evaluación de la incertidumbre en los resultados de la prueba de

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EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN LOS RESULTADOS DE LA
PRUEBA DE ENSAYO PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE PROTEÍNA
POR EL MÉTODO KJELDAHL.
Saavedra Villarreal Nidia*1, Guzmán Mar Jorge Luis1, Molina Recio Nidia Yolanda2 y
Martínez Almazán Violeta Isabel1.
1
Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Nuevo León.
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Laboratorio de Servicios Clínicos y Toxicológicos S.A. de C.V.
Introducción.
La incertidumbre de medida es un parámetro, asociado al resultado de una
medición, que caracteriza la dispersión de los valores que pueden atribuirse
razonablemente al mensurando. El concepto de incertidumbre, como un atributo
cuantificable, es relativamente nuevo en la historia de las mediciones en México,
aunque los términos error y análisis de error han sido bastamente usados como
parte práctica de la ciencia de las mediciones o metrología. Cuando se han
evaluado todas las componentes, conocidas y supuestas de un error, y se han
aplicado las correcciones adecuadas, todavía queda como remanente una
incertidumbre sobre la corrección del resultado establecido, esto es, la duda de
cuán bien representa el resultado de la medición al valor de la magnitud que se
está midiendo. La incertidumbre del resultado de una medida refleja la falta de
conocimiento exacto del valor del mensurando. Esa incertidumbre proviene de los
efectos aleatorios y de la corrección imperfecta del resultado de la medida debida
a efectos sistemáticos.
El objetivo de un sistema de gestión de las mediciones es gestionar el riesgo de
que los equipos y procesos de medición pudieran producir resultados incorrectos
que afecten a la calidad del producto de una prueba de ensayo. De acuerdo a los
lineamientos en nuestro país sobre la evaluación de la competencia técnica de los
laboratorios de calibración y ensayo, se solicita la estimación de la incertidumbre
de las mediciones, las cuales deben aplicar criterios técnicos uniformes y
consistentes, propuestos por la Entidad Mexicana de Acreditación A. C. (EMA), la
cual entró en vigor en Julio del 2008, esta Guía técnica de Trazabilidad e
Incertidumbre de las Mediciones sirven de apoyo a la aplicación del la norma
NMX-EC-17025-INMC-2006 [1].
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Cuando se crea un modelo para evaluar la incertidumbre y se analizan las
diferentes variables que influyen en el proceso de medición, cualquier evento,
fenómeno o propiedad que pueda restar nitidez al valor del mensurando, participa
como factor o componente de la incertidumbre en el valor de la medición. Cabe
mencionar que no siempre serán tomadas en cuenta todas ellas, pues habrá
algunas que sus valores no sean significativos y serán descartadas.
Entre las variables que afectan la incertidumbre se encuentran:
a) La medición; de la cual se obtiene información del estado de una propiedad
empírica (proceso de medición).
b) La estabilidad de los instrumentos de medición donde se considera el ruido
propio o ambiental y la combinación de diversos errores aleatorios.
La evaluación de la incertidumbre debe efectuarse, si y solo si, se cumple con los
requisitos que se enuncian a continuación:
Las personas que realizan el análisis de incertidumbre deben tener un buen
conocimiento del proceso de medición y de sus limitaciones, así como de la
naturaleza de las magnitudes que deben medirse. Además deben conocer el
propósito de la medición y uso que se le dé.
Hasta la fecha, los conceptos básicos que se utilizan para cuantificar son de
naturaleza estadística, por lo tanto, el personal de evaluación debe tener un
conocimiento de esta disciplina.
La instalación, los reactivos, el tipo de equipos, los aditamentos y las condiciones
ambientales así como sus posibles variaciones deben estar definidos.
Los tipos de instrumentos y de los equipos deben estar especificados. El
comportamiento de los mismos, a largo plazo, así como la acción de las variables
de influencia, deben ser conocidos o por lo menos enmarcados dentro de ciertos
valores y finalmente, el procesamiento de la información recolectada debe estar
definido.
Definiciones y conceptos:
a) Incertidumbre estándar.- Es la incertidumbre relacionada con el valor de un
mesurando o una variable de influencia expresada como desviación estándar.
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b) Incertidumbre estándar compuesta.- Es la incertidumbre estándar relacionada
con el resultado de una medición cuando el valor numérico del mesurando se
obtiene mediante la medición de otras magnitudes. Todas las incertidumbres
en las variables se estiman mediante el mismo proceso de cuantificación,
utilizando una unidad conceptual única de dispersión o falta de nitidez: la
desviación estándar. Luego se componen por un proceso de combinación
definido, tomando en cuenta todas las incertidumbres en las variables.
c) Incertidumbre expandida.- Es la magnitud que define un intervalo en torno al
resultado de una medición que puede esperarse que incluya una fracción
grande de la distribución de los valores que pueden atribuirse razonablemente
al mensurando.
Objetivo.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la incertidumbre asociada durante la
determinación del contenido de proteína por el método Kjeldahl en alimentos con
una matriz sólida de acuerdo a la NMX-F-680-NORMEX-2002 con respecto a la
normativa vigente, ya que en la actualidad para realizar estas pruebas los
laboratorios acreditados ante un instrumento regulador en México (EMA) están
obligados a presentar la incertidumbre expandida de la prueba acreditada.
Materiales y Métodos.
Para la presente evaluación de la incertidumbre se tomo como referencia la
NMX-EC-17025-INMC-2006 [1] y la EUROCHEM [2]. La estimación de la
incertidumbre de una medición se realiza en las siguientes etapas:
1. Especificaciones del mesurando.
2. Expresar el modelo matemático del mensurando.
3. Identificar las fuentes de incertidumbre
4. Cuantificar la incertidumbre de cada componente.
5. Combinar las incertidumbres estándares.
6. Calcular la incertidumbre expandida y definir expresión de los resultados.
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A continuación se describe la metodología para calcular la incertidumbre de la
determinación de proteína en muestras de matriz solida según norma NMX-F-680NORMEX-2002 [3].
Especificaciones del mesurando. La determinación de proteína
se realiza
empleando un método que incluyen tres pasos: 1) La digestión, 2) La
neutralización, seguida de la destilación y 3) finalmente su valoración, después
de ser tratada la muestra tomando como referencia la NMX-F-680-NORMEX-2002
[3], Esta prueba se basa en 1) la digestión de la muestra adicionando ácido
sulfúrico y el catalizador para la transformación del nitrógeno a sulfato de
amonio. 2) La neutralización del digerido diluido, seguida de la destilación, para
neutralizar el ácido sulfúrico, se adiciona una disolución alcalina de hidróxido de
sodio al 50%. El amoniaco formado se destila dentro de una disolución de ácido
bórico conteniendo los indicadores azul de metileno y rojo de metilo. 3) La
valoración del destilado, la temperatura del destilador debe de ser menor a 28
ºC durante el proceso de destilado al retirar el matraz, lavar la alargadera por el
interior y exterior con agua destilada, la cual debe de ser parte del destilado, y
apagar el sistema de titulación. El destilado se titula con HCl 0.1N presentara un
cambio del indicador de un color verde-azul a ligeramente rojizo, o bien
ayudándose de un potenciómetro previamente calibrado con soluciones buffer;
el punto final de la titulación tiene lugar a pH de 4.6.
En la cual se establece el proceso de medición y las variables que influyen en
su determinación. La determinación de proteína para cada muestra analizada
se realizó por duplicado. La balanza usada para pesar la muestra y los
recipientes es una balanza con resolución de 0.1 mg.
El proceso de medición involucra la medición de la masa de la muestra y la
titulación del destilado con una bureta de 50 mL. Se pesan en un papel filtro de
1 a 2 g de muestra que es la cantidad recomendada para cumplir con el grado
de
precisión.
Las
muestras
han
sido
previamente
pulverizadas
y
homogenizadas y colocadas en un papel filtro dentro del matraz Kjeldahl para
llevarla a digestión en este proceso se agregan 10 g de sulfato de potasio y 60
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mg de sulfato de cobre y dependiendo de la muestra, se utilizara la cantidad de
ácido sulfúrico concentrado, resbalando este ultimo por las paredes del matraz
y se lleva a digestión hasta que la muestra y blanco de reactivo se encuentren
transparente y no deben observarse puntos negros, no dejar carbonizar la
muestra. Dejar enfriar. Agregar 200 mL de agua destilada resbalándola por las
paredes del matraz, homogenizar conectar al equipo de destilación.
Previamente en la parte de recolección del destilado colocar un matraz
Erlenmeyer de 500 mL, conteniendo 50 mL de ácido bórico. Agregar lentamente
50 mL de hidróxido de sodio al 50% y conectar rápidamente. Encender el
recirculador y el destilador. Destilar hasta 200 mL. Verificar que la destilación
haya sido completa, colocando una tira de papel tornasol a la salida de la
alargadera, y que esta no cambie o sea neutra, lo cual indica que ya sólo se
destila agua. La temperatura del destilador debe de ser menor a 28 ºC durante
el proceso de destilado. Retirar el matraz, lavar la alargadera por el interior y
exterior con agua destilada, la cual debe de ser parte del destilado., y apagar el
sistema de titulación. El destilado se titula con HCl 0.1N hasta cambio del
indicador de un color verde-azul a ligeramente rojizo, o bien ayudándose de un
potenciómetro previamente calibrado con soluciones buffer; el punto final de la
titulación tiene lugar a pH de 4.6.
1. Expresar el modelo matemático del mensurando. La expresión matemática
para el cálculo de proteína (Ecuación 1) toma en cuenta el peso de la muestra
y el volumen del ácido valorado consumido por la muestra.
N=
(VHCl − VHCl −blanco )(N HCl )(0.014)(100)
m
x F
(1)
Donde:
VHCl
= Volumen del ácido valorado consumido por la muestra.
VHCl-blanco = Volumen del ácido valorado consumido por el blanco.
NHCl
= Normalidad del ácido clorhídrico.
7
m
= gramos de muestra.
F
= Factor de conversión es 6.26
14
= Peso atómico del nitrógeno
2. Identificar todas las posibles fuentes de incertidumbre. Las principales fuentes
de incertidumbre en la medición gravimétrica de masa quedan incluidas en
Tabla 1 [1,4].
Tabla 1. Principales fuentes de incertidumbre en la medición gravimétrica de masa
y volumétrica del los mililitros consumidos por la muestra y el blanco.
Etapa operativa
Sub-muestreo
Método de preparación de la
muestra
Fuentes de
Magnitud
incertidumbre
involucrada
Toma de muestra
masa
Secado
masa
Calibración de la
Calibración externa
balanza analítica
Verificación de la
bureta
masa
volumen
Repetibilidad y
Medición
reproducibilidad del
masa
proceso de pesada
En la NMX-17025-IMNC-2006 [1] se recomiendan las fuentes de incertidumbre
que han sido mencionadas en la Tabla 1. Sin embargo en la prueba a realizar, se
ha descartado la etapa de sub-muestreo, ya que en este caso en particular se
trabajó con diferentes matrices que fueron muestreadas por la empresa interesada
en el estudio, así la fuente de incertidumbre que se consideran en el cálculo serán:
•
Método de preparación de la muestra, se toma la muestra por duplicado para
8
realizar la prueba, el resultado por duplicado proporciona información que
corresponde al tratamiento que se les da a las muestras antes de ser
analizadas y la incertidumbre se puede notar por la dispersión en la
reproducibilidad de los datos obtenidos en el PDI del analista
•
Calibración de la balanza analítica, que involucra la incertidumbre estándar de
linealidad y resolución.
•
Verificación de la bureta de 50 mililitros, que involucra la incertidumbre
estándar en la medición del volumen consumido por la muestra y el blanco.
•
Repetibilidad y reproducibilidad del proceso de pesada expresada como la
Incertidumbre del Analista (PDI).
3. Para la cuantificación de cada componente se considera que la cuantificación
de la incertidumbre combinada de la balanza queda definido por la Ecuación 2,
los valores correspondientes para la balanza utilizada son: la resolución a de
1.0 ×10-4 g y linealidad u de 1.0×10-3 g. La incertidumbre de la resolución
queda definida por la Ecuación 2a, donde dicha incertidumbre se calcula
suponiendo una distribución triangular [2], el valor obtenido fue u(resolución)
4.1×10-5 g.
u ( balanza ) =
( u ( resolución ) )
2
(
+ u ( linealidad )
u ( resolución ) =
a
6
2
)
(2)
(2a)
4. Siguiendo la estimación de la incertidumbre de compuestos individuales,
expresada como incertidumbre estándar, el siguiente paso fue calcular la
incertidumbre combinada, usando el proceso descrito a continuación (3):
 ∂p
u c (p ) = ∑ 
i =1..n  ∂x i
2

 u (x i )2

(3)
Donde:
p( x1 , x 2 ,..., x n ) = mesurando, función de x 1 , x 2 ,..., x n
u c (p )
= incertidumbre combinada de p(x 1 , x 2 ,..., x n )
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∂p
= derivada parcial del mesurando p con respecto a x i
∂x i
u (x i ) = incertidumbre individual de xi
A partir de la Ecuación 3, la incertidumbre combinada de la prueba queda definida
por la expresión (4).
uc =
(u (balanza − muestra ))2 + (u (bureta − muestra )2 ) + (u (bureta − blanco )2 )(u (Normalidad )2 )
5. La etapa final fue calcular la incertidumbre expandida, que se determina al
multiplicar la incertidumbre combinada u c por el factor de cobertura (k = 2),
factor de cobertura al 95% de nivel de confianza) elegido para calcular una
incertidumbre expandida (Uexp).
Uexp = u c × 2, para k = 2
(5)
La incertidumbre expandida se requiere para proporcionar un intervalo con un
nivel de confianza al 95%, el cual se espera que abarquen una fracción grande de
la distribución de valores, los cuales pueden ser razonablemente atribuidos al
mesurando. De esta manera la incertidumbre del porcentaje de proteína (%P)
obtenido queda expresado como (6):
%P = %P ± Uexp
(6)
Resultados y Discusión
En la Tabla 2, quedan resumidos los resultados de incertidumbre asociadas
a la determinación del porcentaje proteína.
Los valores mostrados en las Tablas 2 corresponden a la incertidumbre asociada
a cada uno de los factores de influencia en la determinación del contenido de
proteína en matrices solidas calculados para 2 g de muestras que fueron
analizadas de acuerdo a la norma NMX-F-680-NORMEX-2002 [3].
La evaluación de la incertidumbre realizada en este trabajo se llevó a cabo en 24
10
muestras en las cuales se obtuvo un rango de contenido de proteína de 8.21% a
17.45%. Adicionalmente en la evaluación de la incertidumbre no se incluyeron
algunos otros factores de influencia como son: las etapas de sub-muestreo y
preparación de muestra, entre otros.
Tabla 2. Incertidumbre expandida en la determinación del contenido de proteína
en matrices de carne fresca y procesada.
Carne
Fresca
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
X
S
% Proteína
Uexp
16.34
12.85
15.75
15.27
16.42
15.10
13.17
15.23
16.62
11.37
11.82
17.45
14.78
2.01
0.4649
0.4619
0.4663
0.4662
0.4671
0.4654
0.4639
0.9129
0.9153
0.8144
0.7033
0.8035
0.62
0.19
Carne
% Proteína
procesada
1
8.94
2
8.47
3
8.89
4
9.34
5
8.21
6
8.75
7
8.57
8
8.98
9
10.81
10
9.53
11
10.55
12
10.70
X
9.31
S
0.90
Uexp
0.4373
0.4179
0.7582
0.8279
0.717
0.7782
0.6983
0.8897
0.8978
0.8908
0.8201
0.8747
0.75
0.16
Se evaluó el procesador creado para determinar la incertidumbre de la prueba de
proteína en matrices sólidas, con la finalidad de conocer si este diseño cumple con
las especificaciones dictadas por la NMX-EC-17025-IMNC-2006 [1]. Los
resultados obtenidos de incertidumbre para la prueba del contenido de proteína
(Tabla 2) se encontraron entre 8.21 y 17.45%, Si se considera que la
incertidumbre no debe de rebasar el 20% del valor de la muestra de acuerdo a la
NMX-EC-17025-IMNC-2006 [1], encontramos que los resultados de incertidumbre
de las muestras analizadas equivale a valores entre 2.84 % y 9.35% del valor de la
muestra. Estos valores nos indican que se tiene una incertidumbre que se
encuentra dentro de los valores esperados de acuerdo a la norma vigente,
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además demuestra que el proceso de la prueba del contenido de proteína tiene un
alto grado de confiabilidad en los valores obtenidos.
Conclusiones.
Podemos concluir que este procesador puede proporcionar una idea clara
del intervalo en el que se encuentra el verdadero valor del mesurando y cuáles
son las variables significativas que influyen en este proceso de estimación, el cual
cumple satisfactoriamente. Además, la estimación de la incertidumbre en el
laboratorio de prueba permite llevar a cabo la evaluación del desempeño de los
equipos y los analistas involucrados en el proceso. En este trabajo se presentaron
resultados de porcentaje de proteína en dos tipos de matrices: carne fresca y
procesada con la finalidad de resaltar la eficiencia del procesador de incertidumbre
cuando se manejan porcentajes entre 11.37 y 17.45%, de proteína (carne fresca)
encontramos un promedio de incertidumbre de 0.62% contra el de 8.47 y 10.81%
de proteína (carne procesada) que tiene un promedio de 0.75% como podemos
observar la diferencia es de 0.133% lo que resalta la eficiencia del procesador al
observar que los valores de incertidumbre no se disparan poniendo en riesgo ante
un amplio rango al considerar la tabla presentada.
Agradecimientos.
Los autores agradecen a La Universidad Autónoma de Nuevo León,
Facultad de Ciencias Químicas por el apoyo otorgado para este proyecto.
Referencias.
1. NMX-17025-IMNC-2006. IMNC. Requisitos generales para la competencia de
los laboratorios de ensayo y de calibración. Instituto Mexicano de
Normalización y Certificación, A.C. (2006).
2. Eurachem-Citac “Guide Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement”
2nd. Edition (2000).
3. NMX-F-680-NORMEX-2002. Determinación de proteínas en alimentos Método de prueba (cancela a la nmx-f-068-1980).
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4. NMX-Z-055:1996 IMNC Metrología – Vocabulario de términos fundamentales y
generales, equivalente al documento International Vocabulary of Basic and
General Terms in Metrology, BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML,
1993. Instituto Mexicano de Normalización y Certificación, A.C. (1996).
5. Nielsen S.S. Análisis de Alimentos. Editorial Acriba S.A., Impreso en España,
2009.
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