico (NO) (Zhu y Zhou, 2007) también podrían modular la maduración de estos
frutos.
En frutilla, se detectó un pico de contenido de giberelina 7 días postantesis, siendo mayor el contenido de la hormona en los aquenios que en el
receptáculo (Lis y col., 1978). En general, los niveles de giberelinas son bajos en
ambos tejidos, disminuyendo aún más a medida que avanza la maduración. En
trabajos previos, Martínez y col. (1994) analizaron el efecto producido por la
aplicación exógena de distintas concentraciones de GA3 sobre discos de tejido y
frutillas enteras en distintos estadios de madurez. Se observó que el tratamiento
de discos de frutos en los estadios VG, B y 25% R con GA3 0,5 mM provoca una
disminución en la actividad respiratoria respecto a los discos controles, y que la
aplicación de GA3 1 mM a frutos enteros en los estadios VG y B provoca el retraso
de la acumulación de antocianinas y la degradación de clorofilas. Estos
resultados sugieren que las giberelinas producirían un retraso generalizado del
proceso de maduración en frutillas.
47
El ácido abscísico (ABA) estimula la maduración de frutos climatéricos y
no-climatéricos (Vendrell, 1985). Durante la maduración de frutilla, el ABA se
acumula en el receptáculo y especialmente en los aquenios (Archbold y Dennis,
1984). La máxima concentración de ABA en los aquenios fue detectada en el
estadio 100% R, en tanto que en el receptáculo se detectó un pico de actividad
durante la caída del pétalo (Archbold y Dennis, 1984). El tratamiento de frutillas
con ABA, no sólo estimula el desarrollo de color y el ablandamiento del fruto,
sino que también incrementa la producción de etileno (Jiang y Joyce, 2003).
El ácido salicílico (SA) pertenece a un grupo de compuestos fenólicos
ampliamente distribuido en plantas. Actualmente se lo considera como una
sustancia hormonal, cumpliendo un rol muy importante durante la regulación
del crecimiento y el desarrollo de las plantas (Wang y col., 2006). El efecto de SA
sobre la resistencia de las plantas a enfermedades ha sido discutido por varios
investigadores y es bien sabido que el SA es la molécula señal en la inducción de
la resistencia sistémica adquirida (SAR). En frutilla, el SA tiene el potencial de
controlar las pérdidas post-cosecha de los frutos evitando el decaimiento de los
mismos por hongos patogénicos y disminuyendo la producción de etileno
(Babalar y col., 2007).
El proceso de maduración en frutilla (fruto no-climatérico) y palta (fruto
climatérico), está acompañado por una marcada disminución en los niveles de
óxido nítrico (NO) junto con un incremento en los niveles de etileno (Leshem y
Pinchasov, 2000). Como se ha observado en otros frutos, la aplicación exógena
de NO incrementa la vida post-cosecha de frutilla, sugiriendo un posible rol del
NO en el proceso de maduración del fruto (Leshem y Wills, 1998).
En frutilla, la regulación hormonal de genes que codifican para enzimas
que degradan la pared celular no ha sido estudiada en detalle. En el presente
capítulo de este trabajo de tesis, nos propusimos completar el clonado del ADNc
y de la región promotora de FaXyl1 (un gen que codifica para una β-xilosidasa de
frutilla específica de fruto), y caracterizar su patrón de expresión. Con el fin de
establecer el posible rol de FaXyl1 en el ablandamiento del fruto, estudiamos la
expresión del gen y la actividad β-xilosidasa en dos variedades de frutilla con
firmeza contrastante. Asimismo, se evaluó la expresión de FaXyl1 frente a
distintos reguladores del crecimiento.
48
5.2. RESULTADOS
5.2.1. Clonado del ADNc completo de FaXyl1
Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio habían permitido
obtener un fragmento de ADNc (denominado FaXyl1) que codifica para una βxilosidasa putativa de frutilla (Martínez y col., 2004). Utilizando como sonda un
fragmento de FaXyl1 marcado con
32P-dATP,
se inició la búsqueda del ADNc
completo en una biblioteca de ADNc de frutos maduros. Como resultado de la
misma se obtuvo un clon que contenía 700 pb adicionales en el extremo 5’ de
FaXyl1, mientras que no se detectaron nuevos genes de β-xilosidasa. Para
obtener el ADNc completo de FaXyl1, se llevó a cabo una reacción 5’ RACE
usando ARN de frutos de Toyonoka 75% R.
FaXyl1 tiene un marco abierto de lectura de 2316 pb y una región 3’ no
traducida de 214 pb. Los programas PSORT y SIGNALP predicen un péptido
señal de 28 aminoácidos y localización de la proteína madura en la matriz
extracelular. La proteína madura posee 744 aminoácidos, tiene una masa
molecular predicha de 80,53 kDa y un punto isoeléctrico de 8,29. De acuerdo a
la presencia de dominios conservados en su secuencia de aminoácidos, FaXyl1
pertenece a la familia 3 de las glicosil-hidrolasas. Asimismo, FaXyl1 posee tres
sitios potenciales de N-glicosilación (Figura 7).
MASGYNNKLSLLALVLCVSALLFNLVHARPPFACDPRNPLTRGFKFCRTRVPVHVRVQDLIGRLTLQEKIR
LLVNNAIAVPRLGIQGYEWWSEALHGVSNVGPGTKFGGAFPGATSFPQVITTAASFN QSLWQEIGQVVSD
EARAMYNGGQAGLTYWSPNVNIFRDPRWGRGQETPGEDPVLSAKYAASYVKGLQGDGAGNRLKVAACC
KHYTAYDLDNWNGVDRFHFNARVSKQDLADTYDVPFRGCVLEGKVASVMCSYNQVNGKPTCADPDLLK
NTIRGEWKLNGYIVSDCDSVGVFYDQQHYTRTPEEAAAEAIKAGLDLDCGPFLAIHTEGAIKAGLLPEIDV
DYALANTLTVQMRLGMFDGEPSAQQYGNLGPRDVCTPAHQELALEASRQGIVLLQNNGHTLPLSTVRHR
TVAVVGPNSDVTETMIGNYAGVACGYTTPLQGIGRYTKTIHQQGCTNVACTTNQLFGAAEAAARQADATV
LVMGLDQSIEAEFRDRTDLVMPGHQQELVSRVARASRGPTVLVLMSGGPIDVSFAKNDPKIGAIIWVGYP
GQAGGTAMADVLFGTTN PSGKLPMTWYPQDYVSKVPMTNMAMRAGRGYPGRTYRFYKGPVVFPFGLGL
SYTTFAHSLAQVPTSVSVPLTSLSATTN STMLSSAVRVSHTNCNPLSLALHVVVKNTGARDGTHTLLVFSS
PPSGKWAANKQLVGFHKVHIVAGSHKRVKVDVHVCKHLSVVDQFGIRRIPIGEHKLQIGDLEHHISVEAN
VGEIRS
Figura 7. Análisis bioinformático de FaXyl1. Secuencia de aminoácidos de FaXyl1:
subrayado: péptido señal; sombreado negro: dominio N-terminal de la familia 3 de las
glicosil-hidrolasas; sombreado gris: dominio C-terminal de la familia 3 de las glicosilhidrolasas; residuos encuadrados: sitios potenciales de N-glicosilación.
49
La secuencia de aminoácidos de FaXyl1 predicha muestra una elevada
identidad de secuencia con β-xilosidasas de plantas superiores y una clara
divergencia con secuencias de β-xilosidasas pertenecientes a hongos y oomycetes
(Figura 8).
Arabidopsis thaliana (2)
Raphanus sativus
Hordeum vulgare (1)
Arabidopsis thaliana (4)
Solanum lycopersicon
Medicago sativa
Hordeum vulgare (2)
Fragaria x ananassa
Prunus persica
Arabidopsis thaliana (3)
Arabidopsis thaliana (1)
Oryza sativa
Aspergillus niger
Hypocrea jecorina
Phytophthora infestans
Polygonum tinctorium
Arabidopsis thaliana (5)
Arabidopsis thaliana (6)
Secale cereale
Zea mays
248.1
200
150
100
Nucleotide Substitutions (x100)
50
0
Figura 8. Árbol filogenético de la secuencia de aminoácidos deducida de β-xilosidasas, αarabinofuranosidasas/β-xilosidasas y β-glucosidasas. El árbol se construyó usando el
programa Megalign, método Clustal. Los números de acceso de las secuencias son: βxilosidasas: Arabidopsis thaliana (1), AAF17692; Arabidopsis thaliana (2), BAB11424;
Aspergillus níger, AF108944; Fragaria x ananassa, AAS17751; Hordeum vulgare (1),
AYO29260; Hypocrea jecorina, CAA93248; Oryza sativa, BAB55751; Phytophthora
infestans, AF352032; Prunus persica, ACO22521; Solanum lycopersicon, AB041811. αArabinofuranosidasas/β-xilosidasas: Arabidopsis thaliana (3), BAB09906; Arabidopsis
thaliana (4), BAB09531; Hordeum vulgare (2), AAK38481; Medicago sativa, ABQ45227;
Raphanus sativus, BAE44362. β-Glucosidasas: Arabidopsis thaliana (5), AK117809;
Arabidopsis thaliana (6), NM179517; Polygonum tinctorium, ABO03039; Secale cereale,
AF293849; Zea mays, U33816.
Cabe destacar que FaXyl1 muestra mayor proximidad con β-xilosidasas en
comparación a β-glucosidasas, las cuales también son miembros de la familia 3
de las glicosil-hidrolasas.
50
5.2.2. Purificación de cuerpos de inclusión y obtención del anticuerpo anti-FaXyl1
El ADNc truncado de FaXyl1 se clonó en el vector de expresión pET24a(+)
con el fin de sobreexpresar la proteína en E. coli. La producción de la proteína
recombinante se indujo con el agregado de IPTG durante 1, 3 y 6 h. Debido a que
no fue posible identificar la proteína truncada (∆-FaXyl1) en un extracto total de
E. coli, decidimos lisar las células y analizar las fracciones soluble e insoluble por
SDS-PAGE. Nuevamente, no fue posible identificar con claridad la proteína
recombinante en la fracción soluble. La misma fue detectada en la fracción
insoluble, principalmente luego de 3 h de inducción. El precipitado obtenido
luego de la inducción de la proteína truncada por 3 h se utilizó en la purificación
de cuerpos de inclusión. En la Figura 9 se muestra la curva de inducción de
∆FaXyl1 correspondiente a la fracción insoluble, así como también ∆FaXyl1
purificada a partir de dicha fracción.
kDa
1
2
3
4
5
6
7
66
45
◄ 52 kDa
14,4
Figura 9. Curva de inducción de FaXyl1 truncada (∆FaXyl1). Línea 1: marcador de masa
molecular; línea 2: extracto total de E. coli sin inducir; línea 3: fracción insoluble de E.
coli sin inducir; línea 4: fracción insoluble obtenida luego de 1 h de inducción; línea 5:
fracción insoluble obtenida luego de 3 h de inducción; línea 6: fracción insoluble
obtenida luego de 6 h de inducción; línea 7: ∆FaXyl1 purificada a partir de cuerpos de
inclusión.
Una vez purificada, ∆FaXyl1 se utilizó en la producción de anticuerpos
anti-FaXyl1 de frutilla siguiendo un régimen de inmunización en conejo. La
purificación de los anticuerpos obtenidos dio como resultado la detección de una
51
banda única por western blot en un extracto de frutos maduros de Toyonoka
(Figura 10).
1
2
◄ 66 kDa
Figura 10. Análisis western blot de un extracto de frutos de Toyonoka 100% R utilizando
una dilución 1:1000 del anticuerpo policlonal anti-FaXyl1 sin purificar (línea 1) y
purificado (línea 2).
5.2.3. Actividad β-xilosidasa y expresión de FaXyl1 durante la maduración
Con el fin de analizar el posible rol de FaXyl1 en el proceso de
maduración y ablandamiento del fruto, seleccionamos dos variedades de frutilla
con firmeza contrastante, las cuales habían sido previamente caracterizadas en
nuestro laboratorio (Rosli y col., 2004).
Tabla 3. Cambio de firmeza durante la maduración de
frutos de las variedades Camarosa y Toyonoka.
Estadio
Firmeza (N)
Camarosa
Toyonoka
VG
20,34ª
13,39b
B
11,31ª
2,93b
25% R
3,62ª
1,16b
50% R
2,77ª
0,95b
75% R
2,00a
0,89b
100% R
1,39ª
0,74b
Letras distintas representan diferencias significativas al
comparar las variedades en el mismo estadio de
maduración (P=0,05).
52
Una de ellas, Toyonoka, se ablanda rápidamente, mientras que la otra,
Camarosa, posee una velocidad de ablandamiento menor y da lugar a la
formación de frutos más firmes. Un claro reflejo de la diferencia de firmeza entre
ambas variedades es la observación de que frutos de Camarosa 100% R poseen
valores de firmeza similares a los encontrados en frutos de Toyonoka en estadio
25% R (Tabla 3).
La actividad β-xilosidasa fue superior en la variedad más blanda en todos
los estadios analizados (Figura 11). En ambas variedades la actividad aumentó
desde los estadios VG a B y luego disminuyó en frutos 50% R. Posteriormente, la
actividad se incrementó nuevamente en el estadio 100% R, siendo dicho
incremento muy marcado en la variedad más blanda y muy leve en la más firme.
De esta forma, la máxima actividad β-xilosidasa se encontró en los estadios B y
100% R de frutos de Camarosa y Toyonoka, respectivamente.
Actividad β-Xil (nmol min -1 g
-1
)
1,6
1,4
Camarosa
Toyonoka
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
VG
B
50% R
100% R
Figura 11. Actividad β-xilosidasa durante la maduración de dos variedades de frutilla
con velocidad de ablandamiento contrastante (Camarosa y Toyonoka). Cada barra
representa la media ± la desviación estándar.
Los análisis mediante northern blot realizados en nuestro laboratorio
mostraron que en la variedad más blanda, Toyonoka, los niveles de ARNm de
FaXyl1 son bajos en frutos VP e incrementan a partir del estadio B, alcanzando
53
el máximo en frutos 50% R (Figura 12). Por el contrario, la acumulación de
transcriptos en Camarosa es muy baja, mostrando sólo un leve incremento hacia
el final de la maduración (estadio 100% R).
VP
B
50% R
75% R 100% R
Camarosa
FaXyl1
ARNr 18S
Toyonoka
FaXyl1
ARNr 18S
Figura 12. Análisis northern blot de FaXyl1 durante la maduración de dos variedades de
frutilla con distinta velocidad de ablandamiento (Camarosa y Toyonoka). Se utilizó ARNr
18S como control de carga.
Para estudiar los niveles de proteína FaXyl1 a lo largo de la maduración,
se analizaron extractos proteicos de frutos de Camarosa y Toyonoka mediante
western blot utilizando los anticuerpos anti-β-xilosidasa de frutilla obtenidos en
conejo (Figura 13).
Camarosa
VG
B
50% R 100% R
Toyonoka
VG
B
50% R 100% R
◄ 66 kDa
Figura 13. Análisis western blot de FaXyl1 durante la maduración de frutos de
Camarosa y Toyonoka, utilizando un anticuerpo policlonal anti-FaXyl1 de conejo.
54
En ambas variedades se detectó una banda de 66 kDa. En Toyonoka,
FaXyl1 está presente en todos los estadios ensayados y su cantidad se
incrementa durante la maduración del fruto. Sin embargo, en Camarosa la
proteína está ausente en fases tempranas de la maduración y sólo fue detectada
en frutos 50 y 100% R (Figura 13).
5.2.4. Análisis por cromatografía de exclusión molecular
Con el objeto de analizar la posible presencia de isoenzimas de βxilosidasa, se analizaron extractos proteicos obtenidos a partir de frutos maduros
e inmaduros de Camarosa y Toyonoka mediante la técnica de cromatografía de
exclusión molecular.
V0
1 2
3
4
0.20
0,20
0.010
0.15
0,15
0.008
DO280nm
0.10
0,10
0.006
0.05
0,05
0.004
DO280nm
Actividad β-Xil (nmol min-1)
Actividad (nmol. min-1)
0.002
0.00
0,00
0.000
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Nº Fracción
Figura 14. Perfil de elución de la actividad β-xilosidasa de un extracto de Toyonoka
100% R en una columna Sephacryl S-100. El pico mayor de elución corresponde a una
masa molecular aparente de 66 kDa. Los patrones de elución utilizados fueron: 1,
Albúmina (66 kDa); 2, Ovoalbúmina (43 kDa); 3, Quimotripsinógeno A (25 kDa); 4,
Ribonucleasa A (13,7 kDa). V0: volumen muerto.
55
No
pudo
detectarse
actividad
β-xilosidasa
en
las
fracciones
cromatográficas de los extractos obtenidos a partir de frutos de Camarosa o
frutos inmaduros de Toyonoka, debido probablemente a la baja actividad inicial
de los extractos y a la dilución que se produce durante la elución de la columna.
Sin embargo, cuando se utilizaron extractos de Toyonoka 100% R, detectamos
un pico mayor de actividad β-xilosidasa el cual se corresponde con una masa
molecular aparente de 66 kDa (Figura 14).
5.2.5. Localización de la actividad enzimática y de FaXyl1
Con el fin de localizar de manera más precisa tanto la actividad βxilosidasa como la expresión de FaXyl1, frutos de Toyonoka en distintos estadios
del desarrollo y maduración se dividieron en diferentes zonas, externa e interna
(Vicente y col., 2005).
La coloración rojiza característica de frutilla no se presenta de manera
homogénea en las distintas zonas del fruto. En general, la parte interna presenta
un color rojo menos intenso que la zona externa (Figura 15).
Figura 15. Cortes longitudinal (izquierda) y transversal (derecha) de un fruto de
Toyonoka en estadio 100% R.
Estas diferencias pueden reflejarse mediante el análisis del contenido de
antocianinas. Tal como se observa en la Figura 16, la zona externa muestra
mayor acumulación de antocianinas en comparación con la zona interna en
estadios avanzados de maduración.
56
180
Antocianinas (nmol g-1)
160
140
120
100
80
60
40
20
0
VG
B
50% R 100% R VG
Tejido externo
B
50% R 100% R
Tejido interno
Figura 16. Contenido de antocianinas en las zonas externa e interna de frutos de
Toyonoka en estadio VG, B, 50% R y 100% R. Cada barra representa la media ± la
desviación estándar.
Por otro lado, la actividad β-xilosidasa se mantuvo prácticamente
constante a lo largo de la maduración del fruto en tejido externo, alcanzando un
valor similar al encontrado en tejido interno de frutos VG (Figura 17).
-1
Actividad β-Xil (nmol min-1 g )
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
VG
B
50% R 100% R VG
Tejido externo
B
50% R 100% R
Tejido interno
Figura 17. Actividad β-xilosidasa en las zonas externa e interna de frutos de Toyonoka
en estadio VG, B, 50% R y 100% R. Cada barra representa la media ± la desviación
estándar.
57
En contraste, la actividad enzimática aumentó en el tejido interno a partir
del estadio B, alcanzando un máximo en frutos 100% R (Figura 17).
El ARNm de FaXyl1 se detectó a partir de los estadios B y 50% R en tejido
externo e interno, respectivamente (Figura 18 A). Los niveles de transcripto de
FaXyl1 aumentaron durante la maduración del tejido externo, mientras que, en
tejido interno, alcanzaron un máximo en el estadio 50% R.
A
Tejido externo
VG
B
50% R
100% R
Tejido interno
VG
B
50% R 100% R
FaXyl1
ARNr
B
Tejido externo
VG
B
50% R 100% R
Tejido interno
VG
B
50% R 100% R
FaXyl1
Figura 18. Análisis de los niveles de ARNm (A) y proteína de FaXyl1 (B) en las zonas
externa e interna de frutos de Toyonoka en estadio VG, B, 50% R y 100% R.
Asimismo, la proteína FaXyl1 se detectó a partir del estadio 50% R en
ambos tejidos, aumentando levemente en el estadio 100% R en tejido externo y
manteniéndose prácticamente constante en tejido interno (Figura 18 B).
5.2.6. Actividad y estabilidad de la enzima recombinante
58
La sobreexpresión de FaXyl1 truncada y completa en E. coli produjo
agregados insolubles en forma de cuerpos de inclusión. Sin embargo, una
fracción de las enzimas recombinantes permaneció soluble y efectivamente
mostró actividad β-xilosidasa frente al sustrato artificial p-nitrofenil-β-Dxilopiranósido (Tabla 4).
Tabla 4. Determinación de actividades β-xilosidasa y α-arabinofuranosidasa
en extractos de fruto maduro de Toyonoka y células de E. coli expresando
FaXyl1 truncada (∆FaXyl1) y completa (FaXyl1).
Fuente
Actividad específica
β-xilosidasa
(nmol min-1 mg-1)
Actividad específica
α-arabinofuranosidasa
(nmol min-1 mg-1)
Frutos de Toyonoka 100% R
0,523 ± 0,001
0,726 ± 0,026
BL21
No detectada
No detectada
BL21 + pET24a(+)/∆FaXyl1
0,152 ± 0,011
No detectada
BL21 + pET24a(+)/FaXyl1
0,080 ± 0,003
No detectada
Dado que muchas β-xilosidasas son enzimas bifuncionales y también
presentan actividad α-arabinofuranosidasa (Lee y col., 2003; Minic y col., 2004),
medimos ambas actividades sobre extractos de la enzima recombinante y de
frutos maduros de la variedad Toyonoka (Tabla 4). Si bien detectamos ambas
actividades en los frutos maduros de frutilla, la enzima recombinante sólo mostró
actividad β-xilosidasa.
Teniendo en cuenta que ciertas β-xilosidasas poseen una elevada
estabilidad térmica (Chinen y col., 1982; Mujer y Miller, 1991), decidimos
incubar los sobrenadantes de los lisados bacterianos a 50, 55 y 60 ºC durante
10, 20 y 30 min para analizar la estabilidad de las enzimas recombinantes
truncada y completa. Después de cada tratamiento, la mezcla fue clarificada por
centrifugación y la actividad enzimática determinada en el sobrenadante. Con
respecto
a
la
enzima
truncada,
la
actividad
β-xilosidasa
permaneció
prácticamente constante a 50 y 55 ºC hasta los 30 y 20 min de incubación,
respectivamente. Sin embargo, debido a que el incremento de la temperatura
59
estimula la precipitación de proteínas, hubo variaciones en la actividad
específica.
El
tratamiento
a
50
ºC
incrementó
la
actividad
específica,
obteniéndose el mayor valor luego de 30 min de calentamiento. En el caso de
tratamientos realizados a 55 ºC, la máxima actividad específica se observó luego
de 20 min, mientras que incubaciones más largas dieron como resultado una
reducción de la misma. En los ensayos realizados a 60 ºC, la actividad βxilosidasa fue muy baja, llegando a ser nula luego de 30 min de incubación
(Tabla 5).
Tabla 5. Tratamiento térmico de FaXyl1 truncada recombinante
Incubación
Temperatura (ºC)
50
55
60
Actividad
Proteína
Actividad específica
(nmol min-1 ml-1)
(mg ml-1)
(nmol min-1 mg-1)
10
0,499 ± 0,031
5,8
0,086 ± 0,005
20
0,506 ± 0,003
4,6
0,110 ± 0,006
30
0,508 ± 0,007
4,1
0,124 ± 0,002
10
0,551 ± 0,011
4,4
0,125 ± 0,003
20
0,543 ± 0,003
3,5
0,155 ± 0,001
30
0,446 ± 0,006
3,0
0,149 ± 0,002
10
0,078 ± 0,005
2,8
0,028 ± 0,002
20
0,033 ± 0,002
2,8
0,012 ± 0,001
30
0,000 ± 0,000
2,3
0,000 ± 0,000
Tiempo (min)
En el caso de la enzima completa, la actividad β-xilosidasa se mantuvo
aproximadamente constante durante los tratamientos a 50 y 55 ºC durante 10,
20 y 30 min, observándose un incremento en la actividad específica a 55 ºC con
respecto a la incubación llevada a cabo a 50 ºC. Si bien a 60 ºC la actividad
enzimática disminuye de manera notoria, la misma no llega a ser nula como
ocurre con la enzima truncada luego de 30 min de incubación (Tabla 6).
60
Tabla 6. Tratamiento térmico de FaXyl1 completa recombinante
Incubación
Temperatura (ºC)
50
55
60
Actividad
Proteína
Actividad específica
(nmol min-1 ml-1)
(mg ml-1)
(nmol min-1 mg-1)
10
0,394 ± 0,013
5,6
0,070 ± 0,002
20
0,348 ± 0,007
5,0
0,070 ± 0,001
30
0,315 ± 0,033
4,5
0,070 ± 0,007
10
0,372 ± 0,000
3,9
0,095 ± 0,000
20
0,339 ± 0,028
3,7
0,092 ± 0,007
30
0,351 ± 0,000
3,6
0,098 ± 0,000
10
0,113 ± 0,006
2,9
0,039 ± 0,002
20
0,039 ± 0,015
2,6
0,015 ± 0,006
30
0,059 ± 0,028
2,5
0,022 ± 0,010
Tiempo (min)
5.2.7. Clonado de la región promotora de FaXyl1
A partir de ADN genómico de frutilla (cv Toyonoka), se aisló un fragmento
de 1825 pb perteneciente a la región promotora de FaXyl1. Usando los
programas PLANTCARE y PLACE se realizó la búsqueda de elementos
reguladores. Como resultado de la misma, se encontraron distintos elementos en
cis en la región promotora de FaXyl1, que podrían ser importantes para la
regulación del gen durante la maduración del fruto (Tabla 7). Dentro de los
elementos reguladores más conocidos se incluye: región rica en 5'UTR Py
(confiere altos niveles de transcripción), ABRE (involucrado en las respuestas a
ABA), motivo GARE (involucrado en las respuestas a giberelinas), elemento TCA
(involucrado en las respuestas a SA), AuxRR-core (involucrado en las respuestas
a auxinas), y distintos elementos involucrados en las respuestas a la luz.
Asimismo, se identificaron varios elementos relacionados con respuestas a
estrés: HSE (involucrado en las respuestas a estrés por calor), LTR (involucrado
en las respuestas a bajas temperaturas), MBS (sitio de unión a MYB involucrado
en la inducción por sequía) y repeticiones ricas en TC (involucrado en respuestas
a estrés y defensa).
61
Tabla 7. Resumen de los elementos reguladores en cis encontrados en la región
promotora de FaXyl1. La posición de los elementos se expresó en relación al codón de
inicio de la traducción (ATG).
Nombre del sitio
Región rica en
5UTR Py
Posición
-283 y -550 (+)
Secuencia
TTTCTTCTCT
ABRE
ACE
AuxRR-core
-168 (+)
-167 (+)
-443 (+)
TACGTG
ACGTGGA
GGTCCAT
G-box
-168 (+)
-168 (-)
-833 (-)
-315 (-)
-266 (-)
TACGTG
CACGTA
CACGAC
TAACACGTAG
AAACAGA
AGAAAATTCG
AAAAAATTTC
CCGAAA
MBS
-1561 (-)
-1394 (-)
-1545 (+)
-1683 (+)
-318 (+)
MRE
-662 (-)
AACCTAA
Sp1
-329 y -1295 (+)
CC(G/A)CCC
TATA-box
-61 (+)
TATATAA
Repeticiones ricas
en TC
Elemento TCA
-1558 (+)
ATTTTCTTCA
-430 (+)
CAATCTTTTT
CAAT-box
Hebra – (10
elementos)
Hebra + (23
elementos)
CAAT
CAAAT
gGCAAT
CAATT
CCAAT
TGCCAAC
Motivo GARE
HSE
LTR
CAACTG
Función
Confiere altos
niveles de
transcripción
Respuestas a ABA
Respuestas a luz
Respuestas a
auxinas
Respuestas a luz
Respuestas a
giberelinas
Respuestas a
estrés por calor
Respuestas a bajas
temperaturas
Sitio de unión a
MYB involucrado
en la inducción por
sequía
Sitio de unión a
MYB involucrado
en las respuestas a
luz
Involucrado en las
respuestas a luz
Presente en la
región promotora
de muchos genes
eucariotas e
involucrada en la
unión de la ARN
polimerasa II
Respuestas a
estrés y defensa
Respuestas a ácido
salicílico
Presente en
regiones
promotoras y
activadoras
Finalmente, el análisis de la secuencia permitió identificar la presencia de
un TATA-box putativo (presente en la región promotora de muchos genes
eucariotas e involucrada en la unión de la ARN polimerasa II) a -61 pb del codón
62
de inicio de la traducción (ATG), y un número de cajas CAAT (presentes en
regiones promotoras y activadoras) (Figura 19).
ATG
TA
TA
-bo
x
MR
ón
E
ric
ae
Ele
n
me
5
U
nto
TR
Mo
TC
Py
A,
tivo
A
ux
GA
RR
RE
-co
G,R
bo
re
egi
x
,M
ón
BS
ric
ae
,S
p1
n5
AB
UT
RE
R
,A
Py
CE
,G
-bo
x
Re
gi
Gbox
E
Sp
1
HS
SE
TC
,H
LT
R,
Re
pe
tic
ion
es
r
ica
se
n
LT
R
FaXyl1
Figura 19. Esquema de la región promotora de FaXyl1 (sombreado gris). La posición de
los elementos (cajas negras y líneas verticales) en la figura es proporcional a la distancia
de los mismos con respecto al codón de inicio de la traducción (ATG). Las líneas
verticales representan a las cajas CAAT.
5.2.8. Efecto de hormonas sobre la expresión de FaXyl1 y la actividad β-xilosidasa
Con el fin de probar la función fisiológica de los elementos reguladores
asociados con las respuestas a hormonas, estudiamos el efecto de distintos
tratamientos exógenos sobre la actividad β-xilosidasa y los niveles de ARNm y
proteína de FaXyl1. Los mismos incluyeron hormonas cuya acción putativa fue
identificada en la región promotora de FaXyl1 (auxinas, giberelinas, ABA y SA)
así como también reguladores del crecimiento posiblemente involucrados en el
proceso de maduración del fruto (etileno y NO). El tratamiento con estas dos
últimas moléculas se realizó mediante aplicaciones con etefón y nitroprusiato de
sodio (SNP), respectivamente.
Los tratamientos se realizaron utilizando frutos en estadio blanco de las
variedades Camarosa (tratamientos con NAA, GA3, ABA, etefón, 1-MCP y SNP) y
Toyonoka (para el tratamiento con SA). Los tratamientos se llevaron a cabo por
contacto del fruto con una solución del compuesto a ensayar (etefón, SNP y SA),
por absorción de la misma a través del pedúnculo (NAA, GA3 y ABA) o por
63
incubación en una atmósfera conteniendo 1-MCP. En cada caso se determinó el
contenido de antocianinas como medida del progreso de la maduración.
5.2.8.1. Auxinas y giberelinas
El contenido de antocianinas (Figura 20 A), la actividad β-xilosidasa
(Figura 20 B), y los niveles de transcripto (Figura 20 C) y proteína (Figura 20 D)
de FaXyl1 fueron menores en aquellos frutos tratados con auxinas sintéticas
(NAA 1 mM) con respecto a los controles.
B
-1
Antocianinas (nmol g )
160
140
***
120
100
80
60
***
40
20
0
C
C
C
NAA
NAA
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
A
0,6
0,5
**
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
GA3
GA3
C
NAA
GA3
D
C
FaXyl1
NAA
GA3
FaXyl1
ARNr
Figura 20. Efecto de NAA y GA3 sobre el contenido de antocianinas (A), la actividad βxilosidasa (B), y la expresión (C) y los niveles de proteína (D) de FaXyl1. Los tratamientos
con NAA y GA3 se realizaron incubando frutos de Camarosa en estadio B con NAA 1 mM
y GA3 1 mM durante 3 d a 20 ºC, respectivamente. Los frutos control se mantuvieron en
contacto con H2Od. Las diferencias estadísticas en el nivel de antocianinas y la actividad
β-xilosidasa entre frutos tratados y control de acuerdo al test t de Student se indican
como: ***, P < 0,001 y **, P < 0,01, respectivamente.
Se procedió también a estudiar el efecto de auxinas endógenas. Para ello
64
se realizó un deaquenado de los frutos, el cual se llevó a cabo removiendo los
aquenios de la mitad de la superficie de cada fruto, usando la parte intacta como
control. A diferencia de lo que ocurre en otras variedades de frutilla, no se
observó un marcado incremento en la velocidad de maduración medido como
síntesis de antocianinas en los frutos deaquenados con respecto al control
(Figura 21 A). La deaquenación causó un cierto daño en los frutos (Figura 21 B),
y los niveles de transcripto y proteína de FaXyl1 disminuyeron en los frutos
tratados con respecto al control (Figura 21 C y D).
A
B
Antocianinas (nmol g-1)
120
100
80
60
40
20
Mitades deaquenadas
0
+ Aq
- Aq
D
C
+ Aq
- Aq
FaXyl1
FaCel1
+ Aq
- Aq
FaXyl1
ARNr
Figura 21. Efecto de la eliminación de los aquenios sobre el contenido de antocianinas
(A), la integridad de los frutos (B), la expresión de FaXyl1 y FaCel1 (C) y los niveles de
proteína de FaXyl1. La mitad de cada fruto se deaquenó (-Aq), y la mitad intacta se usó
como control del ensayo (+Aq). Los frutos se incubaron durante 3 d a 20 ºC con el
pedúnculo sumergido en H2Od para evitar la deshidratación de los mismos.
El análisis de los niveles de ARNm de FaCel1 (gen de endo-β-1,4glucanasa de frutilla fuertemente inhibido por auxinas (Harpster y col., 1998))
reveló que los mismos se mantuvieron constantes en frutos tratados y control,
sugiriendo que el deaquenado no sería una metodología apropiada para estudiar
65
el efecto de auxinas endógenas en Camarosa (Figura 21 C).
La aplicación de ácido giberélico (GA3 1 mM) produjo un retraso en la
maduración evidenciado por una menor acumulación en el contenido de
antocianinas (Figura 20 A) y una ligera disminución en los niveles de ARNm
(Figura 20 C) y proteína de FaXyl1 (Figura 20 D). En cambio, no se observaron
diferencias significativas en la actividad β-xilosidasa entre frutos tratados y
control (Figura 20 B).
5.2.8.2. Acido abscísico
Con el fin de dilucidar el posible efecto del ácido abscísico (ABA), frutos de
Camarosa en estadio B se trataron con ABA 1 mM durante 3 d a 20 ºC.
A
B
0,6
Aesp β-Xil (nmol min-1 g-1)
Antocianinas (nmol g-1)
120
*
100
80
60
40
20
0
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
C
C
0,5
C
ABA
ABA
C
ABA
D
C
FaXyl1
ABA
FaXyl1
ARNr
Figura 22. Efecto de ABA sobre el contenido de antocianinas (A), la actividad β-xilosidasa
(B), y la expresión (C) y los niveles de proteína de FaXyl1 (D). Frutos de la variedad
Camarosa en estadio B se incubaron con una solución de ABA 1 mM en etanol 2% v/v
por 3 d a 20 ºC. Los frutos control se incubaron con etanol 2% v/v. La diferencia
estadística en el nivel de antocianinas entre frutos tratados y control de acuerdo al test t
de Student se indica como: *, P < 0,05.
66
Luego de este período, los frutos tratados con la hormona mostraron un
leve incremento en la cantidad de antocianinas, sugiriendo una estimulación de
la maduración (Figura 22 A). Asimismo, se produjo una mayor acumulación de
transcripto y proteína de FaXyl1 en los frutos tratados con respecto al control
(Figuras 22 C y D), mientras que no se observaron diferencias significativas en la
actividad β-xilosidasa (Figura 22 B).
5.2.8.3. Etileno
El tratamiento con etileno se realizó mediante la aplicación de etefón,
sustancia que libera etileno en contacto con los tejidos vegetales.
A
B
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
Antocianinas (nmol g-1)
140
***
120
100
80
60
40
20
0
C
C
C
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
C
Et
Et
Et
D
C
FaXyl1
Et
FaXyl1
ARNr
Figura 23. Efecto de etefón sobre el contenido de antocianinas (A), la actividad βxilosidasa (B), y la expresión (C) y los niveles de proteína de FaXyl1 (D). Frutos de
Camarosa en estadio B se sumergieron por 5 min en una solución conteniendo etefón 2
mM, Tween 0,02% v/v y etanol 1% v/v. Los controles se llevaron a cabo sumergiendo los
frutos en Tween 0,02% v/v y etanol 1% v/v. Luego del tratamiento, los frutos se
incubaron durante 2 d a 20 ºC con el pedúnculo sumergido en H2Od para evitar la
deshidratación de los mismos. La diferencia estadística en el nivel de antocianinas entre
frutos tratados y control de acuerdo al test t de Student se indica como: ***, P < 0,001.
67
Los frutos tratados mostraron una aceleración de la maduración,
evidenciada por la acumulación de antocianinas (Figura 23 A). Sin embargo, este
mismo tratamiento causó una menor acumulación de FaXyl1 (Figuras 23 C y D),
actuando esta hormona como un regulador negativo. En este caso, tampoco se
observaron diferencias significativas en la actividad enzimática entre frutos
tratados y control (Figura 23 B).
Con el fin de validar nuestros resultados, analizamos el efecto de 1-MCP,
un inhibidor de la acción del etileno, sobre la maduración del fruto y la expresión
de FaXyl1. El tratamiento con 1-MCP provocó un claro retraso en la maduración
del fruto (Figura 24 A).
A
B
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
Antocianinas (nmol g-1)
140
120
100
80
60
40
***
20
0
C
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
1-MCP
C
C
1-MCP
D
C
1-MCP
C
1-MCP
FaXyl1
FaXyl1
ARNr
Figura 24. Efecto de 1-MCP sobre el contenido de antocianinas (A), la actividad βxilosidasa (B), y la expresión (C) y los niveles de proteína de FaXyl1 (D). Frutos de la
variedad Camarosa en estadio B se incubaron con 1-MCP 1 ppm durante 10 h a 20 ºC,
mientras que los frutos control se incubaron en las mismas condiciones en ausencia del
inhibidor. Luego del tratamiento, los frutos se incubaron durante 2 d a 20 ºC con el
pedúnculo sumergido en H2Od para evitar la deshidratación de los mismos. La diferencia
estadística en el nivel de antocianinas entre frutos tratados y control de acuerdo al test t
de Student se indica como: ***, P < 0,001.
68
Contrariamente a lo observado luego del tratamiento con etefón, los
niveles de ARNm y proteína de FaXyl1 aumentaron con respecto al control
(Figura 24 C y D), mientras que no se observaron diferencias significativas en la
actividad β-xilosidasa (Figura 24 B).
5.2.8.4. Oxido nítrico
Frutos de frutilla en diferentes estadios del desarrollo (B y 75% R) se
sumergieron en soluciones de SNP de distinta concentración (5 μM y 10 μM)
durante 2 h. Luego de incubar los frutos por 2 d a 20 ºC se midió el contenido de
antocianinas (Figura 25). Sólo en los frutos B tratados con SNP 5 μM y 10 μM se
observaron diferencias significativas en el contenido de antocianinas entre los
frutos tratados y control (Figura 25 A).
A
B
Estadio B
Estadio 75% R
-1
***
60
***
40
20
0
C
Antocianinas (nmol g )
140
-1
Antocianinas (nmol g )
80
5 μM
10μM
SNP
120
100
80
60
40
20
0
C
5 μM
10μM
SNP
Figura 25. Contenido de antocianinas en frutos de la variedad Camarosa en estadio B (A)
y 75% R (B) tratados con distintas concentraciones de SNP. Los frutos se sumergieron en
SNP 5 μM y 10 μM durante 2 h, utilizando un tratamiento similar con H2Od como control.
Luego de este período, los frutos se incubaron durante 2 d a 20 ºC con el pedúnculo
sumergido en H2Od para evitar la deshidratación de los mismos. La diferencia estadística
en el nivel de antocianinas entre frutos tratados y control de acuerdo al test t de Student
se indica como: ***, P < 0,001.
Dado que la mayor diferencia se obtuvo con los frutos tratados con SNP 5
μM, el análisis de los niveles de ARNm y proteína de FaXyl1 se realizó bajo estas
69
condiciones. El aumento en los niveles de antocianinas en los frutos tratados con
SNP 5 μM (Figura 26 A) indica un probable efecto positivo del NO en la
maduración de frutillas. El NO producido por tratamiento con SNP no tendría
efecto sobre la actividad enzimática (Figura 26 B), ni tampoco sobre la expresión
del gen y la correspondiente proteína (Figuras 26 C y D).
A
B
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
***
-1
Antocianinas (nmol g )
80
60
40
20
0
C
C
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
SNP
C
SNP
C
SNP
D
C
SNP
FaXyl1
FaXyl1
ARNr
Figura 26. Efecto de SNP sobre el contenido de antocianinas (A), la actividad β-xilosidasa
(B), y la expresión (C) y los niveles de proteína de FaXyl1 (D). Frutos de la variedad
Camarosa se sumergieron en una solución de SNP 5 μM durante 2 h, utilizando un
tratamiento similar con H2O como control. Luego del tratamiento, los frutos se incubaron
durante 2 d a 20 ºC con el pedúnculo sumergido en H2Od para evitar la deshidratación de
los mismos. La diferencia estadística en el nivel de antocianinas entre frutos tratados y
control de acuerdo al test t de Student se indica como: ***, P < 0,001.
5.2.8.5. Acido salicílico
El tratamiento con ácido salicílico (SA 1 mM) provocó un claro retraso en
la maduración de los frutos tratados con respecto al control (Figura 27 A). Sin
embargo, no se observaron diferencias significativas en la actividad β-xilosidasa
70
(Figura 27 B), y los niveles de transcripto (Figura 27 C) y proteína de FaXyl1
(Figura 27 D) se mantuvieron constantes luego del tratamiento.
A
B
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
-1
Antocianinas (nmol g )
200
150
100
***
50
0
C
C
C
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
SA
C
SA
SA
D
C
FaXyl1
SA
FaXyl1
ARNr
Figura 27. Efecto de SA sobre el contenido de antocianinas (A), la actividad β-xilosidasa
(A), y la expresión (C) y los niveles de proteína de FaXyl1 (D). Frutos de la variedad
Camarosa en estadio B se sumergieron en una solución de SA 1 mM durante 5 min,
mientras que los controles respectivos se sumergieron en H2Od. Luego del tratamiento,
los frutos se incubaron durante 2 d a 20 ºC con el pedúnculo sumergido en H2Od para
evitar la deshidratación de los mismos. La diferencia estadística en el nivel de
antocianinas entre frutos tratados y control de acuerdo al test t de Student se indica
como: ***, P < 0,001.
71
5.3. DISCUSIÓN
Numerosos ensayos de la actividad in vitro de β-xilosidasas sugerían que
las mismas deberían estar involucradas en el metabolismo de la pared celular,
particularmente de la fracción de xilanos de las hemicelulosas. El uso de
mutantes de inserción y de la tecnología antisentido permitió establecer con
precisión el rol de dos β-xilosidasas de Arabidopsis thaliana. Una de ellas,
AtBXL1, estaría involucrada en el metabolismo de hemicelulosas de la pared
celular secundaria y en el desarrollo de la planta (Goujon y col., 2003), mientras
que la otra, XYL3, cumpliría un rol en la degradación de polisacáridos de reserva
durante
el
desarrollo
del
embrión
(Minic
y
col.,
2006).
En
frutillas,
particularmente, trabajos previos habían demostrado la presencia de actividad βxilosidasa y la expresión de un gen codificante para una de ellas (Martínez y col.,
2004). El clon FaXyl1 aislado tenía un tamaño de 1699 pb y estaba incompleto
en su extremo 5’. En el presente trabajo, logramos clonar el ADNc completo del
gen a través de la técnica 5’ RACE. La proteína codificada por FaXyl1 pertenece a
la familia 3 de las glicosil-hidrolasas y muestra una elevada identidad de
secuencia con β-xilosidasas de plantas superiores, en especial con la enzima
aislada a partir de frutos de durazno. Claramente, FaXyl1 muestra mayor
proximidad con β-xilosidasas en comparación a β-glucosidasas, otro grupo de
enzimas perteneciente a la familia 3 de las glicosil-hidrolasas. La inclusión de
enzimas con actividad bifuncional α-arabinofuranosidasa/β-xilosidasa nos llevó
a la observación de que enzimas con elevada identidad en su secuencia de
aminoácidos no necesariamente poseen similar especificidad de sustrato.
FaXyl1 posee un péptido señal predicho de 28 aminoácidos que
determinaría la localización de la proteína en la matriz extracelular. La presencia
de tres sitios potenciales de N-glicosilación en su secuencia de aminoácidos está
de acuerdo con la localización extracelular de la misma. El ADNc completo de
FaXyl1 codifica para un producto de traducción primario de 772 aminoácidos. La
proteína madura posee 744 aminoácidos y una masa molecular predicha de 81
kDa. Este valor es superior a la masa molecular aparente observada por
exclusión molecular y por western blot. Resultados similares se describieron en
β-xilosidasas purificadas de tallos de Arabidopsis thaliana y plántulas de cebada
(Minic y col., 2004; Lee y col., 2003). En el último caso, los autores demostraron
que el extremo C-terminal del producto de traducción primario es procesado
durante la maduración de la proteína. De este modo, proponemos que una
72
deleción similar también se produciría en FaXyl1 de frutilla, dando lugar a una
reducción en la masa molecular de la enzima desde el valor de 81 kDa (predicho
a partir del ADNc) hasta 66 kDa (evaluado mediante exclusión molecular y
western blot).
Los ADNc truncado y completo de FaXyl1 se utilizaron para obtener las
correspondientes proteínas recombinantes en E. coli. Si bien una elevada
proporción de las enzimas recombinantes truncada y completa formaron
agregados en la forma de cuerpos de inclusión, una fracción de las mismas
permaneció soluble. La actividad enzimática medida en la fracción soluble nos
permitió confirmar que el clon FaXyl1 aislado codifica efectivamente para una βxilosidasa, y que la región N-terminal de la proteína (255 aminoácidos) no es
necesaria para la catálisis. Al igual que otros miembros de este grupo, la enzima
posee una elevada estabilidad térmica, siendo la misma levemente superior en el
caso de la enzima recombinante completa, lo cual nos permitió medir actividad
β-xilosidasa a elevadas temperaturas. Esta característica de la enzima podría
facilitar la purificación de la misma introduciendo el tratamiento térmico como
un paso adicional durante la eliminación de proteínas interferentes.
Las β-xilosidasas poseen actividad hacia sustratos naturales y artificiales
conteniendo D-xilosa. Sin embargo, en muchos casos, pueden hidrolizar pnitrofenil-α-L-arabinofuranósido in vitro, sugiriendo una posible actividad
arabinofuranosidasa.
En
Arabidopsis,
se
demostró
que
XYL1
hidroliza
eficientemente L-arabinofuranosa, indicando que la enzima es bifuncional (Minic
y col., 2004). Sin embargo, XYL4, también aislada de Arabidopsis, posee una
especificidad enzimática característica de una β-xilosidasa con una baja
actividad hacia p-nitrofenil-α-L-arabinofuranósido (Minic y col., 2004). En
cebada, una β-xilosidasa (XYL) purificada de plántulas mostró muy baja
actividad α-arabinofuranosidasa (Lee y col., 2003). Por el contrario, la
correspondiente α-arabinofuranosidasa (ARA-I) tiene propiedades catalíticas
bifuncionales (β-xilosidasa y α-arabinofuranosidasa). En nuestro caso, la
actividad α-arabinofuranosidasa se halla presente en extractos de frutilla, pero la
enzima recombinante obtenida a partir del gen FaXyl1 sólo mostró actividad
hacia el sustrato artificial p-nitrofenil-β-D-xilopiranósido. Estos resultados
indican que FaXyl1 no posee actividad α-arabinofuranosidasa in vitro y que dicha
actividad detectada en frutos se debe a una enzima diferente a FaXyl1. Sin
embargo, no podemos descartar la posibilidad de que FaXyl1 pueda liberar
residuos de α-L-arabinofuranosa in vivo a partir de polímeros de pared.
73
Diversos y numerosos trabajos previos demostraron la presencia de una
gran variedad de enzimas hidrolíticas durante la maduración de frutilla, tales
como poligalacturonasa (Nogata y col., 1993), β-galactosidasa (Trainotti y col.,
2001), endo-β-1,4-glucanasa (Harpster y col., 1998; Llop-Tous y col., 1999;
Trainotti y col., 1999; Woolley y col., 2001), pectin metilesterasa (Castillejo y col.,
2004), β-xilosidasa (Martínez y col., 2004) y α-L-arabinofuranosidasa (Rosli y col,
2009). En nuestro laboratorio, caracterizamos los cambios en la actividad βxilosidasa durante la maduración de dos variedades de frutilla con distinta
velocidad de ablandamiento. Los frutos de la variedad Camarosa poseen mayor
firmeza que los frutos de Toyonoka en todas las etapas de maduración
analizadas. De hecho, los frutos de Camarosa en estadio 100% R tienen una
firmeza similar a los frutos de Toyonoka 25% R (Rosli y col., 2004). De acuerdo a
los resultados obtenidos, habría una clara correlación entre la expresión de
FaXyl1 y la actividad β-xilosidasa y el ablandamiento del fruto. La expresión de
FaXyl1 fue mayor en Toyonoka, la variedad más blanda, que en Camarosa.
Además, la proteína FaXyl1 está presente en todas las etapas de maduración y a
niveles superiores en el cultivar más blando, mientras que en Camarosa la
proteína sólo pudo detectarse a partir del estadio 50% R. Sin embargo, cabe
destacar que la correlación entre la actividad β-xilosidasa y la expresión de
FaXyl1 o los niveles de proteína en distintas etapas de la maduración no es
completa. En Toyonoka, la mayor acumulación de ARNm se produce entre los
estadios B y 75% R, siendo máxima en 50% R, en tanto que la actividad y los
niveles de proteína fueron superiores hacia el final de la maduración. Un patrón
similar se ha observado durante la expresión de FaExp2, un gen que codifica
para una expansina relacionada con la maduración. Mientras que el transcripto
aparece a partir del estadio B, la proteína correspondiente se detecta por western
blot en el estadio 25% R (Civello y col., 1999). En Camarosa, los niveles de
actividad enzimática medidos son menores que los encontrados en Toyonoka, en
todos los estadios de madurez. Lo mismo ocurre con los niveles de transcripto de
FaXyl1, excepto en el estadio 100% R en que la relación es inversa. En la
variedad Camarosa, los análisis realizados a través de las técnicas de northern y
western blot se correlacionan, mostrando un mayor nivel de ARNm y proteína en
el estadio 100% R. Por el contrario, el máximo en la actividad β-xilosidasa se
produce en el estadio B. Las diferencias en los patrones de actividad y los niveles
de ARNm podrían deberse a la presencia de otras proteínas con actividad βxilosidasa. En nuestro caso, detectamos un único pico de actividad enzimática
74
por cromatografía de exclusión molecular. Sin embargo, no debe descartarse la
presencia de varias isoenzimas de masa molecular similar o isoenzimas con masa
molecular distinta a 66 kDa pero con baja actividad, las cuales podrían ser
indetectables por análisis cromatográfico luego de diferentes pasos de extracción
y purificación. Un grado de complejidad adicional se detecta al realizar la
comparación de los patrones de expresión entre distintas variedades de frutilla.
La actividad enzimática y los niveles de transcripto observados en el presente
trabajo difieren de aquellos descriptos en la variedad Selva (Martínez y col.,
2004). Por otro lado, se detectaron diferencias en la composición y en el
catabolismo de la pared celular durante la maduración de variedades de frutilla
con distinta velocidad de ablandamiento (Rosli y col., 2004). Estos hechos
indican que la fisiología y el metabolismo de la pared celular podrían diferir
significativamente entre variedades de frutilla con firmeza contrastante.
La variación en la actividad β-xilosidasa o en la expresión de genes
putativos que codifican para β-xilosidasas no sigue el mismo patrón en los frutos
de las distintas especies analizados hasta la fecha. Durante la maduración, la
actividad β-xilosidasa se incrementa en pera (Itai y col., 1999), disminuye en
tomate (Itai y col., 2003), y se incrementa y luego disminuye en palta (Ronen y
col., 1991). Con respecto a la expresión de genes putativos que codifican para βxilosidasas, durante la maduración de tomate la expresión de LeXyl1 se
incrementa mientras que los niveles de transcripto de LeXyl2 disminuyen (Itai y
col., 2003). En pera y durazno, la mayor acumulación de ARNm se produce hacia
el final de la maduración (Itai y col., 1999; Bounaris y Niavis, 1992). En el caso
de frutilla, el patrón de actividad enzimática cambia dependiendo de la variedad
analizada: la actividad β-xilosidasa es máxima en el estadio 50% R en Selva
(Martínez y col., 2004) y en el estadio B en Camarosa. En el caso de Toyonoka, se
observan dos máximos de actividad, uno en el estadio B y otro, más notorio,
hacia el final de la maduración en frutos 100% R. La expresión de FaXyl1
también depende de la variedad analizada.
Para establecer de manera más precisa la localización de FaXyl1 y de la
actividad enzimática en frutos de la variedad Toyonoka, se dividió el tejido del
receptáculo en dos zonas diferentes, externa e interna. La actividad β-xilosidasa
se detectó mayormente en el tejido interno del fruto en todos los estadios de
maduración analizados. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas
en los niveles de ARNm y proteína de FaXyl1 entre ambos tejidos, sugiriendo que
otras proteínas con actividad β-xilosidasa serían responsables de la mayor
75
actividad enzimática encontrada en el tejido interno.
La maduración de frutilla está asociada con una reducción en el contenido
de hemicelulosas (Koh y Melton, 2002; Rosli y col., 2004). Varios genes que
codifican para endoglucanasas se expresan a niveles elevados en frutos de
frutilla maduros (Harpster y col., 1998; Llop-Tous y col., 1999; Trainotti y col.,
1999; Woolley y col., 2001), indicando su posible rol en la degradación de
xiloglucanos. Además de los xiloglucanos, las plantas dicotiledóneas poseen
pequeñas cantidades de otras hemicelulosas, incluyendo los β-1,4-xilanos. A
pesar de que la cantidad de xilanos no ha sido directamente determinada en la
pared celular de frutos de frutilla, se ha reportado una elevada relación
xilosa:glucosa en la fracción de hemicelulosas (Huber, 1984; Nogata y col., 1996;
Koh y Melton, 2002), sugiriendo la presencia de polímeros conteniendo xilosa. En
la pared celular de frutilla, la cantidad de xilosa es mayor en la fracción de
hemicelulosas que en la fracción de pectinas, aunque la presencia de
xilogalacturonanos no debe descartarse. En frutos de manzana (otro miembro de
la familia de las Rosaceae), Schols y col. (1995) demostraron la presencia de
estos compuestos y reportaron que residuos simples de β-xilosa podían ser
liberados del esqueleto del xilogalacturonano por tratamiento del mismo con una
β-xilosidasa de origen fúngico. Estos datos sugieren que tanto los xilanos como
los xilogalacturonanos podrían ser blancos para la acción de las β-xilosidasas.
En la región promotora de FaXyl1, se identificaron elementos reguladores
asociados con respuestas a hormonas, luz y estrés. La presencia de estos
elementos reguladores en cis indica que el gen FaXyl1 podría estar regulado
tanto por factores fisiológicos endógenos (hormonas) como por factores
provenientes del medio ambiente (luz y estrés). Con el fin de probar la función
fisiológica de los elementos en cis reguladores asociados con las respuestas a
hormonas, estudiamos la expresión y los niveles de proteína de FaXyl1 bajo
distintos tratamientos exógenos. Los mismos incluyeron hormonas identificadas
en la región promotora de FaXyl1 (auxinas, giberelinas, ABA y SA) así como
también reguladores del crecimiento posiblemente involucrados en el proceso de
maduración del fruto (etileno y NO).
Está ampliamente aceptado que el crecimiento y la maduración de frutilla
son procesos regulados por las auxinas producidas en los aquenios (Given y col.,
1988). Las auxinas estimulan la expansión del receptáculo durante el desarrollo
del fruto, y más tarde inhiben la maduración del mismo (Given y col., 1988;
Manning, 1994). Cuando el fruto madura, la disminución en los niveles de
76
auxinas activa la expresión de varios genes relacionados con el proceso de
maduración (Manning, 1994). Cuando analizamos la región promotora de
FaXyl1, encontramos un elemento en cis de respuesta a auxinas (AuxRR-core) en
la posición -443, con respecto al codón de inicio de la traducción, que consiste de
una secuencia de 7 pb (GGTCCAT). Para evaluar la posible regulación de FaXyl1
por auxinas, estudiamos la expresión del gen en frutos tratados y control. El
tratamiento con auxinas sintéticas (NAA) produjo un retraso en la maduración,
así como también una menor actividad β-xilosidasa y menor acumulación de
transcripto y proteína de FaXyl1 con respecto al control. Previamente,
observamos que durante la maduración de frutos de Camarosa sólo se produce
un leve incremento en la expresión del gen en los estadios más avanzados, donde
los niveles de auxinas son probablemente muy bajos. Nuestros resultados
estarían indicando que las auxinas reprimen la expresión de FaXyl1 y provocan
una disminución en los niveles de la proteína como se ha observado para otros
genes de frutilla involucrados en la degradación de la pared celular, tales como
pectato liasa (Medina-Escobar y col., 1997), endo β-1,4-glucanasa (Trainotti y
col., 1999), poligalacturonasa (Redondo-Nevado y col., 2001) y β-galactosidasa
(Trainotti y col., 2001). Una metodología efectiva para analizar el efecto de las
auxinas endógenas es la remoción de los aquenios. El deaquenado de frutos de la
variedad Selva provoca un marcado incremento en la velocidad de maduración
con respecto al control, indicando que la remoción de los aquenios, fuente de
auxinas endógenas, es efectiva (Martínez y col., 2004; Villarreal y col., 2008). Sin
embargo, en nuestro caso, la eliminación de los aquenios en frutos de la variedad
Camarosa no condujo a resultados análogos. En Camarosa no se detectaron
diferencias en el contenido de antocianinas entre la mitad deaquenada y la mitad
intacta de los frutos. Análogamente, la expresión del gen FaCel1, fuertemente
influenciado por auxinas (Harpster y col., 1998), tampoco se vio afectada por este
tratamiento. De este modo, no fue posible estudiar el efecto de auxinas
endógenas sobre la expresión de FaXyl1 probablemente debido al daño producido
durante la remoción de los aquenios. Contrario a lo observado en la variedad
Selva, donde la remoción de los aquenios produce un marcado incremento en los
niveles de transcripto de FaXyl1 (Martínez y col., 2004), el deaquenado de frutos
de Camarosa dio como resultado una disminución en los niveles de ARNm y
proteína de FaXyl1 con respecto al control. Probablemente, el daño causado por
la remoción de los aquenios conduce a la síntesis de etileno, como habitualmente
ocurre en todo tejido vegetal que sufre una lesión. Este etileno producido, al
77
presentar un efecto negativo sobre la expresión de FaXyl1, contrarrestaría la
desrepresión del gen causada por la ausencia de auxinas, dando como resultado
una menor acumulación de transcripto y proteína de FaXyl1 en la mitad
deaquenada con respecto al control.
En trabajos anteriores, se evaluaron los efectos de las giberelinas sobre la
maduración de frutilla a través de diferentes parámetros bioquímicos. El
tratamiento exógeno del fruto con GA3 en distintas etapas de la maduración
produjo la inhibición de la maduración, evidenciado por una disminución en la
actividad respiratoria y un retardo en la síntesis de antocianinas y la degradación
de clorofilas (Martínez y col., 1994). La región promotora de FaXyl1 contiene un
motivo GARE (elemento de respuesta a giberelinas) en la posición -266 con
respecto al codón de inicio de la traducción, que consiste de una secuencia de 7
pb (AAACAGA). Con el fin de evaluar el rol fisiológico de este elemento,
analizamos el efecto de la aplicación exógena de GA3 sobre la expresión del gen y
la actividad enzimática. Si bien no se observaron diferencias significativas en la
actividad β-xilosidasa, los frutos tratados con GA3 mostraron un leve retraso en
la acumulación de antocianinas y una ligera disminución en los niveles de ARNm
y proteína de FaXyl1 con respecto al control. Nuestros resultados están de
acuerdo con lo observado por Martínez y col. (1994) e indican que GA3 no sólo
reprime la maduración, sino también la expresión de FaXyl1.
El tratamiento con ABA puede estimular la maduración de muchos frutos
(Jiang y Joyce, 2003). En frutos climatéricos, tales como tomate y manzana, la
estimulación de la maduración se atribuye principalmente a un aumento en la
síntesis de etileno que ocurriría luego de la aplicación de ABA (Bruesa y Vendrell,
1989; Riov y col., 1990). En frutilla, un fruto no-climatérico, el tratamiento con
ABA acelera el desarrollo de color y estimula la maduración del fruto por medio
de un aumento en la producción de etileno y un aumento de la actividad
fenilalanina amonio-liasa (PAL), una enzima clave en la síntesis de antocianinas
(Jiang y Joyce, 2003). En nuestro caso, el tratamiento con ABA estimuló la
acumulación de antocianinas, incrementó los niveles de transcripto y proteína de
FaXyl1, pero no produjo cambios en la actividad β-xilosidasa. Cuando
analizamos la región promotora del gen, identificamos un sitio ABRE, elemento
en cis involucrado en las respuestas a ABA. Este elemento se encuentra a -168
pb con respecto al codón de inicio de la traducción y consiste de un motivo de 6
pb con la secuencia TACGTG. Aunque hasta la fecha no hemos realizado el
análisis funcional de la región promotora de FaXyl1, la presencia del sitio
78
regulador ABRE junto con los resultados obtenidos en los análisis de northern y
western blot, estarían indicando que el promotor de FaXyl1 es capaz de
responder a ABA.
Numerosos estudios se han realizado con el fin de dilucidar el rol del
etileno en la maduración de frutos no-climátericos. En el caso de frutilla, los
resultados obtenidos en diferentes laboratorios son contradictorios, no pudiendo
establecerse aún una clara correlación entre los niveles de etileno y la
maduración del fruto (Manning, 1994). De hecho, el tratamiento de frutillas de la
variedad Brighton con inhibidores de etileno (sales de plata, norbornadieno,
aminoetoxivinilglicina) no alteraron la maduración (Given y col., 1988). Sin
embargo, frutillas de las variedades G-3 y G-4 expuestas a etileno se ablandaron
más rápido que aquellas almacenadas en una atmósfera libre de la hormona (ElKazzaz y col., 1983). En este trabajo, frutos tratados con etefón mostraron un
mayor nivel en el contenido de antocianinas con respecto al control. Sin
embargo, los niveles de ARNm y de proteína de FaXyl1 disminuyeron luego de
dos días de tratamiento y no se observaron cambios en la actividad β-xilosidasa.
Para confirmar nuestros resultados, decidimos realizar un tratamiento con 1MCP, sustancia que se une en forma prácticamente irreversible al receptor de
etileno bloqueando la acción del mismo. Frutos tratados con 1-MCP mostraron
un claro retraso en la maduración y un incremento en los niveles de ARNm y
proteína de FaXyl1 con respecto al control. Como en el caso del tratamiento con
etefón, no se observaron efectos sobre la actividad enzimática. Aunque no se
identificaron elementos de respuesta a etileno en la región promotora del gen, los
resultados obtenidos sugieren que esta hormona tendría un efecto regulador
negativo sobre la expresión de FaXyl1. Esta observación resulta llamativa dado
que en diversos sistemas se ha descrito que la expresión de la mayoría de los
genes asociados con la degradación de la pared celular es estimulada por etileno
(Hayama y col., 2006). Sin embargo, en frutillas, una inhibición similar por
acción del etileno se describió para FaPE1, un gen que codifica para una pectin
metilesterasa relacionada al metabolismo de pectinas (Castillejo y col., 2004). Los
autores encontraron que FaPE1 es reprimido por etileno y que este hecho podría
estar involucrado en los cambios de textura que ocurren durante la senescencia
de los frutos.
Se ha sugerido que el aumento en la velocidad de maduración y coloración
de frutos tratados con ABA se debe a una acción mediada por etileno (Vendrell,
1985). Sin embargo, en relación a la expresión de FaXyl1, los resultados
79
obtenidos en los tratamientos con ABA y etefón no concuerdan con este hecho ya
que ABA no sólo estimuló la maduración, sino también la expresión de FaXyl1.
De esta manera, es posible que la estimulación de la expresión de FaXyl1 por
ABA se deba a un proceso independiente de etileno.
El NO ha sido descrito como un importante mensajero secundario en
células animales y abundante evidencia sugiere que también sería importante en
las células vegetales (Beligni y Lamattina, 2001). Se ha propuesto que la emisión
de óxido nítrico está negativamente relacionada con la producción de etileno en
el proceso de maduración y senescencia de los frutos (Leshem y Wills, 1998). Por
ejemplo, en frutos de frutilla (no-climatérico) y palta (climatérico) se ha
demostrado que el proceso de maduración está claramente acompañado por una
marcada disminución en los niveles de NO junto con un incremento en la
producción de etileno (Leshem y Pinchasov, 2000). La aplicación exógena de NO
extiende marcadamente la vida post-cosecha de frutilla (Zhu y Zhou, 2007). De
hecho, frutos de frutilla maduros tratados con SNP mostraron una marcada
inhibición en la producción de etileno, la velocidad de respiración y la actividad
ACC-sintasa. También se observó una disminución en el contenido de ACC,
mientras que la actividad ACC-oxidasa no se vio alterada (Zhu y Zhou, 2007). En
nuestro caso, por el contrario, se detectó un incremento en la acumulación de
antocianinas en frutos tratados con SNP con respecto al control. Esta
discrepancia con resultados previos podría deberse al uso de distintas variedades
y a la aplicación de la hormona en diferentes estadios de desarrollo. SNP no tuvo
efecto sobre la actividad enzimática y los niveles de transcripto y proteína de
FaXyl1 sugiriendo que el gen no sería regulado por NO. Hasta la fecha, este sería
el primer trabajo que estudia los efectos del NO sobre los niveles de expresión de
un gen relacionado con la degradación de pared celular.
El SA regula varios procesos en las plantas incluyendo la producción de
calor, resistencia a enfermedades, germinación de semillas y producción de
etileno (Zhang y col., 2003). Se ha demostrado que el SA y su derivado el ácido
acetilsalicílico (ASA) inhiben la producción de etileno en varias especies de
plantas (Leslie y Romani, 1988). En frutilla, el tratamiento con SA redujo la
producción de etileno y el decaimiento del fruto por el ataque de hongos
patogénicos e incrementó la vida post-cosecha del fruto (Babalar y col., 2007). En
nuestros ensayos, también observamos un claro retraso en la maduración de los
frutos tratados con respecto al control. Sin embargo, tanto la actividad βxilosidasa como los niveles de ARNm y proteína de FaXyl1 no se vieron afectados
80
por el tratamiento. Si bien encontramos un elemento TCA (involucrado en las
respuestas a ácido salicílico) en la región promotora de FaXyl1 (en la posición 430 con respecto al codón de inicio de la traducción), el mismo podría no ser
suficiente para lograr la regulación del gen por SA en frutilla. Similares
resultados se observaron durante el análisis funcional del promotor del gen PR2d (relacionado a la patogénesis) de tabaco, donde se observó que la presencia de
distintos elementos TCA no es ni necesaria ni suficiente para la regulación del
gen por SA (Shah y Klessig, 1996).
81
5.4. CONCLUSIONES
▪ La proteína codificada por FaXyl1 posee actividad β-xilosidasa contra
sustratos artificiales, demostrando que el producto de este gen es la enzima
mencionada.
▪ FaXyl1 sería sometida a un procesamiento post-traduccional (Cterminal).
▪ Hay una clara correlación entre la expresión, los niveles de proteína y la
actividad β-xilosidasa, y la velocidad de ablandamiento del fruto.
▪ La expresión del gen estaría bajo la influencia de hormonas implicadas
en el proceso de ablandamiento del fruto. Los niveles de transcripto y proteína de
FaXyl1 serían regulados positivamente por ABA y negativamente por NAA, GA3 y
etileno.
82
6. CAPÍTULO II
“Caracterización de la actividad β-xilosidasa en
tomate (Solanum lycopersicum). Análisis de su
expresión y regulación hormonal”
83
6.1. INTRODUCCIÓN
6.1.1. El fruto de tomate
El tomate, perteneciente a la familia de las Solanáceas, se ha convertido
en la planta modelo para el estudio del desarrollo y la maduración de frutos
climatéricos, principalmente debido a la gran disponibilidad de avanzadas
herramientas genéticas y moleculares. El corto tiempo de generación, la
presencia de mutaciones bien caracterizadas del proceso de maduración, una
extensa historia de investigaciones fisiológicas, bioquímicas y moleculares
relacionadas al desarrollo y la maduración del fruto, junto con el interés
comercial por la especie, han despertado un considerable esfuerzo por entender
el proceso de maduración en tomate (Barry y Giovannoni, 2007). En los últimos
años, los análisis moleculares de la maduración del fruto se han focalizado en
descubrir los roles de proteínas que metabolizan la pared celular (Goulao y
Oliviera, 2008), y la base genética de la síntesis de etileno (Alexander y Grierson,
2002).
El fruto de tomate se encuentra dentro del grupo de los frutos carnosos.
Está compuesto de una epidermis, un grueso pericarpio, y tejido placentario que
rodea a las semillas. El pericarpio proviene de la pared externa del gineceo, el
cual se compone de al menos dos carpelos (el número puede ser mucho mayor en
algunas variedades) (Figura 28).
Multilocular
Bilocular
Columela
Tejido
placentario
Epidermis
Semilla
Pericarpio
Figura 28. Los tomates pueden ser biloculares o multiloculares. La mayor parte de las
variedades cultivadas tienen 4 o 5 lóculos. Los lóculos están rodeados por el pericarpio.
Las semillas están localizadas dentro de la cavidad locular y se encuentran rodeadas por
la placenta.
84
El desarrollo del fruto de tomate puede dividirse en 4 fases (Figura 29). La
primera fase (fase I) involucra el desarrollo del ovario y la decisión de abortar o
proceder con el inicio de la división celular y el desarrollo del fruto (“fruit set”). En
la segunda fase (fase II) se produce el crecimiento del fruto, principalmente a
expensas de la división celular. La tercera fase (fase III) comienza después de que
la división celular ha cesado. Durante esta fase, continua el crecimiento del
fruto, mayormente debido a expansión celular, hasta que el mismo alcanza su
tamaño final. Esta etapa del crecimiento es la más visible y fisiológicamente
significativa debido a la fuerte acción de sumidero que ejercen las células en
expansión. El fin de esta fase se produce cuando el fruto alcanza el estadio verde
maduro (con semillas maduras) y se inicia la etapa de maduración (fase IV). El
ciclo de vida del fruto de tomate puede llevar entre 40 y 70 días desde la
fertilización hasta el estadio rojo maduro dependiendo de la variedad, el clima y
las prácticas de cultivo utilizadas (Gillaspy y col., 1993).
Auxinas
Giberelinas
Citoquininas
ABA
Etileno
Figura 29. Fases del desarrollo del fruto de tomate (A) y cambios hormonales (B). Los
cambios en los niveles de hormonas se indican con diamantes y el “fruit set” con una
doble flecha.
6.1.2. Degradación de la pared celular en tomate
La integridad de las células del fruto depende de la adhesión celular y de
la fuerza de la pared primaria. Estos aspectos influencian la textura del fruto y,
85
por lo tanto, la percepción del consumidor (Pitt y Chen, 1983). El desarrollo del
fruto de tomate está marcado por cambios significativos en los componentes de
la pared celular. En los últimos años, las enzimas que degradan polisacáridos de
pared han recibido mucha atención ya que la actividad de las mismas está
directamente relacionada a la vida post-cosecha del fruto, una de las
características
más
importantes
para
su
comercialización.
Durante
la
maduración de tomate se han encontrado prácticamente todos los cambios
fisicoquímicos descritos en pared celular. Se produce una intensa solubilización
y
depolimerización
de
pectinas,
así
como
también
depolimerización
de
hemicelulosas (Brummell y Harpster, 2001).
Entre las enzimas de pared que modifican pectinas e incrementan su
actividad durante la maduración de tomate, encontramos a: PG (Smith y col.,
1990), PME (Harriman y col., 1991) y β-Gal (Carey y col., 1995). Indudablemente,
la enzima de pared más estudiada en este fruto ha sido endo-PG. Tanto su
actividad como el nivel de ARNm se incrementan dramáticamente durante la
maduración del fruto (DellaPenna y col., 1986). Sin embargo, a pesar de que la
supresión
de
PG
por
medio
de
la
tecnología
antisentido
inhibe
la
depolimerización de poliurónidos, no se observa una reducción significativa del
ablandamiento, sugiriendo que este proceso no es suficiente por si solo para
provocar el ablandamiento del fruto, o que hay algún otro factor involucrado
(Brummell y Harpster, 2001). En tomate, la pérdida de galactosa a partir de
polímeros de pared, principalmente pectinas, se incrementa con la maduración
del fruto (Gross, 1984; Seymour y col., 1990). Si bien tres isoformas de β-Gal
han sido identificadas en frutos de tomate (I, II y III), sólo la actividad β-Gal II es
activa contra polímeros ricos en (1→4)-β-D-galactano preparados a partir de
paredes celulares de tomate (Pressey, 1983). Asimismo, la actividad β-Gal II
aumenta durante la maduración del fruto (Pressey, 1983). La supresión de la
expresión de β-Gal II por medio de la tecnología antisentido produjo frutos más
firmes y dio lugar a una reducción de la actividad exo-galactosidasa y al
incremento en el contenido de residuos de galactosa de la pared celular en frutos
antisentido con respecto al control, sugiriendo un rol de la enzima en el
ablandamiento del fruto (Smith y col., 2002). El grado de metil-esterificación de
las pectinas disminuye desde un 90% en el estadio verde maduro a un 35% en
frutos rojos (Koch y Nevins, 1989). La actividad enzimática responsable de este
proceso, PME, forma parte de una familia multigénica que incluye al menos
cuatro genes altamente homólogos (Ray y col., 1988). La supresión de la
86
actividad PME reduce la depolimerización de pectinas, mientras que no afecta el
ablandamiento del fruto (Tieman y col., 1992).
En tomate se han identificado al menos diez genes que codifican para
expansinas. Uno de ellos, LeExp1, se expresa abundantemente a lo largo de la
maduración y es específico de fruto. La represión de este gen en tomate causa un
retraso en el ablandamiento, mientras que su sobreexpresión da lugar a frutos
más blandos, sugiriendo que LeExp1 contribuye significativamente al proceso de
ablandamiento del fruto (Giovannoni, 2001).
Dos enzimas que participan de la degradación de hemicelulosas y que han
sido ampliamente estudiadas en tomate son xiloglucano endotransglicosilasa
(XET) y endoglucanasa (EGasa). La actividad de ambas enzimas aumenta
durante la maduración del fruto, aunque EGasa disminuye en frutos maduros
(Brummell y Harpster, 2001). Las EGasas de tomate forman parte de una familia
multigénica cuyo rol en la degradación de la pared celular no es claro (Brummell
y col., 1999). La supresión antisentido de LeCel1 o LeCel2, EGasas específicas de
fruto, no alteró el ablandamiento. Sin embargo, es probable que exista
redundancia de función entre los distintos productos génicos, y que sea
necesario suprimir múltiples EGasas para observar cambios fenotípicos. En
tomate se han clonado dos genes de XET: LeEXGT1, que se expresa en frutos
verdes, y LeXETB1, que se expresa durante la maduración y sería responsable de
la actividad XET observada hasta la fase rojo maduro. Sin embargo, el rol de la
actividad XET en el ablandamiento del fruto no ha sido aún claramente
establecido (Brummell y Harpster, 2001).
6.1.3. Actividad β-xilosidasa en tomate
La pared celular del pericarpio interno y externo del fruto de tomate
contiene predominantemente arabinosa y xilosa (Huysamer y col., 1997). La
estructura química de los arabinoxilanos y xilanos está sujeta a modificaciones
durante el crecimiento y desarrollo de las plantas, incluyendo la germinación de
las semillas y el desarrollo y la maduración del fruto (Itai y col., 2003). Las βxilosidasas son responsables de la hidrólisis de los arabinoxilanos y xilanos
liberando residuos de β-D-xilosa. En la variedad Ailsa Craig, la actividad βxilosidasa es alta durante el desarrollo temprano del fruto, disminuyendo a lo
largo del desarrollo tardío y la maduración (Itai y col., 2003). En esta variedad, se
clonaron dos genes que codifican para β-xilosidasas, LeXyl1 y LeXyl2. Éste
87
último se expresa de manera abundante durante el desarrollo del fruto y
disminuye cuando comienza la maduración. En contraste, LeXyl1 no se expresa
durante el desarrollo del fruto, sino que es detectado en estadios avanzados de la
maduración, especialmente en frutos sobremaduros. El análisis de expresión de
LeXyl1 y LeXyl2 en líneas mutantes de tomate sugiere que los genes son
regulados diferencialmente durante el desarrollo y la maduración del fruto. Por
otro lado, estudios realizados con 1-MCP sobre frutos maduros indican que la
expresión de ambas isoenzimas sería independiente de etileno (Itai y col., 2003).
6.1.4. Regulación hormonal en tomate
Las hormonas vegetales (auxinas, citoquininas, giberelinas, ABA y etileno)
regulan el desarrollo y la maduración del fruto (Nitsch, 1970).
En frutos de tomate inmaduro se han detectado altos niveles de
giberelinas (Koornneef y col., 1990). Las giberelinas podrían estar implicadas en
la antesis y en la estimulación del desarrollo del fruto y la semilla (Rebers y col.,
1999). Los niveles de GA1 y GA20, consideradas las giberelinas más relevantes
debido a su rol fisiológico, son altos en el pericarpio y las semillas. La actividad
giberelina en tomate sigue un patrón bimodal, coincidiendo ambos picos con la
fase de división (fase II) y expansión celular (fase III) del desarrollo del fruto
(Figura 29). El tratamiento exógeno de frutos de tomate con ácido giberélico
produce un retraso en el progreso de algunos aspectos de la maduración, tales
como el desarrollo de color y algunos de los cambios estimulados por el etileno
(Dostal y Leopold, 1967). La disminución en los niveles de giberelinas se produce
antes del pico de producción de etileno, sugiriendo que las mismas podrían
regular de manera antagónica al etileno durante el proceso de maduración del
fruto (Sozzi y col., 2002).
La presencia de auxinas en el polen, su producción en el estilo y el ovario
acompañando el crecimiento y la fertilización del tubo polínico, y la estimulación
del crecimiento del ovario junto con la producción de frutos partenocárpicos por
aplicación exógena de auxinas, indican una función de estas hormonas durante
la fase I de desarrollo del fruto, particularmente hacia el final de la misma en que
se produce el establecimiento del fruto (“fruit set”) (Crane, 1964). Además, el
patrón bimodal de actividad hormonal sugiere que las auxinas tienen un rol
importante al comienzo de la expansión celular (fase III) y al final del desarrollo
del embrión (fase IV) (Figura 29). Se ha propuesto que las auxinas estimulan la
88
expansión celular en el fruto causando un incremento en la extensibilidad de la
pared (Gillaspy y col., 1993).
Estudios
de
radioinmunoensayo
demostraron
que
los
niveles
de
citoquininas son elevados cinco días después de la antesis, siendo superiores en
las semillas en comparación con el pericarpio (Figura 29). La correlación entre el
número de células y los niveles de citoquininas en frutos de tomate jóvenes
sugiere un rol en la división celular (fase II). Los niveles de citoquininas
disminuyen durante la maduración, alcanzando el nivel más bajo en frutos
maduros, lo cual sugiere un rol menor de las mismas durante la maduración de
tomate (Gillaspy y col., 1993).
Los niveles de ABA comienzan a detectarse cinco días después de la
polinización, aumentando en la semilla y el pericarpio hasta alcanzar un pico en
la fase de expansión celular (fase III) (Figura 29). La concentración de ABA en los
lóculos regula la desecación de las semillas y previene la germinación precoz,
jugando un rol en la maduración de las mismas (Berry y Bewley, 1991). La
inducción de la maduración del fruto de tomate por la aplicación exógena de
ABA, así como la determinación de sus niveles endógenos, apoyan la idea de que
ABA tendría, además, un rol adicional en la maduración del fruto (Mizrahi y col.,
1975).
Los frutos climatéricos se distinguen de los no-climatéricos por la
presencia de un pico en la producción de etileno y en la respiración durante la
maduración. Usando el tomate como sistema modelo, ha sido ampliamente
demostrado que el pico de producción de etileno es necesario para que se
produzca la maduración normal de los frutos climatéricos. Si bien el etileno es la
hormona clave, la expresión de genes relacionados al proceso de maduración
está regulada tanto por caminos dependientes como independientes del etileno
(Alexander y Grierson, 2002). La producción de etileno en las plantas es
generada a través de dos sistemas (Figura 30). El sistema 1 funciona durante el
crecimiento vegetativo, es auto-inhibitorio y es el responsable de producir niveles
basales de etileno, los cuales son detectados en todos los tejidos, incluyendo los
frutos no-climatéricos. El sistema 2 opera durante la maduración de frutos
climatéricos y la senescencia de pétalos, procesos en los cuales la producción de
etileno es auto-catalítica. El etileno es sintetizado a partir de metionina en tres
pasos: (1) conversión de metionina en S-adenosil-L-metionina (SAM) por acción
de la enzima SAM sintetasa, (2) formación de ácido 1-aminociclopropano-1carboxílico (ACC) a partir de SAM vía la actividad ACC-sintasa (ACS), y (3)
89
conversión de ACC a etileno por la actividad ACC-oxidasa (ACO). Las enzimas
ACS y ACO son codificadas por familias multigénicas, siendo la expresión de las
mismas regulada por señales del desarrollo, del medio ambiente y hormonales
(Alexander y Grierson, 2002). LeACS1A y LeACS6, dos miembros de la familia
génica ACS, regulan la producción de etileno en el sistema 1. Se ha sugerido que
un cambio en la sensibilidad a los niveles basales de etileno producidos por el
sistema 1 resulta en la transición al sistema 2. Durante el periodo de transición,
se incrementa la expresión de LeACS1A y se induce la expresión de LeACS4,
dando lugar a una mayor producción de etileno y a la inducción de la expresión
de LeACS2. Como resultado, se produce una disminución de la expresión de
LeACS1A y LeACS6 por regulación negativa sobre el sistema 1 (Barry y col.,
2000). LeACO1, LeACO3 y LeACO4 son expresados a niveles bajos en frutos
verdes (sistema 1), mientras que los niveles de cada uno de los transcriptos
aumentan al comienzo de la maduración (sistema 2). Durante la maduración, la
expresión de LeACO1 y LeACO4 se mantiene en el tiempo, mientras que el
incremento en la expresión de LeACO3 es transitorio (Barry y col., 1996).
LeACS2, 4
LeACO1, 4
LeACS1A, 6
C2H4
LeACO1, 3, 4
Sistema 1
Sistema 2
C2H4
C2H4
Fs
1 cm
2 cm
VM
V
A
M
Figura 30. Expresión diferencial de los genes ACS y ACO asociada con la síntesis de
etileno (C2H4) en los sistemas 1 y 2 durante el desarrollo y la maduración de tomate. Fs:
fruit set, VM: verde maduro, V: virado, A: anaranjado, M: rojo maduro.
En los últimos años, se han identificado nuevos componentes del camino
90
de transducción de señales mediado por etileno, así como también nuevos
factores de transcripción que regularían la producción de etileno relacionada con
el proceso de maduración de tomate (Giovannoni, 2007). Como se indica en la
Figura 31, los factores de transcripción LeMADS-RIN y CNR-SPB son necesarios
para controlar la maduración dependiente e independiente de etileno, mientras
que NR (receptor de etileno) y la proteína GR (mantiene la homeostasis cobrereceptor) estarían involucrados en la transducción de señales mediada por dicha
hormona.
¿Otros LeMADS
implicados?
LeMADS-RIN, CNR
Síntesis autocatalítica de etileno
ETILENO
(Transducción de señales)
Regulación
independiente
de etileno
NR, GR
Maduración
Figura 31. Control de la maduración en tomate. Otros genes MADS-box que se expresan
durante la maduración del fruto podrían estar implicados en el control de la
transcripción relacionada con la maduración.
6.1.5. Mutantes de tomate y línea ACC-sintasa antisentido
La maduración en frutos climatéricos está regulada por caminos
dependientes e independientes de etileno (Adams-Phillips y col., 2004a;
Giovannoni, 2004). La evidencia del rol de un camino independiente de etileno
que regula la maduración proviene de la caracterización de mutantes de tomate,
tales como rin (ripening-inhibitor) y nor (non-ripening), en los cuales la maduración
está severamente disminuida (Barry y col., 2005). Estos mutantes no producen
un pico en la producción autocatalítica de etileno y muestran inhibición en la
expresión de genes relacionados a la maduración. La expresión génica, pero no la
91
maduración, puede ser parcialmente restaurada por la aplicación exógena de
etileno, indicando que los mismos son sensibles a la hormona (Figura 32).
Aunque la síntesis de etileno está bloqueada en estos mutantes, estudios
realizados en tomates rin y nor indican que los mismos retienen la capacidad de
sintetizar etileno en respuesta a heridas, indicando que las mutaciones no son
simplemente el resultado de un bloqueo en la síntesis de etileno (Lincoln y
Fischer, 1988; Yokotani y col., 2004). El locus rin posee una deleción entre dos
genes MADS-box, uno de ellos llamado LeMADS-RIN, responsable de conferir el
fenotipo deficiente en la maduración, y el otro LeMADS-MC, asociado con el
fenotipo macrocáliz (sépalo grande) (Vrebalov y col., 2002). Si bien ha sido
demostrado que nor codifica para un factor de transcripción, no perteneciente a
la familia MADS-box, el mecanismo molecular por el cual actúa el mismo es aún
desconocido (Carrari y Fernie, 2006).
Salvaje
rin
nor
Nr
Figura 32. Mutantes de la maduración del fruto de tomate. De izquierda a derecha: fruto
maduro silvestre (variedad Ailsa Craig), y líneas homocigotas casi isogénicas para los loci
ripening-inhibitor (rin), non-ripening (nor) y Never-ripe (Nr).
El mutante Never-ripe (Nr), identificado por su insensibilidad a etileno, fue
descrito 50 años atrás como un fruto que no madura (Figura 32) (Rick y Butler,
1956). El locus Nr codifica para un receptor de etileno con homología al receptor
ETR1 de Arabidopsis. El gen Nr presenta una mutación en el dominio de unión a
etileno en el mutante Nr. Los frutos del mutante Nr producen etileno durante la
maduración, pero la expresión de genes relacionados con este proceso es
reducida y no puede ser restaurada por la aplicación exógena de etileno,
92
indicando que la base fisiológica de la inhibición de la maduración se debe a una
disminución en la sensibilidad a la hormona (Lanahan y col., 1994; Wilkinson y
col., 1995).
ACC-sintasa (ACS) es la enzima que limita la velocidad de reacción en el
camino de síntesis de etileno (Yang y Hoffman, 1984). LeACS2 y LeACS4 son
genes que codifican para la ACS y que se expresan durante la maduración del
fruto de tomate. La expresión del ARN antisentido de LeACS2 inhibe la expresión
de ambos genes, LeACS2 y LeACS4 (Oeller y col., 1991). De esta manera, los
frutos de la línea ACS antisentido (ACSas) producen niveles muy bajos de etileno
(menores al 0,5% de los niveles normales) y sólo maduran con la aplicación
exógena de la hormona.
Si bien muchas de las enzimas que degradan la pared celular durante la
maduración del fruto de tomate han sido extensivamente estudiadas (tales como
PG, PME y β-Gal), es muy escasa la información disponible referente al
metabolismo de los xilanos. En este capítulo, caracterizamos la actividad βxilosidasa y los niveles de ARNm de LeXyl1 y LeXyl2 durante la maduración de
distintas variedades de tomate, incluyendo las líneas mutantes rin, nor y Nr, y
una línea ACSas. También analizamos el efecto del etileno y otros reguladores del
crecimiento sobre la actividad β-xilosidasa y los niveles de transcripto de LeXyl1
y LeXyl2 con el fin de establecer la posible regulación hormonal durante el
proceso de maduración del fruto.
93
6.2. RESULTADOS
6.2.1. Actividad β-xilosidasa durante la maduración
Con el fin de estudiar la actividad β-xilosidasa durante la maduración de
tomate, se midió la misma en frutos de las variedades Rutgers (silvestre y las
líneas mutantes rin, nor y Nr) y VF36 (silvestre y una línea antisentido para la
ACS (ACSas)) 48 y 56 días post-antesis (DPA). En las líneas silvestres (VF36 y
Rutgers), los frutos 48 y 56 DPA corresponden a los estadios VM y M,
respectivamente. Debido a que las líneas mutantes y antisentido no maduran,
las comparaciones de actividades enzimáticas y niveles de transcriptos entre los
frutos silvestres, mutantes y antisentido se realizaron a la misma edad
cronológica, días post-antesis, y no a la misma fase del desarrollo (Brummell y
Harpster, 2001).
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
8
48 DPA
56 DPA
6
4
2
0
Silvestre
ACSas
Silvestre
VF36
rin
nor
Nr
Rutgers
Figura 33. Actividad β-xilosidasa durante la maduración de frutos de tomate silvestres
(VF36 y Rutgers), mutantes (rin, nor y Nr) y ACS-antisentido (ACSas). Cada barra
representa la media ± la desviación estándar.
94
Como se observa en la Figura 33, la actividad β-xilosidasa disminuyó
durante la maduración de todas las variedades y líneas de tomate analizadas. En
el caso de la variedad VF36, la actividad enzimática fue superior en la línea
antisentido, con respecto a la línea silvestre, en el estadio VM, mientras que se
observa el efecto opuesto en el estadio M. En la variedad Rutgers, la actividad βxilosidasa es menor en las líneas mutantes con respecto a la línea silvestre en
ambos estadios de maduración.
6.2.2. Expresión de LeXyl1 y LeXyl2 durante la maduración
El análisis de expresión de ambos genes se intentó mediante la técnica de
northern blot. Dado que no se logró detectar los transcriptos de LeXyl1 y LeXyl2,
probablemente debido a su bajo nivel de expresión, se decidió utilizar la técnica
de RT-PCR semicuantitativa con el fin de estudiar los niveles de expresión de
ambos genes durante la maduración de las variedades y líneas de tomate
seleccionadas. La identidad de los productos de amplificación correspondientes a
LeXyl1, LeXyl2 y ARNr 17S se confirmó por clonado de los mismos en el plásmido
TOPO TA Cloning Vector y posterior secuenciado.
A
DP
56
48
DP
A
A
Nr
DP
A
DP
48
DP
56
A
DP
nor
A
rin
48
M
VM
DP
56
DP
48
M
VM
Silvestre
A
ACSas
A
Silvestre
Rutgers
56
VF36
LeXyl1
LeXyl2
ARNr 17S
Figura 34. RT-PCR semicuantitativa de LeXyl1 y LeXyl2 durante la maduración de frutos
de tomate silvestres (VF36 y Rutgers), mutantes (rin, nor y Nr) y ACS-antisentido (ACSas).
Se utilizó ARNr 17S como control de carga.
95
Como se muestra en la Figura 34, los niveles de ARNm de LeXyl1 se
incrementan durante la maduración en las líneas silvestres. Por el contrario, en
frutos 56 DPA de la línea ACSas y los mutantes rin, nor y Nr se observó una
disminución en los niveles de este transcripto con respecto a frutos 48 DPA
Respecto al otro gen, los niveles de transcripto de LeXyl2 disminuyen durante la
maduración de las variedades silvestres y en frutos 56 DPA de la línea
antisentido y los mutantes rin y Nr. En el mutante nor no se detectaron
diferencias en los niveles de ARNm entre ambos estadios (Figura 34).
6.2.3. Análisis por cromatografía de exclusión molecular
Se realizó el análisis cromatográfico en columnas de Sephacryl S-100 de
extractos de pericarpio obtenidos a partir de frutos 48 y 56 DPA. En la Figura 35
se muestra el perfil de elución de un extracto proteico obtenido a partir de frutos
silvestres VF36 en estadio VM.
V0
1
2
34
0,020
0,16
0,14
Act β-Xil (nmol min-1)
0,015
0,12
0,10
0,010
0,08
0,06
0,005
DO280nm
Actividad β-Xil (nmol min-1)
DO280nm
0,04
0,02
0,000
0,00
-0,005
0
20
40
60
80
Nº Fracción
Figura 35. Perfil de elución de la actividad β-xilosidasa después de la cromatografía de
exclusión molecular en una columna Sephacryl S-100. El extracto proteico se preparó a
partir de frutos silvestres VF36 en estadio VM. El pico de elución se corresponde
aproximadamente con una masa molecular de 66 kDa (pico de elución de la albúmina).
96
Un único pico de actividad β-xilosidasa fue detectado, el cual se
corresponde aproximadamente con el pico de elución de la albúmina (66 kDa). El
mismo patrón de elución fue obtenido para todas las variedades y líneas de
tomate analizadas en ambos estadios de maduración (datos no mostrados).
6.2.4. Efecto de hormonas sobre la actividad β-xilosidasa y la expresión de LeXyl1
y LeXyl2
Se analizó el efecto de distintos reguladores del crecimiento sobre la
actividad β-xilosidasa y la expresión de LeXyl1 y LeXyl2. A tal fin, se utilizó el
sistema de discos de pericarpio de tomate descrito previamente (Campbell y col.,
1990) sobre frutos silvestres de la variedad VF36 en estadio VM. Los discos (13
mm de diámetro) se esterilizaron superficialmente y se incubaron con soluciones
conteniendo distintos reguladores de crecimiento, manteniendo simultáneamente
controles sin tratar. En cada caso, se determinó el contenido de clorofila total
para evaluar el progreso de la maduración.
6.2.4.1. Etileno
Con el fin de analizar el efecto del etileno sobre la actividad β-xilosidasa y
los niveles de expresión de LeXyl1 y LeXyl2, discos de tomate silvestres en
estadio VM se trataron durante 2 días con etefón 100 ppm. Los discos tratados
mostraron una disminución en el contenido de clorofila total y la actividad βxilosidasa con respecto al control (Figuras 36 A y B). Asimismo, dicho
tratamiento produjo un aumento en los niveles de transcripto de LeXyl1 y LeXyl2
(Figura 36 C).
6.2.4.2. Auxinas y giberelinas
Los discos tratados durante 2 días con NAA y GA3 no mostraron
diferencias significativas en el contenido de clorofila total con respecto a los
discos control (Figuras 37 A). Por otro lado, se observó una disminución en la
actividad β-xilosidasa en los discos tratados con NAA, mientras que no se
detectaron diferencias significativas luego del tratamiento con GA3 (Figura 37 B).
Los tratamientos con NAA y GA3 reprimieron la expresión de LeXyl1 y LeXyl2
(Figura 37 C).
97
B
Clorofila total (mg g-1)
0,025
0,020
***
0,015
0,010
0,005
0,000
C
C
5
*
4
3
2
1
0
Et
C
C
Et
LeXyl1
LeXyl2
ARNr
17S
A
Et
Figura 36. Efecto de etefón 100 ppm
sobre el contenido de clorofila total (A), la
actividad β-xilosidasa (B) y los niveles de
ARNm de LeXyl1 y LeXyl2 (C) en discos
de tomate VM. Se utilizó ARNr 17S como
control de
carga. Las
diferencias
estadísticas en el contenido de clorofila
total y la actividad β-xilosidasa entre
frutos tratados y control de acuerdo al
test t de Student se indican como: ***, P <
0,001 y *, P < 0,05.
B
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg-1)
0,025
Clorofila total (mg g-1)
-1
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg )
A
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
C
LeXyl1
LeXyl2
ARNr
17S
C
NAA
C
NAA
GA3
GA3
6
5
4
**
3
2
1
0
C
NAA
GA3
Figura 37. Efecto de NAA y GA3 0,1
mM sobre el contenido de clorofila
total (A), la actividad β-xilosidasa (B)
y los niveles de ARNm de LeXyl1 y
LeXyl2 (C) en discos de tomate VM.
Se utilizó ARNr 17S como control de
carga. Las diferencias estadísticas en
la actividad β-xilosidasa entre frutos
tratados y control de acuerdo al test
t de Student se indican como: **, P <
0,01.
98
6.2.4.3. Acido abscísico
Luego de 2 días, no se detectaron diferencias significativas en el contenido
de clorofila total ni en la actividad β-xilosidasa entre frutos tratados con ABA 0,1
mM y el control (Figuras 38 A y B). Los niveles de ARNm de LeXyl1 aumentaron
notoriamente en discos tratados con la hormona, mientras que los niveles de
transcripto de LeXyl2 se mantuvieron constantes (Figura 38 C).
A
B
-1
Aesp β-Xil (nmol min-1 mg )
Clorofila total (mg g -1)
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
C
C
C
LeXyl1
LeXyl2
ABA
ABA
6
5
4
3
2
1
0
C
ABA
Figura 38. Efecto de ABA 0,1 mM
sobre el contenido de clorofila total
(A), la actividad β-xilosidasa (B) y los
niveles de ARNm de LeXyl1 y LeXyl2
(C) en discos de tomate VM. Se
utilizó ARNr 17S como control de
carga.
ARNr
17S
99
6.3. DISCUSIÓN
La actividad β-xilosidasa y los niveles de expresión de LeXyl1 y LeXyl2 han
sido analizados por Itai y col. (2003) durante el desarrollo y la maduración de
frutos de tomate silvestre de la variedad Ailsa Craig. En dicho trabajo también
analizan la actividad enzimática y los niveles de ARNm de ambas isoenzimas en
frutos mutantes rin, nor y Nr en estadio M (definido como aquel en el que el fruto
alcanza la máxima madurez posible). En este trabajo de tesis ampliamos este
estudio analizando la actividad β-xilosidasa y los niveles de transcripto en
distintas variedades silvestres (VF36 y Rutgers), así como también en líneas
mutantes (rin, nor y Nr) y antisentido (ACSas) utilizando frutos de dos edades
diferentes (48 y 56 DPA, correspondientes a los estadios VM y M en frutos
silvestres). De esta manera, y en contraste al trabajo realizado por Itai y col.
(2003), las comparaciones de actividades enzimáticas y niveles de transcriptos en
los frutos silvestres, mutantes y antisentido se realizaron a la misma edad
cronológica y no a la misma fase del desarrollo (Brummell y Harpster, 2001).
En las líneas silvestres (VF36 y Rutgers) observamos una disminución en
la actividad β-xilosidasa durante la maduración, lo cual concuerda con los
resultados obtenidos por Itai y col. (2003) en la variedad Ailsa Craig. En
variedades de tomate silvestres, este comportamiento ha sido observado en otras
enzimas que participan en el metabolismo de la pared celular, tales como α-Larabinofuranosidasa (Itai y col., 2003) y β-manosidasa (Banik y col., 2001). Esto
indicaría que la actividad β-xilosidasa en tomate podría estar asociada a las
modificaciones de la pared celular que se producen durante el crecimiento del
fruto (fase III), más que a la degradación de la misma durante la maduración y el
ablandamiento (fase IV).
Dado que las enzimas que modifican la pared celular usualmente forman
parte de familias multigénicas, la actividad medida durante la maduración de los
frutos representa la suma total de las actividades de cada isoenzima (Brummell y
Harpster, 2001). En frutos de tomate se identificaron dos genes que codifican
para β-xilosidasa, LeXyl1 y LeXyl2 (Itai y col., 2003). En la variedad Ailsa Craig,
LeXyl1 sólo se expresa en las fases finales de la maduración (estadios M y sobremaduro), mientras que el ARNm de LeXyl2 se detecta fuertemente durante el
desarrollo temprano del fruto, disminuyendo a medida que la maduración
avanza. Los autores sugieren que la disminución en la actividad β-xilosidasa
observada durante el desarrollo y la maduración del fruto se debe a la suma de
100
las actividades de ambas isoenzimas (Itai y col., 2003). Si bien sólo detectamos
un pico de actividad β-xilosidasa por cromatografía de exclusión molecular, el
mismo podría ser el resultado de la contribución de distintas isoformas con masa
molecular semejante, o de la presencia de isoenzimas con masa molecular
distinta a 66 kDa pero con baja actividad, no detectable luego de diferentes pasos
de extracción y purificación. LeXyl1 tiene una masa molecular predicha de 83,2
kDa. El clon de ADNc de LeXyl2 está incompleto, y por lo tanto, la masa
molecular de la proteína sería superior a 68,9 kDa, predicha a partir del clon
parcial. Dado que el pico de elución obtenido corresponde a una masa molecular
de 66 kDa, LeXyl1 y LeXyl2 podrían sufrir una deleción del extremo C-terminal
durante la maduración del producto de traducción primario, tal como ocurre en
Arabidopsis thaliana, cebada y frutilla (Minic y col., 2004; Lee y col., 2003;
Bustamante y col., 2006). La falta de anticuerpos específicos nos impidió
confirmar en este trabajo de tesis la presencia de ambas isoenzimas en los frutos
analizados; sin embargo, la detección de los transcriptos correspondientes a
LeXyl1 y LeXyl2 llevada a cabo a través de la técnica de RT-PCR semicuantitativa
sugiere que las correspondientes isoenzimas estarían presentes en las líneas de
tomate seleccionadas.
Los frutos mutantes y antisentido colectados 48 DPA no presentaban
diferencias significativas en cuanto a tamaño, color y morfología con respecto a
los frutos silvestres en el estadio VM. Sin embargo, mientras que los frutos
silvestres alcanzaron el estadio M a los 56 DPA, los frutos mutantes y antisentido
no lo hicieron. Esto se debe a que los frutos mutantes rin y nor, junto con
aquellos provenientes de la línea ACSas, no son capaces de producir el pico de
síntesis de etileno necesario para que los frutos maduren, mientras que en el
caso de los frutos Nr, la inhibición de la maduración se debe a la disminución en
la sensibilidad a esta hormona. En estas líneas mutantes y antisentido también
observamos una disminución en la actividad β-xilosidasa con el tiempo.
Al igual que lo que ocurre en la variedad Ailsa Craig, los niveles de ARNm
de LeXyl1 se incrementaron durante la maduración en los frutos VF36 y Rutgers
silvestres. Por el contrario, los niveles de transcripto disminuyeron a los 56 DPA
en la línea antisentido y los mutantes rin, nor y Nr. Acorde a los resultados
obtenidos por Itai y col. (2003), observamos una disminución en los niveles de
transcripto de LeXyl2 durante la maduración de los frutos silvestres. Asimismo,
los niveles de ARNm de LeXyl2 disminuyeron a los 56 DPA en la línea antisentido
y los mutantes rin y Nr, y se mantuvieron constantes en el mutante nor con
101
respecto a frutos 48 DPA. Nuestros resultados sugieren que la actividad
enzimática medida durante la maduración de las variedades silvestres y las
líneas mutantes y antisentido no corresponde únicamente a la actividad de
ambas isoenzimas, sino que habría otras proteínas con actividad β-xilosidasa
implicadas. En este sentido, isoenzimas aún no identificadas podrían contribuir
a la actividad β-xilosidasa total. Además, la presencia de α-arabinofuranosidasas
(α-Af)
de
propiedades
catalíticas
bifuncionales
(β-xilosidasa
y
α-
arabinofuranosidasa) tal como fueron descritas en cebada y Arabidopsis thaliana
(Lee y col., 2003; Minic y col., 2004) no debe descartarse. En tomate, se han
identificado tres isoenzimas de α-Af (Sozzi et al., 2002) y se ha clonado un gen
que codificaría para una de ellas (Itai et al., 2003). Sin embargo, la actividad de
las mismas hacia el sustrato artificial p-nitrofenil-β-D-xilopiranósido no ha sido
ensayada hasta el momento.
El sistema de discos de pericarpio desarrollado por Campbell y col. (1990)
permite ensayar las respuestas de los frutos a niveles fisiológicos de reguladores
de crecimiento. En este trabajo de tesis, ensayamos el efecto de distintas
hormonas sobre la actividad β-xilosidasa y la expresión de LeXyl1 y LeXyl2 en
discos de tomate de la variedad VF36. Para preparar los discos, se utilizaron
frutos 48 DPA (fase VM) los cuales son capaces de responder a etileno (fase
previa al pico de producción de la hormona).
El tratamiento con etefón estimuló la maduración de los discos,
provocando la disminución en el contenido de clorofilas totales. Asimismo, se
observó una disminución de la actividad enzimática en los discos tratados con
respecto al control. Itai y col. (2003) demostraron que las dos isoformas de la
enzima no responden al tratamiento con 1-MCP (un inhibidor competitivo de la
acción del etileno), indicando que ambos genes son independientes de la acción
del etileno. Sin embargo, en nuestro sistema experimental observamos un
incremento en los niveles de transcripto de LeXyl1 y LeXyl2 como resultado del
tratamiento con etefón. Estos resultados estarían indicando que la expresión de
ambos genes sería estimulada por etileno y que la disminución de otras proteínas
con actividad β-xilosidasa sería responsable de la menor actividad encontrada en
los frutos tratados con la hormona.
Si bien el etileno está directamente involucrado en la maduración del fruto
de tomate, es probable que dicho proceso esté también bajo la influencia de otros
reguladores hormonales. Por ejemplo, la disminución en los niveles de
giberelinas que se produce con anterioridad al pico de producción de etileno
102
podría ser parte de este proceso de control. El tratamiento con GA3 de discos de
pericarpio en estadio VM retarda la maduración, probablemente debido a una
disminución en la síntesis de etileno (Ben-Arie y col., 1995). Además, Ben-Arie y
col. (1996) demostraron que el tratamiento pre-cosecha con GA3 de otro fruto
climatérico como el caqui (Diospyros kaki) retrasa la pérdida de residuos de
arabinosa de la pared celular durante la maduración. También se ha demostrado
que la aplicación exógena de auxinas retarda la maduración en muchas especies,
sugiriendo que esta hormona contribuye a la regulación del proceso de
maduración del fruto (Cohen, 1996). En el presente trabajo, el tratamiento de los
discos con auxinas sintéticas (NAA) provocó una disminución de la actividad βxilosidasa con respecto al control, mientras que no se observaron cambios en la
misma
luego
del
tratamiento
con
giberelinas
(GA3).
Asimismo,
ambos
tratamientos produjeron una disminución en los niveles de transcripto de LeXyl1
y LeXyl2.
El tratamiento de discos con ABA no alteró la actividad β-xilosidasa con
respecto al control, sugiriendo un efecto nulo de la hormona en cuanto a la
actividad de la enzima. Por otro lado, los niveles de ARNm de LeXyl1 fueron
estimulados de manera notoria luego del tratamiento, mientras que la hormona
no tendría efecto sobre la expresión de LeXyl2. Nuevamente, los niveles de
expresión de ambas isoenzimas no coinciden con los datos de actividad
enzimática reportados en discos tratados con ABA y control, confirmando la
hipótesis de que la actividad β-xilosidasa no estaría dada únicamente por la
contribución de las actividades de LeXyl1 y LeXyl2.
Los resultados obtenidos en los tratamientos con hormonas sugieren que
la expresión de LeXyl1 sería regulada positivamente por etileno y ABA, y
negativamente por auxinas y giberelinas. Este hecho explicaría el aumento en los
niveles de transcripto observado durante la maduración de las variedades
silvestres, en las cuales la concentración de etileno se incrementa durante la
transición del estadio VM al estadio M, mientras que los niveles de auxinas y
giberelinas disminuyen. La disminución en los niveles de ARNm de LeXyl1
hallada en las líneas mutantes y antisentido, que no presentan un pico
climatérico de etileno o que son insensibles a esta hormona, apoya la idea de que
la acción del etileno es necesaria para que se produzca el incremento en los
niveles de transcripto durante la maduración del fruto. En el caso de LeXyl2, los
tratamientos con reguladores de crecimiento revelaron que la expresión del gen
sería regulada positivamente por etileno y negativamente por auxinas y
103
giberelinas, mientras que el ABA no tendría efecto sobre la misma. No obstante,
el análisis de los niveles de transcripto de LeXyl2 durante la maduración de los
frutos silvestres, mutantes y antisentido sugiere que la expresión del gen estaría
bajo la influencia de otro u otros reguladores biológicos y que a diferencia de
LeXyl1, el etileno no sería determinante en la regulación de la expresión de este
gen. Finalmente, las variaciones observadas en los niveles de ARNm de LeXyl1 y
LeXyl2 en los frutos mutantes rin, nor y Nr podrían deberse a diferencias en los
mecanismos moleculares controlados por los genes correspondientes (LeMADSRIN, NOR y NR).
Dentro de los reguladores de crecimiento que no han sido analizados en
este trabajo de tesis y que contribuyen a la regulación de la maduración del fruto
de tomate encontramos a las citoquininas, los brasinosteroides, el ácido
jasmónico y las poliaminas (Srivastava y Handa, 2005). El estudio del efecto de
estos reguladores biológicos sobre la expresión de LeXyl1 y LeXyl2, así como
también la utilización de las líneas mutantes y antisentido para la realización de
estos ensayos y del inhibidor de etileno 1-MCP, permitirá profundizar nuestro
conocimiento acerca de la regulación hormonal de ambas isoenzimas durante la
maduración del fruto.
104
6.4. CONCLUSIONES
▪ La actividad β-xilosidasa parece estar involucrada en los cambios que se
producen en la pared celular durante la fase de crecimiento, más que en la
degradación de la misma durante la maduración y el ablandamiento del fruto.
▪ La actividad β-xilosidasa no depende exclusivamente de LeXyl1 y LeXyl2,
sino que habría otras enzimas implicadas.
▪ De acuerdo a los datos de masas moleculares, las isoenzimas LeXyl1 y
LeXyl2 podrían sufrir modificaciones post-traduccionales (procesamiento Cterminal) como ocurre con otras β-xilosidasas de plantas superiores.
▪ Los niveles de transcripto de LeXyl1 y LeXyl2 serían regulados
diferencialmente durante la maduración del fruto.
▪ La expresión de LeXyl1 y LeXyl2 sería regulada positivamente por etileno,
y negativamente por auxinas y giberelinas. ABA no tendría efecto sobre los
niveles de transcripto de LeXyl2, mientras que dicha hormona tendría un efecto
positivo sobre los niveles de ARNm de LeXyl1.
105
7. CONCLUSIÓN
GENERAL
106
7. CONCLUSIÓN GENERAL
Si bien ha sido aceptado que el desensamblado de la pared celular es uno
de los factores responsables del ablandamiento y de los cambios de textura que
se producen durante el proceso de maduración de los frutos, es muy escasa la
información con respecto a los roles que cumplirían algunas de las enzimas que
modifican la pared celular. Numerosas diferencias en el catabolismo de la pared
celular han sido detectadas entre especies y aún dentro de las distintas
variedades pertenecientes a una misma especie. En este trabajo de tesis,
estudiamos la actividad β-xilosidasa en frutilla (fruto no-climatérico) y tomate
(fruto climatérico). No sólo detectamos diferencias en las variaciones de la
actividad β-xilosidasa durante la maduración de estos frutos, sino también en la
regulación hormonal de los genes correspondientes.
En frutilla, el análisis de variedades con firmeza contrastante sugiere un
posible rol de la actividad β-xilosidasa y de FaXyl1 en el ablandamiento del fruto.
La expresión de FaXyl1 sería regulada positivamente por ABA, y negativamente
por auxinas, giberelinas y etileno. Por el contrario, la actividad β-xilosidasa en
tomate podría estar involucrada en los cambios de la pared celular que se
producen durante el crecimiento del fruto, más que en la degradación de la
misma durante la maduración y el ablandamiento. Los transcriptos de LeXyl1 y
LeXyl2 serían regulados diferencialmente durante la maduración del fruto. La
expresión de ambas isoenzimas estaría regulada positivamente por etileno, y
negativamente
por
auxinas
y
giberelinas,
mientras
que
ABA
regularía
positivamente a LeXyl1 y no tendría efecto sobre los niveles de ARNm de LeXyl2.
Este comportamiento diferencial entre ambas especies podría ser debido a
diferencias en la composición inicial de la pared celular, así como también a los
distintos cambios que ocurren en la pared celular durante la maduración de
cada fruto.
Por último, se encontraron diferencias entre los patrones de actividad βxilosidasa y los niveles de expresión génica en ambas especies. Esta discrepancia
podría deberse a la presencia de otras proteínas con actividad β-xilosidasa (tales
como isoenzimas aún no identificadas o α-arabinofuranosidasas bifuncionales)
y/o a mecanismos de regulación post-transcripcional. Asimismo, las enzimas
caracterizadas en ambos frutos sufrirían modificaciones post-traduccionales
(procesamiento C-terminal), dando como resultado una reducción en la masa
molecular de las mismas.
107
8. REFERENCIAS
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