Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada

Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert UNIVERSIDAD DE ALICANTE FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA FAGULTAB DE glEKSWS-BIBUOTECA UNIVERSIDAD BE ALICANTE N.o REGJSTíE-.„..£.£JL_ FHOHA^2;.£a.Dpro.....„„ OÜU, „._ SIGNATURA ¿ E & L ¿ = — 13 ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA INMOVILIZADA. PROPIEDADES Y APLICACIONES. R. M Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Ciencias, Sección de Quúnicas, por EUGENIO V I L A N O V A GISBERT Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Alicante, Mayo 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert IDAD DE AD DE RA D E MURCIA MEDICINA BIOQUÍMICA Los Doctores José Antonio Lozano Teruel, Catedrático y Director del Departamento Interfacultativo de Bioquímica de la Universidad de Murcia, y José Luis Ibo rra Pastor, Profesor Adjunto de Bioquímica, CERTIFICAN: Que los trabajos experimentales correspondientes a la Memoria titulada: "Actividad Tirosina hidroxilasa de Tirosinasa inmovilizada. Propiedades y Aplicaciones", han sido realizados por D. Euge nio Vilanova Gisbert, bajo nuestra dirección, y a nuestro juicio reúne las condiciones adecuadas para ser presentada y juzgada por el Tribunal correspondiente para aspirar al grado de Doctor en Ciencias, Sección de Químicas. Murcia, 9 de Junio de 1980 Fdo. José A. Lozano Teruel Catedrático de Bioquímica Fdo. José Luis Iborra Pastor Profesor Adjunto de Bioquímica Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert La presente Memoria, forma parte de la línea general de investigación que en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Ciencias y del Colegio Universitario de Medicina de Alicante, se viene desarrollando sobre Bioquímica en fase sólida, y en concreto sobre la inmovilización de enzimas en soportes sólidos, así como sus aplicaciones bioquímicas, industriales y analíticas. Este trabajo está realizado bajo la codirección de los Drs. D. José Luis I borra Pastor y D. José Antonio Lozano Teruel, a quienes agradezco su orientación y ayuda. Así mismo a los compañeros del Departamento por la ayuda prestada y el ambiente de trabajo, especialmente a Dña. Ma. del Rosario Blanes Torreblanca por su eficaz colaboración en los estudios con soportes de nylon. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -I- Í N D I C E Pág. LISTA DE ABREVIATURAS 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO. 2 ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA SOLUBLE. COMPARACIÓN CON DÓPA OXIDASA. Vil 1 4 2.1. Características generales de la actividad tirosina hidroxilasa. de tirosinasa. 3. 5 2.2. Comportamiento frente a la extracción y purificación. 11 2.3. Cinética, perfil pH-actividad y estabilidad a la reacción. 16 2.3.1. Cinética. 16 2.3.2. Perfiles pH-actividad. 20 2.3.3. Estabilidad a la reacción. 21 CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES UTILIZADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA. 23 3.1. Elección del método y soporte de inmovilización. 24 3.2. Enzacryl-AA. 26 3.3. Soporte CPG-AA. 28 3.4. Derivados de nylon. 30 3.5. Reactores y metodología de estudio de las enzimas 38 inmovilizadas. 3.5.1. Reactor de baño agitado (STR). 38 3.5.2. Reactor de baño agitado continuo (CSTR). 39 3.5.3. Reactor de columna con lecho empaquetado (PBCR). 40 3.5.4. Reactor tubular (TR). 41 Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE TIROSINASA EN ENZACRYL-AA Y EN CPG-AA. 41 4 . 1 . Rendimiento de inmovilización en Enzacryl-AA 42 4.2. Inmovilización de tirosinasa en CPG-AA. Comparación con tirosinasa de champiñón. 49 4.3. Estudio de las condiciones óptimas de ensayo de la actividad tirosina hidroxilasa del Enzacryl-AA-IME. 52 4.4. Comportamiento cinético del Enzacryl-AA-IME. 56 4.5. Efecto del ascorbato y de la hidracina sobre las actividades del SE y del IME. 58 4.5.1. Efecto del ascorbato y de la hidracina en la formación de dopacromo. 59 4.5.2. Efecto del ascorbato y la hidracina sobre el consumo de oxígeno. 4.5.3. Consumo de ascorbato en la reacción. 61 65 INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA 69 5.1. Activación de protirosinasa. 70 5.1.1. Efecto de la tripsina sobre la actividad tirosina hidroxilasa de protirosinasa soluble. 72 5.1.2. Activación de protirosinasa por inmovilización. Efecto de la tripsina sobre Enzacryl-AA-IMP. 74 5.2. Rendimientos de inmovilización de protirosinasa en Enzacryl-AA. 5.3. Comportamiento cinético del Enzacryl-AA-IMP. 76 79 ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME, ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME. 82 6.1. El fenómeno de la inactivación de la tirosinasa por la actuación. 6.2. Estabilidad al almacenamiento. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 83 86 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -III- 6.3. Actividad de los reactores con gel-IME y estabilidad de de la reacción a largo tiempo. 87 6.4. Influencia de varios factores sobre la estabilidad y actiactividad del IME. 94 6.4.1. Efecto de la fuerza iónica y del pH. 94 6.4.2. Efecto de la temperatura. 96 6.4.3. Efecto del ascorbato y de la hidracina. 98 6.5. Factores que afectan especialmente a reactores de columna empaquetada. 100 6.5.1. Efecto de la concentración de oxi'geno. 100 6.5.2. Efecto de la concentración de sustrato. 102 6.5.3. Efecto de la velocidad de flujo volumétrico y de la velocidad lineal. 104 6.6. Comparación de los resultados obtenidos con otros intentos de estabilización de tirosinasa por inmovilización. 7. 107 INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN GELES DE NYLON MODIFICADO. 110 7.1. Rendimientos de inmovilización. 110 7.2. Comportamiento de lod geles-ny Ion-I ME a tiempos largos de reacción.. 7.3. Efecto de la cantidad de protei'na sobre la inmovilización 116 7.4 Estabilidad al almacenamiento. 117 7.5 Perfiles pH-actividad. 118 7.6. Propiedades cinéticas de los geles-nylon-IME. 8. 113 119 APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS DE L-DOPA. 120 8.1. Criterios de comparación de la producción de distintos reactores y soportes. 121 8.2. Producción de L-dopa en reactores con Enzacryl-AA-IME. Efecto del tipo de reactor. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 126 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -IV- 8.2.1. Producción en reactores de baño agitado (STR). 126 8.2.2. Producción en reactor continuo de baño agitado (CSTR). 127 8.2.3. Producción en reactor de columna empaquetada (PBCR) 128 8.3. Producción de L-dopa con CPG-AA-IME. Efecto de la porosidad del soporte. 8.4. Producción de L-dopa en reactores con geles-nylon-IME. 130 132 INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y EN MEMBRANAS DE NYLON. 137 9.1. Inmovilización en tubo de nylon 138 9.1.1. Rendimiento de inmovilización 138 9.1.2. Propiedades cinéticas del tubo-IME 139 9.1.3. Estabilidad al uso continuo e intermitente del tubo-IME. Posibilidades anah'ticas. 140 9.2. Inmovilización en membranas de nylon. 143 9.2.1. Rendimiento de inmovilización en función de la cantidad de protema. 143 9.2.2. Estabilidad al almacenamiento. 144 APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEMBRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA. 10.1. Diseño de un electrodo de tirosinasa. 146 149 10.2. Respuesta ti'pica del electrodo de enzima y criterios de medida. 149 10.3. Efecto de la agitación, de la presencia de ascorbato y del tipo de sustrato sobre la respuesta del electrodo. 150 10.4. Efecto del volumen y de la concentración sobre la respuesta del electrodo de enzima. 152 10.5. Efecto de la actividad enzimática de la membrana sobre la respuesta del electrodo de enzima. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 154 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -V 10.6. Interpretación de la respuesta del electrodo. 155 10.7. Fatiga del electrodo con el número de ensayos. 157 10.8. Dependencia de la respuesta del electrodo con la concentración de sustrato. 161 10.9. Aplicación del electrodo a la determinación de muestras de L-tirosina y L-dopa. 164 CONCLUSIONES. 166 MÉTODOS EXPERIMENTALES. 170 12.1. Obtención de enzima. 170 12.1.1. Extracción de protirosinasa. 170 12.1.2. Purificación de protirosinasa. 171 12.1.3. Activación de la protirosinasa. 172 12.1.4. Criterio de homogeneidad. Electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 4,3. 12.2. Preparación de soportes. 172 174 12.2.1. Enzacryl-AA y CPG-AA. 174 12.2.2. Preparación de polvo de nylon 174 12.2.3. Modificación de membrana y tubo de nylon. 174 12.2.4. Preparación de nylon alquilamina (NAQA). 175 12.2.5. Preparación de nylon parcialmente hidrolizado (NH). 175 12.2.6. Preparación de nylon-bencidina (NB) 176 12.2.7. Preparación de nylon poliisonitrilo (NPI). 176 12.2.8. Preparación de nylon poliarilamina (NPAA) 177 12.3. Inmovilización de tirosinasa. 177 12.3.1. Inmovilización a soportes con grupos arilamina activados con ácido nitroso. 177 12.3.2. Inmovilización a soportes con grupos alquilamina activados con glutaraldehido. 178 12.3.3. Inmovilización sobre NPI activado con acetaldehido. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 179 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 12.4. Determinación de protema. 12.5. Determinación de ascorbato. 180 12.6. Determinación de oxigeno disuelto. 181 12.7. Determinación de L-dopa. 181 12.8. Determinación de la actividad enzimática. 182 12.8.1. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa soluble. 18 182 12.8.2. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. 12.8.3. Actividad dopa oxidasa de tirosinasa. 183 184 12.8.4. Determinaciones con el electrodo de tirosinasa inmovilizada. 13. BIBLIOGRAFÍA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 184 186 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -VII- ABREVIATURAS. Act IME Actividad estándar del derivado inmovilizado (U/mg gel-IME) Act R Actividad del IME en las condiciones reales de un determinado reactor (U/mg gel-IME). Act Act Actp para condiciones iniciales. Ro STR- Act PBCR Actp en el tipo de reactor que se indica. Act. sust. Fracción de actividad sustrai'da de la disolución de enzima que se aplica al proceso de inmovilización. CM Disolucón de enzima purificada por cromatografía en CM-Sephadex. CM/Phe Disolución de enzima purificada por cromatografi'a en CM-Sephadex y posteriormente en Phenyl-Sepharosa. CPG-AA Soporte de vidrio de poro controlado con grupos arilamina. CPG-AA-IME Enzima inmovilizada en CPG-AA activado con ácido nitroso. CR Capacidad de reacción del reactor. CSTR Reactor continuo de baño agitado. Ef. acop. Eficacia de acoplamiento, fracción de actividad manifestada por el IME respecto a la sustrai'da de la disolución. L-dopa L-3,4-Dih¡drox¡fenilalanina. E Enzima Enzacryl-AA Soporte de poliacrilamida con grupos arilamina. Enzacryl-AA-IME Enzima inmovilizada en Enzacryl-AA activado con ácido nitroso. f Factor de purificación. P gel-IME Enzima inmovilizada en soporte con forma de gel. gel-nylon-IME Enzima inmovilizada en soporte de nylon con forma de gel. H20/P¡ Extracto estándar de enzima (ó proenzima) de epidermis de rana, obtenido de forma selectiva con tanpón fosfato, después de una extracción previa con agua (Método: 12.1.1) IME (IMP) Enzima (proenzima) inmovilizada. IME Cantidad de enzima inmovilizada, en unidades estándares (U). m Masa de gel-IME (g ó mg), longitud de tubo-IME superficie.de membrana-IME (cm^). membrana-IME Enzima inmovilizada en soporte con forma de membrana. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 (cm) ó Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -VIII- NAQA Soporte de nylon con grupos alqilamina obtenido por ruptuno hidroh'tica de grupos amida del nylon. NAQA-IME Enzima inmovilizada en NAQA activado con glutaraldehido. NB Soporte de nylon-bencidina. NB-IME ó NB-glut-IME Enzima inmovilizada en NB activado con glutaraldehido. NB-nitroso-IME Enzima inmovilizada en NB activado con ácido nitroso. NH Soporte de nylon parcialmente hidrolizado. NH-IME Enzima inmovilizada en NH activado con glutaraldehido. NPAA Soporte de nylon-poliarilamina. NPAA-IME Enzima inmovilizada en NPAA activado con ácido nitroso. NPI Soporte de nylon-poliisonitrilo. NPI-IME Enzima inmovilizada en NPI activado con acetaldehido. NPI-acético-IME Enzima inmovilizada en NPI activado con acético/acetaldehido. P Producto de reacción. P Parámetro que indica las unidades estándar de IME utilizadas por litro de disolución sustrato procesado a lo largo de la vida de uso del reactor (U/1). PBCR Reactor de columna con lecho empaquetado. Phe Enzima purificada por cromatografi'a en Phenyl-Sepharosa. Pi Extracto enzimético obtenido de epidermis de rana por extracción directa con tampón fosfato. P Producción específica total del reactor a lo largo de su vida de uso (mol ó g de dopa/Ude IME. 'T Q Velocidad de flujo volumétrico en reactores continuos (ml/h). q Parámetro que indica la masa de gel-IME (g ó mg) utilizada por litro de disolución sustrato procesado en el reactor a lo largo de su vida de uso. r global Rendimiento del proceso global de purificación e inmovilización. r inm Rendimiento de inmovilización. r prot Rendimiento de unión de proteína en la inmovilización. r pur Rendimiento del proceso de purificación. S Sustrato. SE (SP) Enzima (proenzima) soluble. STR Reactor de baño agitado. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -IX- Tiempo (min, h). Tiempo de semiinactivación (h). Reactor de tubo. Tiempo de residencia normalizado (min/U). Tiempo total o vida de uso del reactor (h). Enzima inmovilizada en soporte con forma de tubo. Velocidad lineal del fluido de un reactor continuo (cm/h) Velocidad de consumo de oxígeno (°/Q de C ^ / m i n ) . Volumen del reactor (mi, I). Volumen de sustrato (mi, I). Volumen total de sustrato procesado a lo largo de la vida de uso del reactor. Factor de conversión; fracción de sustrato transformado en producto. Factor de conversión medio del producto obtenido a lo lar go de la vida de uso del reactor. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -2- 1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DEL TRABAJO. La inmovilización de enzimas es una técnica que consiste en la fijación física o química de las moléculas de protei'na a la estructura de un soporte insoluble en agua. Este campo de la Biotecnología empezó a tomar auge en la década de los sesenta y viene desarrollándose durante los últimos años (Mos bach,1976), abriendo amplias posibilidades para el futuro de la tecnología de enzimas (Thomas, 1979a; 1979b). Gracias a este desarrollo se ha conseguido aplicar dicha tecnología a procesos industriales (Pitcher, 1975; Weetall, 1977; Tramper, 1979), y a sistemas analíticos 1979). (Guilbault, 1979; Hornby et al. 1977; Sundaram, También se vienen aplicando ampliamente para estudios bioquímicos, como por ejemplo, sobre la naturaleza funcional de subunidades aisladas ( Chan, 1976), sobre cambios conformacionales (Gabel y Kasche, 1976), y especialmente la simulación in vitro de enzimas que en su estado natural se encuentran a- sociadas a estructuras celulares particuladas, mediente la inmovilización a membranas artificiales reconstituidas (Broun, 1976; Vieth, 1979). La tirosinasa es un sistema enzimático que presenta actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa y cuya estructura y función se viene estudiando en nuestro Departamento, en coordinación con el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Murcia. Este sistema enzimático presenta una serie de problemas, tanto desde el punto de vista de la expresión de su actividad, como de su aplicación a la tecnología de inmovilización de enzimas. Así, bajo el aspecto bioquímico, en epidermis de anfibios se extrae en forma de proenzima que se activa por luz, temperatura y enzimas proteolíticas (Barisas y McGuire, 1974; Mikkelsen et al., 1975), muestra histéresis (García Carmona.1980), un equilibrio asociación-disociación y otras propiedades características (Ferragut, 1980 ). Desde el punto de vista biotécnológico, la tirosinasa es una enzima que presenta limitaciones de transferencia de materia, debido entre otros factores a la baja solubilidad de los sustratos y a su inestabilidad ocasionada por los productos y otros factores. Hay una evidencia bibliográfica de inmovilización de tirosina- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -3- sa de champiñón, como intentos de estabilización de la enzima (Wykes et al., 1971; Letts y Chance, 1974), sin llegar a conseguir la suficiente estabilidad que permitiera su uso continuado. También Schiller y Liu (1976) y Schiller et al.(1978), inmovilizaron tirosinasa de champiñón para la determinación potenciométrica de fenoles en aguas residuales. Aunque este sistema resultó sensible desde el punto de vista anali'tico, perdía drásticamente la actividad, lo que impedía su uso repetitivo. En nuestro caso, la enzima objeto de estudio fué la de epidermis de rana. En nuestro Departamento se ha estudiado la interacción de esta enzima con soportes sólidos para cromatografía de afinidad (Iborra et al. 1976; Cortés, 1978) y mediante la técnica de inmovilización, se han analizado los efectos microambientales de diferentes soportes en la actividad dopa oxidasa (Iborra et al. 1977; Manjón, 1978), la activación por inmovilización de la actividad dopa oxidasa de la proenzima (Iborra et. al., 1979), la expresión de la actividad de las subunidades y la estructura cuaternaria por entrecruzamiento (Ferragut, 1980). Así mismo, se ha aplicado la técnica de fotooxidación con colorantes inmovilizados para analizar propiedades estructurales y funcionales de la actividad dopa oxidasa (Llorca, 1980) Los objetivos del presente trabajo están centrados en la actividad tirosina hidroxilasa de la enzima. En primer lugar se pretende el análisis de las características generales de la actividad tirosina hidroxilasa de la tirosinasa inmovilizada en diferentes soportes sólidos, en comparación con las propiedades de la enzima soluble , con el fin de conseguir un sistema con mayor estabilidad de la enzima. Por otra parte, al mejorar los procedimientos de inmovilización y de estabilización de esta enzima suicida (García Carmona, 1980), se pretende ampliar las posibilidades de aplicación a la síntesis de L-dopa, por su interés farmacológico, así como la utilización del sistema inmovilizado para fines analíticos, entre ellos un electrodo de enzima. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 2. ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA SOLUBLE. COMPARACIÓN CON DOPA OXIDASA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -5- ACTIVIPAD TIROSINA HIDROXILASA DE T1ROSINASA SOLUBLE. COMPARACIÓN CON DOPA OXIDASA. 2 . 1 . CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ACTIVIDAD TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA. El sistema enzimático tirosinasa (E.C. 1.14.18.1), con el nombre recomendado de monofenol monooxigenasa (Comission Biochemical No- menclature, 1972), incluye a enzimas presentes en especies de toda la escala filogenética (Pomerantz, 1963 ; Horowitz et al., 1970; Miller et al., 1970; Burnet, 1971; Padrón et al., 1974; Pomerantz y Murphy, 1974; Mikkelsen y Triplett, 1975 ; Hughes y Pnce, 1975 ; Abramowitz y Chavin, 1978; Nishioka et al. 1978). Tienen propiedades distintas según la fuente, siendo común en todos los casos ser cuproproteínas no azules y catalizar la oxidación de monofenoles y/o difenoles (Gunsalus, 1974). El proceso general, que en su función biológica se asigna a la tirosinasa de origen animal es el siguiente (Pomerantz y L i , 1970). °2 HO-(Cg>-R > AH2 (1) Ltirosina H 2 ° HO {. 1/2o2 H0Jg^.R A ^ \ ' H2o O ^Qa>~^_R {2) L-dopa ^ ^ dopaquinona M- & siendo A H 2 un cofactor dador de electrones. Le siguen reacciones no enzimáticas que dan lugar a la formación de dopacromo (Nicolaus, 1968) y éste lentamente, se emplea en la formación de pigmentos de melaninas. La reacción (1) es la que propiamente define la actividad tirosina hidroxilasa y la (2) a la actividad dopa oxidasa (Pomerantz, 1966). Las expresiones de acividad cresolasa y catecolasa, que también se emplean para indicar ambas funciones de la enzima, se refieren normalmente al proceso global, fácilmente observable, de formación de dopacromo y consumo de oxígeno que tiene lugar cuando se parte de L-tirosina o de L-dopa como sustratos, respectivamente. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -6- La enzima de epidermis de rana es una glicoproteína con 0,75 % de carbohidratos y con estructura oligomérica, que mantiene un equilibrio de asociación-disociación de monómero-tetrámero en la forma nativa de proenzima y monómero-dimero en la forma activada con tripsina, siendo aproximadamente de 70.000 daltons el peso molecular del monómero (Ferragut, 1980), La conversión de proenzima a enzima implica un desplegamiento de la cadena polipepti'dica (Iborra et al. 1978, Ferragut, 1980) y alcanzar una conformación más estable (Galindo,1976, Manjón,1978; García Carmona, 1980). La interacción con soportes de afinidad hidrofóbica han demostrado el carácter hidrófobo de la tirosinasa y ha permitido su purificación(Cortés, 1978). En presencia de ascorbato, con L-dopa como sustrato, El- Bayoumi y Frieden (1957) observaron que no se formaba dopacromo y se producía la oxidación de ascorbato, la cual Fling et al. (1963) observaron que se daba a dos veces la velocidad de formación de dopacromo en ausencia de ascorbato.Se interpretó por una rápida reducción de la dopaquinona formada, al reaccionar con el ascorbato, según el siguiente esquema de reacciones: no E dehidroascorbato L>14'1 « W L-ascorbato AH, L-tirosina (1) > (4) I noE leucodopacromo dopacromo no E (D,(2),(3),(4),(5) En presencia de ascorbato las reacciones (4) y (5) no se dan y el balance global con L-dopa como sustrato daría: Oo •+" ascorbato -> dehidroascorbato Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 (6) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -7- Mientras que con L-tirosina sen'a: L-tirosina -f- 3/2 0 2 + ascorbato L-dopa -+- dehidroascorbato > + AH2 (7) + H 2 0 -I- A Aunque el balance global de la reacción (7) es la conversión de L-tirosina a Ldopa, no representa la reacción propia de la actividad hidroxilante de L-tirosina sino el proceso conjunto de las reacciones (1), (2) y (3). Además,por otro lado hay que tener en cuenta que el ciclo formado por las reacciones (2) y (3) determina la existencia de un cortocircuito que daría lugar a la oxidación neta de ascorbato como consecuencia de la acumulación de L-dopa formada. Esto último, es equivalente a considerar la reacción real en presencia de ascorbato como la suma de la reacción (7) y n veces la reacción (6) El estudio de la actividad tirosina hidroxilasa está condicionado a los métodos de medida que se pueden aplicar, de los cuales los más característicos son los siguientes: a) Medida espectrofotométrica del dopacromo formado. Dado que en este caso se mide el producto final, para considerarlo como medida de la actividad tirosina hidroxilasa es necesario que la hidroxilación de tirosina sea la etapa limitante del mecanismo. b) Medida polarográfica o manométríca del oxígeno consumido en la reacción. Como en el caso anterior implica una medida del proceso global y no puede emplearse correctamente en presencia de ascorbato, pues la existencia del cortocuito formado por las reacciones (2) y (3) implican un consumo de oxígeno no relacionado directamente con la actividad de hidroxilación de tirosina. c) Medida radiométrica del 3 H O H formada a partir de L-tirosona-3,5-3H, según el siguiente mecanismo aceptado (Pomerantz, 1966): 'H n n n u j 0 f ^ N H 2 +AH2+02 H ° HO ^ >;§) J, Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 3H ^ ,COOH rN H 2 + A + 3 HOH (8) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -8- En este método se está midiendo solamente la etapa de hidroxilación de la Ltirosina, independiente de las posteriores acciones de oxidación de la L-dopa formada. Constituye pues, un método óptimo para distinguir la actividad tirosina hidroxilasa de las demás reacciones, enzimáticas o no, que acompañan al sistema de reacción. Aunque es muy sensible, la laboriosidad del método pone limitaciones a su utilización. d) Medida colorimétrica de la L-dopa acumulada en la reacción en presencia de ascorbato. Este método fué el empleado a lo largo de este trabajo como métof do estándar ( descrito en 12.7), en base al método original de Arnow (1937a), modificado por nosotros. Su aplicación es sencilla, rápida, reproducible y lineal con la concentración de enzima, y dado que parte de nuestro objetivo era la síntesis de L-dopa, el método nos dio una medida apropiada. Las dificultades de su uso para estudio de mecanismos de las reacciones de la tirosinasa, radican en que no se está midiendo simplemente la conversión de L-tirosina a Ldopa, sino un conjunto de reacciones que incluirían las etapas de mecanismos más complejos, como los de las reacciones (1), (2) y (3). Pomerantz (1966), observó que con tirosinasa de mamíferos, la velocidad de hidroxilación de tirosina, medida radiométricamente, era la misma en presencia que en ausencia de ascorbato, e igual que la de acumulación de L-dopa en presencia de ascorbato midiendo por el método de Arnow. Esto implicaba que la actividad tirosina hidroxilasa no se afecta en si misma por la presencia de ascorbato, al menos en términos de velocidad inicial. Otra propiedad característica de la actividad hidroxilasa de tirosinasas es la existencia de un periodo de retardo o también llamado de inducción, que ha dificultado aún más el estudio de esta actividad. Ha sido encontrado en tirosinasa de mamíferos (Pomerantz, 1964), de insectos (Seybold et al., 1975) y de epidermis de rana (García Carmona, 1980).Los requerimientos, de cofactores para la inducción de la enzima demamíferos ha sido estudiada por Pomerantz y Warner (1967) y por Hearing et al. (1978 a), llegando a la conclusión de que el producto de hidroxilación de la L-tirosina, la L-dopa, es el más eficaz cofactor, el cual actuando como dador de electrones (AH 2 ) elimina el período de retardo. De acuerdo con esto la estequiometría de las reacciones (1) y (2) quedaría como sigue(Pomerantz y Warner, 1967): Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -9- L-tirosina -* L-dopa HoO (9) -» dopaquinona L-dopa Tirosinasa La disminución del período de retardo con la concentración de L-dopa inicial se aprecia tanto midiendo la actividad por la formación de dopacromo, como por el método radiométrico, e igualmente lo hace el aumento de la concentración de enzima. La concentración de sustrato L-tirosina aumenta los períodos de retardo. Estos hechos y otros factores que afectan al período de retardo sugieren a Garci'a Carmona que la enzima posee un comportamiento por el que se le puede asignar la propiedad de histéresis en el sentido definido por Frieden (1970), y lo interpreta en función de la existencia de un equilibrio de dimerización lento en que la forma dimérica de la enzima sería la forma funcionalmente activa, la cual se formaría más rápidamente por la presencia de L-dopa Con el esquema de reacciones (9), el proceso en presencia de ascorbato, suponiendo que su efecto fuera simplemente la reducción de la dopaquinona a L-dopa, sería el siguiente: L-Tirosina -* L-dopa •+ H 2 0 L-dopa ascorbato t dopaquinona -"""" dehidroascorbato ^^~**>* L-dopa (10) lo que daría una estequiometría global de: L-tirosina + 0«- L-dopa + H20 (11) ascorbato Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 -+- dehidroascorbato Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -10- Una característica d« la tirosinasa que afecta notablemente a los objetivos del trabajo que se presenta en esta Memoria es la inactivación por la actuación. La estabilidad de una enzima en su actuación catalítica puede cuantificarse por los valores del tiempo de semiinactivación ( t j , 2 ), definido como el tiempo necesario para que a lo largo de su actuación, la actividad de la enzima se redujera a la mitad de su valor inicial. La actividad dopa oxidasa, medida por la formación de dopacromo por método espectrofotométrico, manifiesta valores de t 1 / 2 de 4 minutos (Manjón, 1978). La actividad tirosina hidroxilasa, seguida por el método radiométrico, en ausencia de ascorbato y por lo tanto dándose la formación de dopacromo, dio valores semejantes de t j , 2 , entre 4 y 5 minutos. Sin embargo en presencia de ascorbato en el medio de reacción, no se observó pérdida significativa de actividad durante 10 minutos de reacción (García Carmona, 1980). De las características cinéticas del proceso de inactivación, García Car mona dedujo que el proceso de inactivación partía de un intermediario Enzima— -sustrato o Enzima—producto del mecanismo del proceso catalítico. Si el efecto del ascorbato fuera simplemente la reducción de dopaquinona a L-dopa, la anulación de la inactivación por el ascorbato demostraría que la especie que se inactiva es un complejo E-P, o de lo contrario habría que admitir que el ascorbato puede unirse a algún centro de la enzima, desviando el proceso catalítico por otro mecanismo; esto último estaría en consonancia con el efecto de cofactor que el ascorbato ejerce respecto al período de retardo. Por otro lado la inmovilización de la enzima a soportes sólidos, proporcionó un espectacular aumento de la estabilidad a la actuación de la actividad dopa oxidasa, llegando a valores de t j , 2 de 150 minutos pon el soporte Enzacryl-AA (Iborra et al. 1977, Manjón, 1978). Esto sugiere que en el proceso de inactivación estaba implicado algún cambio conformacional, y que la rigidez que confiere a la estructura de la proteína la unión covalente al soporte, dificulta ese cambio conformacional. La inmovilización de la enzima a soportes ¡nsolubles y su ac- tuación en presencia de ascorbato, se emplearán en este trabajo para intentar una alta estabilización de la actividad hidroxilasa de la tirosinasa, a fin de permitir su aplicación a los fines indicados anteriormente como objetivos del trabajo. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -11- En las secciones siguientes del presente capítulo se analizarán los resultados obtenidos en la purificación de la actividad tirosina hidroxilasa soluble y de algunas propiedades cinéticas, en relación con la actividad dopa oxidasa de la misma proteína 2.2. COMPORTAMIENTO FRENTE A LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN. El procedimiento general de obtención de la enzima consistió en la extracción de la proteína de epidermis de rana por su solubilización en presencia de una fuerza iónica apropiada. Posteriormente se purificó por croma- tografía de intercambio iónico en CM-Sephadex, seguido de cromatografía de interacción hidrofobica con Phenyl-Sepharosa. La enzima se obtuvo con este procedimiento en forma de proenzima, pasándola a la forma activa mediante tratamiento con tripsina (Método: 12.1.3.). La extracción de tirosinasa se realizó por homogenl zación de la epidermis de rana con disolución de tampón fosfato pH 7,0, de concentración apropiada para proporcionar la fuerza iónica deseada. Cuando se empleó como medio de extracción agua destilada, se extrajo proteína sin ninguna actividad t i rosina hidroxilasa ni dopa oxidasa. El incremento de la concentración de fosfato proporcionó un ligero aumento de la cantidad de proteína y actividad extraída, pero con una menor actividad específica, siendo prácticamente idénticos los comportamientos de la actividad hidroxilasa y dopa oxidasa (Fig. 1). Así pues, cuando se deseó una extracción lo más selectiva posible, resultó más apropiado el tratamiento con agua y posterior extracción en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Este sistema de extracción selectiva, fué el empleado como método estándar (Método: 12.1.1.) y el extracto así obtenido se le denominó extracto H 2 0/P¡. La extracción directa con fosfato 0,1 M pH 7,0 (extracto P¡) proporcionó mayor concentración de proteínas propias del entorno natural de la enzima, aproximación que se utilizó en algunas experiencias posteriores. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de una experiencia tipo, de los dos sistemas de extracción, y como puede observarse existió un paralelismo entre el comportamiento a la extracción de la actividad tirosina hidroxilasa y la actividad dopa oxidasa. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -12- F O t Fig. 1. F A T O ( M | Extracción de tirosinasa de epidermis de rana a diversas concentraciones de fosfato. Cada extracción se realizó por homogenización de 20 mg de epidermis liofilizadas por mi de tampón fosfato, pH 7,0. Tabla 1 Actividad tirosina hidroxiiasa y dopa oxidasa en una extracción a partir de epidermis. Sistema de extracción Protei'na (mg/ml) dopa oxidasa Tirosina hidroxiiasa U/ml U/mg f P U/ml U/mg f P P¡ 0,53 0,23 0,43 1.0 2,2 4,0 1.0 H20 0,43 0,00 — — 0,0 — — H 2 0/P¡ 0,20 0,17 0,86 2,0 1.7 8,7 2,2 fp: factor de purificación respecto al extracto P¡ Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -13- En las diversas extracciones llevadas a cabo con distintas muestras de epidermis, se observó siempre una relación constante de 10 +0,6 unidades de dopa oxidasa extraída por unidad de tirosina hidroxilasa. Este hecho apoya el supuesto de que la misma proteína fuera responsable de ambas actividades enzimáticas. El valor de la relación dopa oxidasa/tirosina hidroxilasa fué menor (alrededor de 6 ) en extractos almacenados durante 30 días a 5°C, lo cual nos indicó que la inactivación por el almacenamiento afectó más a la actividad dopa oxidasa que a la tirosina hidroxilasa. La interacción de extractos de proenzima con el soporte cargado negativamente CM-Sephadex dio un mismo perfil de elución para las actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa (Fig. 2). Los resultados obtenidos indicaron que el método fué útil para la purificación de la proenzima. La igualdad en el comportamiento de elución fué un dato más a favor de que la misma proteína era responsable de las dos actividades enzimáticas. En nuestro Departamento se había demostrado anteriormente la afinidad de la proteína con actividad dopa oxidasa por los grupos fenilos del Fig. 2. Cromatografía en CM-Sephadex de un extracto hÔ/Pj de proenzima. Para 250 mi de extracto H 2 0 / P i (0,61 U T.H./ml, 5,1 U D.O./mg) se empleó 1 g de CM-Sephadex. Columna de 3x30 cm. Q=30 ml/h. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -14- soporte hidrofóbico Phenyl-Sepharosa (Iborra et al., 1977; Cortés, 1978). En base a ello, se aplicó la cromatografía en columna con dicho soporte a extractos de protirosinasa y de tirosinasa activada en columna de tripsina-sepharosa, así como a protirosinasa purificada previamente por intercambio iónico con CM-Sephadex. Los comportamientos de elución fueron muy semejantes en todos los casos para las dos actividades ensayadas, tanto respecto a los volúmenes de elución como en los factores de purificación obtenidos. Un perfil de elución característico de esta cromatografía de interacción hidrofóbica se muestra Fig. 3. La cromatografía en Phenyl-Sepharosa resultó en Ja útil como técnica de purificación en sí misma y como etapa de purificación concatenada con la cromatografía de intercambio iónico en CM-Sephadex. Fig. 3 Cromatografía de afinidad hidrofóbica en Phenyl-Sepharosa de proenzima purificada previamente por CM-Sephadex. Aplicadoa 10 mi de disolución de proenzima (3,2 U T.H./mg y 36 U D.O./mg). Phenyl-Sepharosa. Q=12 ml/h. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Columna con 3 mi de Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -15- En la Tabla 2 se muestran los resultados de aplicar los métodos de purificación a un extracto de tirosinasa. Puede observarse que la purificación de un extracto HoO/P¡ con CM-Sephadex dio semejantes factores de purificación que con Phenyl-Sepharosa, aunque con mayor rendimiento en este último. El procedimiento global de purificación, consistente en una extracción selectiva hÔ/Pj, seguido de interacción con CM-Sephadex y finalmente cromatografía en Phenyl-Sepharosa, proporcionó una preparación que se le denominó como protirosinasa purificada CM/Phe. Se consiguieron preparaciones con actividades específicas de 6-8 U T.H./mg, que representaron factores de purificación de 30-40 respecto al extracto P¡ y se obtuvieron con rendimientos de recuperación de actividad del 60-80 % . Tabla 2 Purificación de las actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa de protirosinasa Etapa de dopa tirosina purificación oxidasa hidroxilasa (U/mg) (U/mg) f P r pur Extracto P¡ 2,6 0,23 1.0 100 H 2 0/P¡ 6,5 0,60 2,6 91 CM-Sephadex (*) 34,0 3,59 15,6 65 Phenyl-Sepharosa (*) 35,1 3,45 15,0 81 CM/Phe (**) 70,0 7,36 32,0 61 s (*) Aplicado a extracto H20/P¡ (**) Proceso global de purificación: extracción l-Ô/Pj, cromatografía CM-Sephadex y cromatografía Phenyl-Sepharosa. fp factor de purificación referido a la actividad tirosina hidroxilasa de extracto P¡ r-yj/endimiento del proceso de purificación respecto a tirosina hidroxilasa. Una muestra de protirosinasa purificada se sometió a electroforesis catiónica de pH 4,3 en gel de poliacriiamida (Método: 12.1.4.). La tinción de las bandas de proteínas con azul Comassie dio un electroforetograma con una única banda de proteína (Rf 0,12) Los densitogramas indicaron una homogeneidad de la preparación de un 95 % de pureza. Cuando se incubaron geles con L-dopa o Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -16- con L-tirosina independientemente, en presencia de tripsina, se observó la tinción de la banda de protei'na en cada uno de los geles, lo que demostró que tanto la actividad dopa oxidasa como la tirosina hidroxilasa coincidi'an en la misma banda. Asi' pues, con los resultados expuestos, quedó confirmado que la tirosinasa es responsable de las dos actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxi dasa. 2.3. CINÉTICA, PERFIL pH-ACTIVIDAD Y ESTABILIDAD A LA REACCIÓN Con el fin de comparar las propiedades de la tirosinasa inmovilizada con las de la propia enzima soluble, se realizó un análisis de las propiedades más significativas, relacionadas con la afinidad de la enzima por su sustrato, pH óptimo e inactivación con la actuación. 2.3.1. CINÉTICA. Se estudió la cinética de la reacción de hidroxilación de L-tirosina, catalizada por tirosinasa en presencia de ascorbato, midiendo la velocidad de síntesis de L-dopa (Método: 12.8.1.). La concentración de L-dopa formada fué lineal en un tiempo de reacción de 0-20 minutos (Fig. 4 ) . En las condiciones de trabajo empleadas, no se apreció la existencia del periodo de retardo mencionado anteriormente. A concentraciones de ascorbato de 1,5 mM, García-Carme na (1980) ha observado que en, extractos de tirosinasa de epidermis de rana, se elimina casi completamente el período de retardo. En nuestro caso, con concentraciones de ascorbato empleadas (2,5 mM) eliminaron prácticamente el periodo de retardo en las condiciones de medida utilizadas. Sin embargo, Pomerantz ( 1966) y Hearing et al. (1978) encontraron que con tirosinasa de mamíferos las concentraciones elevadas de ascorbato no evitaban totalmente el período de retardo, al menos en las condiciones de ensayo empleadas por ellos. Además, la concentración de ascorbato empleada evitó eficazmente la oxidación de L-dopa a dopaquinona, lo que se comentará más adelante en relación con la enzima inmovilizada. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -17- Fig. 4. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa. Concentración de L-dopa formada con el tiempo de reacción, para distintas concentraciones de L-tirosina. 5 10 TIEMPO ( min ) Asi' mismo la velocidad de reacción fué lineal con la cantidad de enzima presente en el medio de reacción, como puede apreciarse en la Fig. 5,1o que confirma el origen enzimático de la reacción y la validez del método de medida de actividad empleado. Fig. 5. Variación de la actividad tirosina hidroxilasa con la cantidad de enzima aplicada. VOLUMEN DE EXTRACTO i/^X) Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -18- Cuando se calcularon los valores de los parámetros cinéticos KM y V de la enzima en distintos estados de purificación, por medio de la representación de Lineweaver-Burk (Fig. 6-A), se obtuvieron unos valores de K M de 1,95 mM cuando se empleó extracto H 2 0 / P ¡ , valor que se incrementó hasta 2,85 mM cuando se utilizó enzima purificada CM/Phe. Este incremento del valor de K M con la purificación sugiere que la tirosinasa pierde afinidad por la L-tirosina al eliminar proteínas del medio. Por ello en los estudios posteriores de inmovilización de tirosinasa en soportes sólidos se tuvo en cuenta el estado de pureza de la tirosinasa empleada, como posible variable determinante de las propiedades del sistema. De los parámetros cinético K M y V m se dedujo la curva de Michaelis teórica (Fig. 6-B). Si se compara esta curva teórica con los puntos ex- 400 A • • 300 » y y / / % (nwi 200 • yS 30 i 20 • B • /" _y" ^ — V 100 • 10 (n M /m ¡n ) / l1L 2 >l. 4 r 1 y -¿U^^^^ « K 1/S ^^mmmm i % 10 s < nM > » 1 1 ( mW 1 ) Fig. 6. Cinética de la actividad tirosina hidroxilasa de extracto H 2 0/P¡. A) Representación de Lineweaver-Burk B) Representación de la curva teórica de Michaelis (v frente a S), para los valores de K M =1.95 mM y de V m =0,031 mM/min, calculados de la representación A. Con flechas se indican los valores de K M y solubilidad de la L-tirosina. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -19- perimentales obtenidos, se observa que es muy forzado deducir un comportamiento de Michaelis con estos resultados, pues la solubilidad máxima de la L-tirrosina de 2,5 mM (Merck Index, 1968), está en la zona de valores de K ^ calculados (1,96 y 2,5 mM). De hecho si los valores experimentales de v frente a S, para concentraciones de L-tirosina de entre 0 y 1 mM, se ajustan a una recta se obtienen coeficientes de correlación superiores a 0,99. Asi' pues, en la mitad del rango de trabajo, la actividad tirosina hidroxilasa responde a una cinética de seudoprimer orden. De esta forma, la solubilidad de la L-tirosina es un factor limitante de la máxima actividad manifestable por la enzima. Como condiciones estándar para medida de actividad tirosina hidroxilasa y para su utilización en la síntesis de L-dopa, se ha empleado disolución saturada de L-tirosina (2,5 mM), lo que significa respecto al sustrato condiciones no saturantes de la enzima. El valor de K ^ que se obtuvo en presencia de ascorbato, en base a la medida de acumulación de L-dopa y con el empleo de tirosinasa no purificada ( K ^ 1,96 mM), coincide aproximadamente con el obtenido por García Carmona (1980), empleando el método radiométrico de Pomerantz. Esto es as¿ tanto en presencia como en ausencia de ascorbato ( K ^ 1,9 mM). Además, los valores obtenidos de V m a x y de velocidad de reacción medida por este método no variaron con la presencia de ascorbato, indicando que la velocidad de conversión de L-tirosina a L-dopa no se vio afectada por la presencia de ascorbato, al menos en términos de velocidad inicial. Con el método espectrofotométrico basado en la medida del dopacromo formado, en ausencia de ascorbato, lor de K ^ García Carmona obtuvo un va- de 1,56 mM con sustrato L-tirosina y de 2,46 con sustrato L-dopa y obteniendo una relación de recambio o turnover ( V m a x ,j0pa / V m a x tir) ^ e 7,14. De estos datos puede deducirse que para las condiciones de concentraciones de sustratos empleadas en los métodos estándar de medida de actividad, la velocidad ae reacción, para la actividad tirosina hidroxilasa con una concentración de L-tirosina de 2,5 mM, sería: vtir - 2 5 - v m a x . tir = 1,56+ 2,5 Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 0,616 V m a x tir Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -20- y para la actividad dopa oxidasa con L-dopa 10,15 m M : 'dopa = 10 -15 V max. dopa °-805 V max dopa 2 , 4 6 + 10,15 teniendo en cuenta que v dopa _ Vmax d o p a / V m a x °.805 V maxdopa "tir O- 616 V t = m a x tir ¡ r =7,14, se deduce que: 0.805 °' 9,33 616 Este valor de 9,33, representa la razón de actividad dopa oxidasa respecto a la de tirosina hidroxilasa que se deducen de los datos cinéticos obtenidos por García Carmona, valor cercano al de 10 —0,6 , obtenido en nuestro caso para la relación de actividad dopa oxidasa respecto a tirosina hidroxilasa de diferentes extractos recién obtenidos (Sección 2.2.), relación que como se ha indicado antes disminuyó con el almacenamiento. Esta similitud de resultados confirma la validez de los diferentes métodos utilizados para medida de actividad enzimatica. 2.3.2. PERFILES pH-ACTIVIDAD. Los perfiles pH-actividad de la actividad tiroxina hidroxilasa, se desplazaron muy ligeramente hacia pH alcalino con la purificación, lo que in- 1.0 - < > O < 0.5 O > p u < Fig. 7. • 0 • Purificado CM/Ph» o Extracto H20/Pj Purificado CM/Ph« Extracto H 2 0/P¡ Perfiles pH-actividad. Efecto de la purificación y Eniayc* *n P¡-0,o6 M I _l pH Enwyot «n P¡ - 0,10 M 1 PH Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 de la fuerza iónica. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -21- dicó la existencia de efectos protefna-protefna en las propiedades de la enzima, hecho que se habi'a observado también en las propiedades cinéticas. Sin embargo la variación en la fuerza iónica apenas influyó en la forma de los perfiles pH-actividad (Fig. 7). 2.3.3. ESTABILIDAD A LA REACCIÓN. Para estudiar la estabilidad de la tirosinasa a la reacción con sustrato L-tirosina, en presencia de ascorbato, se trató la enzima con sustrato y se dejó reaccionar, midiéndose la concentración de L-dopa formada con el tiempo ( Fig. 8-A). Las curvas derivadas (Fig. 8-B), expresan la disminución de la ve- Fig. 8 Pérdida de actividad tirosina hidroxilasa con la actuación. Efecto del estado de purificación. A) Concentración de L-dopa formada con el tiempo de reacción. B) Disminución de la velocidad de reacción con el tiempo.(Derivada de las curvas A). <3> extracto Pi; o, extracto hÔ/Pi; purificado CM; purificado Phe; rificado CM/Phe. 20 T I E M P O 40 60 { mm , 80 ) Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 100 pu- Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -22- locidad de reacción con el tiempo, deducie'ndose de ellas pos de semiinactivacion de unos valores de tiem- t j , 2 = 35-40 minutos y no se apreciaron diferencias significativas, en este sentido, para enzima en distintos estados de purificación. Estos valores fueron notoriamente superiores a los encontrados para la actividad tirosina hidroxilasa, en ausencia de ascorbato, cuando se midió la actividad por la formación de dopacromo y para la actividad dopa oxidasa ( 4-5 minutos) (Garci'a Carmona, 1980; Manjón, 1978), Este hecho indica que el proceso de inactivación con la actuación puede estar relacionada con los productos de oxidación de la L-dopa. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 3. CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES UTILIZADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -24- 3. CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES Y REACTORES EMPLEADOS EN LA INMOVILIZACIÓN DE T1ROSINASA. El término Enzima Inmovilizada (IME), ha sido recomendado (Commission Biochemical Nomenclatura, IUPAC-IUB, 1974) para describir todas las preparaciones en las que la enzima es retenida de alguna forma dentro de los confines limitados de un polímero que actúa como soporte. Una IME es con' siderada como una forma de enzima modificada, en contraposición con la enzima nativa. Por la forma de inmovilización se clasifican en dos grupos: a) Ocluidas, que incluyen a las incluidas en una matriz de un polímero y a las que han sido microencapsuladas. b) Enlazadas, que incluyen a las adsorbidas y a las unidas covalentemente a ur soporte insoluble en agua Las enzimas unidas al soporte covalentemente, se consideran inmovilizadas por métodos químicos y en los demás casos por métodos físicos. 3.1. ELECCIÓN DEL MÉTODO Y SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN. A la hora de elegir un soporte para la inmovilización de una proteína hay que considerar una serie de factores dependientes de la naturaleza del soporte y del método de unión. Así, en la inmovilización por adsorción la enzima puede alterar sus propiedades por el microambiente eléctrico que le proporciona el soporte; en las ocluidas los reactivos para polimerizar el soporte ó formar microcápsulas pueden afectar químicamente a la enzima, pero por lo general, la inmovilización por métodos físicos deja la enzima más intacta que los métodos químicos. En éstos, la unión covalente de la enzima al soporte implica una modificación química de la molécula proteica, que puede afectar drásticamente a su estructura y actividad enzimática, especialmente si en la unión intervienen grupos del centro activo o que sean importantes en el mantenimiento de la conformación activa. Sin embargo, la inmovilización covalente ofrece grandes ven- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -25- tajas por la estabilidad de la unión enzima-doporte. Gracias a ella, la conformación de la estructura de la enzima se mantiene más ri'gida que en estado soluble por la unión a la estructura del soporte sólido. Asi' es frecuente que la inmomovilización covalente de enzimas, aumente la estabilidad de las mismas, tanto en el almacenamiento como en su actuación (Iborra et al., 1977), aunque puede ir acompañado de pérdida notoria de actividad (Srere, 1976). Conseguir un sistema de inmovilización de una enzima que le proporcione gran estabilidad con mínimas pérdidas de actividad, es abrir un camino para la aplicación tecnológica de dicha enzima. En nuestro caso, para la inmovilización de tirosinasa, se optó por la unión covalente con el fin de aumentar la estabilidad de la enzima y minimizar el problema de su inactivación por la actuación. Actualmente, en la bibliografi'a pueden encontrarse una gran variedad de métodos y soportes para la inmovilización covalente de enzimas. (Mosbach, 1976). Los soportes pueden ser de formas fi'sicas diversas como: geles, granulos, membranas, mallas, películas, tubos, etc. Pueden tener una estructura más o menos porosa. Están constituidos químicamente por un esqueleto covalente o matriz como agar, agarosa, celulosa, colágeno, sílice, alúmina, etc. Normalmente los soportes se modifican químicamente para disponer de grupos funcionales reactivos ( aldehidos, alquilaminas, arilaminas, imidoésteres, cianuro, anhídrido, carboxilato, etc.). El acoplamiento de la enzima al soporte requiere en primer lugar, la activación del soporte y a continuación el uso, o no, de un reactivo de acoplamiento (carbodiimidas, dialdehidos, diimidoés'teres, etc.). El soporte y método de unión más apropiado en cada caso, dependerá de las características de la enzima y de la finalidad de su utilización. La elección de un sistema de inmovilización está determinada por: a) La naturaleza de la enzima: su fuente de obtención, estado de purificación, forma funcional (monomérica u oligomérica, proenzima o enzima, etc), conformación, cantidad y disposición de grupos funcionales para su unión al soporte, etc. b) La naturaleza del soporte: su estado físico, su porosidad, su resistencia mecánica, su hidrofilicidad, su esqueleto estructural y el tipo y densidad de grupos funcionales disponibles para el acoplamiento de la enzima, así como Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -26- el microambiente que el soporte proporciona a las moléculas de enzima. c) El método de unión: técnica de trabajo, reactivos de activación y/o de acoplamiento, proporción relativa de cantidad de protema respecto al soporte,concentración de protei'na, y condiciones generales de trabajo (temperatura, pH, fuerza iónica, agitación, etc.). Para la inmovilización de tirosinasa se optó por emplear como soportes: Enzacryl-AA, CPG2¡ r ci ac j-Arylam¡na (CPG-AA) y derivados de nylon. El Enzacryl-AA se decidió utilizar porque este soporte había dado los mejores resultados, en nuestro Departamento, para la actividad dopa oxidasa de la tirosinasa inmovilizada (Manjón, 1978). El soporte CPG-AA se empleó especialmente por las ventajas mecánicas que ofrecía, entre las que cabe destacar su mayor porosidad que implica menores problemas difusionales. La razón principal de emplear derivados de nylon para inmovilizar tirosinasa fué la gran versatilidad que ofrece tanto en la forma del soporte como en los métodos de inmovilización, dado que puede encontrarse en diversas formas físicas como: granza convertible en polvo o gel, tubos capilares, membranas, etc. Además son de muy bajo costo en comparación con la mayor parte de los soportes normalmente empleados, lo que facilita sus aplicaciones industriales. Los derivados de nylon se prepararon buscando que fueran de fácil y sencilla preparación y utilización y en algunos casos para que fueran soportes con un microambiente semejante al suministrado por los otros soportes anteriormente citados y que habían dado buenos resultados. A continuación se describen las características de estos soportes empleados, las modificaciones químicas que se han realizado sobre ellos y los métodos de acoplamiento enzima-soporte empleados. 3.2. ENZACRYL-AA El Enzacryl-AA es un derivado de poliacrilamida que posee grupos funcionales arilamina (Fig. 9) (Mosbach et al. 1976). Se suministra comercialmente por Koch Light Lab. Se sintetiza por copolimerización de acrilamida y p-aminoacrilanilida, entrecruzando con N.N'-metilenbisacrilamida. El copolímero formado es reducido por tratamiento con iones titanio(ll), dando Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -27- fH-CrV-CH-CUf-CH-CH^CH-CHf-CH—CHj CONHt CONHt | NH-CO CONH I C H - CNH-CO H r C H - C H r - C H - C H í - C H - C H r - CH—CH¿" ÓONH t CONHi CONH ^ N H Fig. 9. t CONHi : Esquema del esqueleto estructural de Enzacryl-AA. Los grupos reactivos del soporte están encuadrados por líneas de puntos. lugar a grupos arilamina (Barker et al., 1970), a través de los cuales puede realizarse el acoplamiento de la enzima. La activación del soporte puede realizarse: a) Por diazotación con ácido nitroso para dar grupos diazo (Epton et al. 1976). b) A través de la formación de un isotiocianato por tratamiento con tiofosgeno (Manecke, 1970; Epton et al., 1976). En esta Memoria se empleó Enzacryl-AA activado por diazotación con ácido nitroso (Método: 12.3.1), con el cual el acoplamiento de la proteína implica principalmente a los residuos de L-tirosina de la misma, aunque también pueden participar en menor extensión el núcleo imidazol de la histidina y el indol del triptófano. El esquema de las reacciones de acoplamiento se indican en la Fig. 10. El Enzacryl-AA es un soporte hidrofílico, que suministra un microambiente de grupos hidrofóbicos aromáticos a la enzima, mediante los grupos arilamina libres que quedan después de unir a la enzima. Su forma física es la de partículas finamente divididas y en las especificaciones del suministrador se indica que su uso más conveniente es en suspensiones con agitación, lo que prevee de los problemas de flujo y de difusión que pueden darse por su utilización en columnas de lecho empaquetado. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -28- Fig. 10. Esquema de la inmovilización de enzima sobre soportes con grupos arilamina por diazotación con ácido nitroso. Método de inmovilización aplicado a los soportes: Enzacryl-AA, CPG-AA, NB y NPAA. 3.3. SOPORTE CPG-AA El soporte CPG-AA, que también se encuentra disponible comercialmente (Corning-Pierce), es un derivado de vidrio de poro controlado (tamaño de poro 550 A ) , que contiene grupos arilamina (Fig. 11) y cuya principal aplicación es la inmovilización de protei'nas (Weetall, 1976). KO-Sí-ÍC^VNH-CO-^-NHt Fig. 11. Grupo funcional del CPG-AA Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -29- El vidrio poroso (CPG) se prepara a partir de borosilicato y puede recubrirse con óxido de circonio (CPGz¡ r ciad) P a r a mejorar sus propiedades mecánicas y su resistencia a pHs superiores a 7. A partir de él, se pueden obtener una gran variedad de soportes. Asi', el vidrio poroso al tratarlo con aminopropiltrietoxisilano conduce a un soporte con grupos propilamina (Filbert, 1975) que, por tratamiento posterior con cloruro de p-nitrobenzoilo y subsiguiente reducción con hiposulfito sódico, da lugar a un soporte que contiene los citados grupos arilamina. Sobre este soporte se pueden inmovilizar enzimas aplicando los mismos procedimientos descritos antes para el Enzacryl-AA. Asi', pueden unrse por activación del CPG-AA con tiofosgeno (Weetall, 1969a; Pierce, 1980) o con ácido nitroso (Weetall, 1969a. 1969b; Weetall y Baun, 1970; Weibel y Bright, 1971). En este trabajo se ha empleado la activación con ácido nitroso para la inmovilización de tirosinasa al CPG-AA (Método: 12.3.1) y le corresponde el mismo esquema de reacciones de la Fig. 10. Los soportes derivados de vidrio poroso ofrecen las siguientes ventajas en su utilización: * Poseen alta resistencia mecánica, permitiendo altas presiones de operación y altas velocidades de flujo (Filbert, 1975). * Es co'modamente manejable y separable de las disoluciones por simple decantación. * Su volumen no se altera por los cambios del medio. * Puede usarse en sistemas de operación continua durante largo tiempo * La porosidad del soporte minimiza los problemas difusionales La inmovilización de tirosinasa en este soporte con los mismos grupos funcionales que el Enzacryl-AA, pero con mejores propiedades mecánicas y mayor porosidad, permitirá comparar el efecto del tipo de soporte sobre las propiedades de la tirosina inmovilizada, especialmente en su aplicación en columna en donde estos factores son más determinantes. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -SO- SA DERIVADOS DE NYLON La denominación de nylon se aplica a una serie de polímeros lineales, consistentes unidades repetidas de grupos metileno unidos mediante enlaces amidas secundarias.Son pues, poliamidas, y los diferentes tipos son designados de acuerdo con el número de átomos de carbono de sus unidades monoméricas. Así, por ejemplo: nylon-6 CO-(CH 2 ) 5 -NH-CO-(CH 2 ) 5 -NH nylon-6,6 NH-(CH 2 ) 6 -NH-CO-(CH 2 )4-CO- • nylon-6,10 NH-(CH 2 ) 6 -NH-CO-(CH 2 ) 8 -CO nylon-11 CO-(CH 2 ) 1 0 -NH-CO-(CH 2 ) 1 0 -CO Los grupos amidas permiten la formación de enlaces de hidró- geno intercadenas. Estos enlaces pueden darse también con el agua del medio, lo que le confiere un carácter hidrofíiico y es una característica idónea para la inmovilización de enzimas, ya que proporciona un microambiente en el cual la enzima puede manifestar su actividad y permitir que sea estable (Hornby y Goldstein, 1976). El nylon es un material termoplástico que se caracteriza por su resistencia mecánica y dureza superficial. Puede estirarse y orientarse en frío, lo que produce un gran aumento de la resistencia del material y la posibilidad para la fabricaciónde diversas formas del mismo (Martínez, 1972). Así el nylon puede obtenerse comercialmente en las siguientes formas físicas: a) Granza. Es la forma en que se obtiene como materia prima (BASF, BAYER) a partir de la cual se obtienen las diferentes formas comerciales de nylon. b) Polvo o gel de nylon. Puede obtenerse fácilmente en el laboratorio a partir de granza, por medio de formar suspensiones con CI 2 Ca/metanol y posterior precipitación en agua. (Método: 12.2.2). En nuestro caso hemos elegido para este fin nylon-6 que, junto con el nylon-6,6, es el más hidrofílico y además es el más utilizado para la inmovilización de enzimas (Goldstein et al. 1974a). c) Tubo capilar. En este trabajo se utilizó tubo de nylon-6 (nylon estándar), Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -31- de diámetro interior de 1 mm, aunque también existen el mercado de nylon-11 ó 12 (nylon flexible), y diámetros variables de 0,25 a 8 mm (Portex, Hythe, Kent, U.K.). d) Membranas o mallas de nylon. Pueden encontrarse bajo una gran variedad de tamaño de poro, grosor del hilo, o forma de estar tejido. En nuestro caso , se utilizó membrana NY10HD, de 10 mieras de tamaño de poro (ZBF, Switzerland). e) Otras formas como películas, hilo, etc., no utilizadas en este trabajo. El nylon tiene pocos grupos funcionales libres.de forma que debe ser modificado qui'micamente para generar centros potencialmente reactivos que puedan interaccionar covalentemente con las moléculas de enzima. Hornby y Goldstein (1976) clasifican los tipos de modificaciones del nylon en tres grupos, que a continuación se describen: 1) MÉTODOS QUE IMPLICAN RUPTURA DEL ENLACE A M I D A DE LA POLIAMIDA. Los grupos alquilamina liberados en estos métodos, se utilizan para el acoplamiento de las moléculas de enzima. La ruptura del enlace puede realizarse, por ejemplo, con N,N-dimet¡l,l,3-propanod¡am¡na, que uniéndose al grupo carbonilo del enlace amida del nylon, lo desplaza y deja libreuun grupo amina (Fig. 12), dando lugar a un derivado de nylon con grupos alquilamina (NAQA). También puede realizarse la liberación de grupos amino por una hidrólisis controlada de enlaces amida con un tratamiento con CIH, con lo que se obtiene un derivado de nylon parcialmente hidrolizado (NH).(Fig. 12). Tanto el NAQA como el NH, han sido preparados en este trabajo (Métodos: 12.2.4 y 12.2.5) y ambos soportes se activaron por tratamiento con un reactivo bifuncional como el glutaraldehido (Método: 12.3.2.) que se une a los grupos aminos libres del soporte y por otro lado se enlaza posteriormente con los grupos amino: de la molécula de enzima (Fig. 13). En el caso del NH, el soporte proporciona a la enzima inmovilizada un microambiente con carga negativa debido a los grupos carboxilo liberados en la hidrólisis de los grupos amida del nylon. El soporte NAQA su- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -32- H (nyion) C-N— N.N-dimetil,l,apropanodiamina —C=0 n 0 ClH/HaO r$l- -C=0 r^N- NH (C'H¿ (NH) ¿ H+ (NAQA) / v CH, CH, Fig. 12. Nr< Métodos de preparación de derivados de nylon que implican ruptura del enlace amida. Esquema de las reacciones de preparación de los soportes NH y NAQA. glutaraktehido N N CH CHO N n NHl m CH i * CH N N DE Fig. 13. Esquema de la inmovilización de enzima (E) a soportes de nylon con grupos aminos libres por activación con glutaraldehido. Aplicado a los soportes NH, NAQA y NB. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 L Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -33- ministra un microentorno cargado positivamente, proporcionado por la amina terciaria del reactivo que provoca la ruptura no hidroh'tica. Ambos métodos son sencillos en su aplicación y permitieron en este trabajo disponer de dos soportes con microentornos de cargas opuestas. También se han sugerido sistemas de inmovilización al NH, a través del grupo carboxilo (Sundaram, 1977a), unos basados en la conversión de un anhi'drido mixto y otros en la condensación con grupos amino mediante carbodiimidas. Este último tiene el inconveniente de que provoca inactivación de la enzima por reacciones de entrecruzamiento entre las propias moléculas de enzima. Sin embargo este procedimiento ha sido empleado por Daka y Laidler (1978) para unir bencidina a grupos carboxilo del NH (Fig.14). De esta forma el soporte de nylon-bencidina (NB) así obtenido tiene dos grupos aminos distintos utilizables para la innovilización de enzima por activación con glutaraldehido bajo el mismo esquema de reacciones de la Fig. 13. Otra característica del soporte NB así obtenido es que a la enzima inmovilizada le proporciona un microambiente neutro, a diferencia de los anteriores. Este sistema de inmovilización se ha aplicado en este trabajo a la tirosinasa, y además hemos derivado un procedimiento de inmovilización por diazotación semejante al empleado con los soportes con grupos arilamino como el Enzacryl-AA, CPG-AA y NPAA y que se ajustaría al esquema de reacciones indicado en la F¡g.10 —«————___—___—________________________________________ CONH ( nylon ) HCl/H-0 COOH fi3N ( NJJ ) I Ibencidina — C0NH-^¡H^>-NH3 Fig. 14. Preparación de NB Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 rt-N ( NB ) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -34- 2) MÉTODOS BASADOS EN O - A L Q U I L A C I Ó N Estos métodos se basan en la activación del nylon por for- mación de una sal de imidato, por tratamiento con sulfato de dimetilo (Sundaram y Apps, 1977) o con tetrafluorborato de trietiloxonio en diclorometano (Sundaram et al. 1979). A partir de esto se puede unir la enzima directamente a través de sus grupos aminos, u obtener derivados alquilaminas o hidrazidas de nylon (Sundaram e Igloi, 1979). No obstante no se han utilizado en este trabajo. 3) MÉTODOS BASADOS EN N-ALQUILACIÓN Goldstein et al. (1974a) diseñaron un procedimiento de inmovilización en el cual, después de una hidrólisis parcial para generar pares de grupos carboxilo y amino sobre la superficie del nylon, provocaban una reacción de cuatro componentes empleando 1,6-diisocianohexano y acetaldehido. Con esto, daban lugar de nuevo a la formación del enlace amida, pero ahora N-sustitui'da y con un grupo funcional isonitrilo. (Fig. 15-A) El nylon poliisonitrilo (NPI), lo hemos empleado en este trabajo para la inmovilización de tirosinasa a través de los grupos aminos de la protei'na y también a través de la participación de los grupos carboxilos, según el esquema de reacciones de la Fig. 15-B. El NPI puede transformarse en un derivado poliarilamino por tratamiento con p.p'-diaminodifenilmetano (Hornby y Goldstein, 1976) según el esquema de reacciones de la Fig. 16. El nylon-poliarilamina (NPAA), se ha empleado para la inmovilización de tirosinasa a través de residuos tirosina de la protema según el mismo esquema de reacción que se había aplicado para la inmovilización sobre Enzacril-AA, CPG-AA y NB (Fig. 10). Tanto el NPI como el NPAA aportan a la enzima inmovilizada un microambiente neutro, aunque de distinto carácter, alifático en el NPI y aromático en el NPAA. Ambos se caracterizan por poseer un largo brazo entre el esqueleto del soporte y los grupos reactivos de unión a la enzima, especialmente el NPAA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -35- •CONH (nylon) CLryôl COÓ" r^N l B (NPI) N n e Nr^COO* CHjCHO •CH5C00* • CHjCHO •CONI CH-CH, I CO NH 1 S° CH-CH, NH (NPIWCH^ N-CO / N n c Fig. 15. — f¡J X Nylon poiiisonitrilo (NPI). A)Preparación. B)lnmov¡l¡zac¡ón de enzima. NPI) 'OOC-CH, C • CH,CHO Fig. 16 NH (NPAA) CO I C Hf C H - N - ^ - C H . - ^ N H , F° Preparación de nylon poiiariiamina (NPAA) a partir de NPI. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -36- En la Tabla 3 se resumen los soportes y métodos que se han aplicado en este trabajo para la inmovilización de tirosinasa. Se han utilizado siete soportes distintos, cinco de ellos derivados de nylon, preparados por nosotros y de los cuales el NH y el NB se aplicaron tanto en forma de gel como en tubos y membranas, y los otros dos obtenidos comercialmente. Los cuatro soportes que contenían grupos funcionales arilamina (Enzacryl-AA, CPG-AA, NPAA y NB) se activaron por diazotacion con ácido nitroso formando una sal de diazonio, sobre la cual se acopló posteriormente la enzima. La aplicación de estos sistemas de inmovilización venía sugerida por los buenos resultados que para la actividad dopa oxidasa, había dado la inmovilización de tirosinasa en Enzacryl-AA. .La carga eléctrica que el soporte aporta al microambiente es nula, excepto en el caso de NB, en que la inestabilidad de las sales de diazonio alquílicas hace que, al menos parte de los grupos amino se conserven aportando carga positiva. El glutaraldehido se ha empleado como reactivo bifuncional para la activación de los soportes con grupos alquilamina (NH, NAQA) y también con el NB que contiene grupos alquilamina y arilamina. En cada uno de estos tres casos, el soporte aporta carga eléctrica distinta. Además hay que señalar que en este método de unión, se elimna la carga positiva de los grupos amino de la enzima que se unen al soporte a travás del glutaraldehido. El acoplamiento de la enzima al NPI con acetaldehido en presencia o no de acético, se caracteriza, a diferencia de los demás métodos empleados, en que no hay una activación previa del soporte, sino que los reactivos de acoplamiento están presentes durante el tiempo de interacción del soporte con la disolución de enzima. En los dos métodos de unión al NPI, el soporte no aporta carga eléctrica y se bloquean grupos amino de la enzima, y en ausencia de acético también grupos carboxilo. Así pues se han aplicado nueve sistemas de inmovilización de tirosinasa sobre soportes en forma de gel y dos de ellos se han empleado también con tubos y membranas. Con todo ello se han ensayado diferentes con- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -37- diciones respecto a varios parámetros determinantes del sistema de inmovilización como son: porosidad del soporte, carga eléctrica del microambiente, mecanismo de acoplamiento, grupo de unión de la enzima, estado físico del soporte etc. También se han estudiado otras variables del sistema de inmovilización relacionadas con la naturaleza de la enzima como: forma funcional (proenzima o enzima), estado de purificación, cantidad de protei'na aplicada, fuente (champiñón, epidermis),etc, con lo que se han estudiado las principales variables que pueden afectar a la inmovilización de tirosinasa. Tabla 3 Resumen de los soportes y métodos de unión aplicados a la inmovilización de tirosinasa. Carga del Denominación soporte del IME Soporte Activación Grupo de unión de la enzima (*) Enzacryl-AA nitroso - A r - O H , Tir nula Enzacryl-AA-IME CPG-AA nitroso - A r - O H , Tir nula CPG-AA-IME nula NPAA nitroso - A r - O H , Tir nula NPAA-IME NB nitroso - A r - O H , Tir (+) NB-nitroso-IME NB glutaraldehido -NH2. Lis nula NB-IME NH glutaraldehido -NH2, Lis — NH-IME NAQA glutaraldehido -NH2. Lis + NAQA-IME NPI acetaldehido/ acético -NH2, Lis nula NPI-acético-IME NPI acetaldehido Lis -NH2, - C O O H , Asp, Glu nula NPI-IME (*) ( +- ) Grupo de unión preferente. No se excluye unión a otros grupos. Carga parcialmente positiva Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -38- 3.5. REACTORES Y METODOLOGÍA DE ESTUDIO DE LAS ENZIMAS INMOVILIZADAS. Tanto para el estudio de sus propiedades, como para aplicar una enzima inmovilizada a fines industriales o analíticos, se requiere llevar a cabo la reacción enzimática propia de ella, para lo cual se ha de conseguir la interacción de la enzima con los sustratos. Con enzima inmovilizada en forma de gel-IME, esta interacción puede hacerse con agitación de la disolución, de las partículas de gel-IME, o de ambas a la vez; también por paso de la disolución sustrato a través de un lecho de gel-IME estático; o por simple difusión de los sustratos sin ninguna agitación. Según la técnica experimental utilizada, estamos ante un tipo distinto de reactor. Las propiedades del IME, especialmente la actividad manifestada, la estabilidad a la reacción, la aplicación a la síntesis del producto de reacción, dependerán del proceso de transferencia de materia que será función del tipo de reactor empleado y de las condiciones de trabajo de éste. Así pues, para determinar la actividad del IME, es necesario diseñar un reactor estándar, respecto al cual definir la unidad de actividad del derivado IME y su comparación con las unidades de actividad de la enzima soluble. El comportamiento cinético del IME puede variar respecto a la enzima soluble, pero además la afinidad aparente por el sustrato se verá muy afectada por los problemas de difusión externa (difusión desde la disolución a las inmediaciones de la partícula), según el tipo y condiciones del reactor. En reactores con fuerte agitación las limitaciones de difusión externa pueden eliminarse, pero pueden permanecer las limitaciones de difusión interna (de la superficie de la partícula al centro activo de la enzima) y éstas ya no dependerán tan claramente del tipo de reactor, sino que serán en gran medida intrínsecas al sistema Soporte-Enzima (Goldstein, 1976). En presencia de limitaciones difusionales, para una enzima michaeliana, la ley cinética se puede expresar de la forma siguiente (Engasser y Horvath, 1973): V ' = >?-(Vmax-S/(KM+S)) Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 (10) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -38- en donde: V es la velocidad real de reacción y el factor efectividad definido como V 7 V c i n , en donde V d n sena la velocidad de reacción en ausencia de limitaciones difusionales De esta ecuación se pueden obtener varias formas linealizadas, pero la representación de los valores experimentales no responde normalmente a una linea recta debido a la dependencia de ^ con la concentración de sustrato (Goldstein, 1976). A continuación se describen los tipos de reactores, sus características y la metodología con que se han empleado en las operaciones experimentales de esta Memoria. 3.5.1. REACTOR DE BAÑO AGITADO ( STR ) En este tipo de reactor, todo el volumen de sustrato a procesar (V S ), se hace interaccionar con el IME, por medio de una fuerte agitación. En la Fig. 17 puede observarse el esquema del montaje empleado para el STR. 1 aire 02 R • o •• • o • • • * * V AM Agitador magnético BM Barra magnética R T Reactor Fluido de termostatización • Partículas de gel-IME o de membranas-I ME troceadas. 9 Burbujas de aire • • í • • r1 T AM / Fig. 17. Esquema de montaje del reactor de baño agitado(STR). \ Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -39- En el reactor STR, la IME se encuentra en las condiciones más semejantes a la enzima en forma soluble (SE), por lo que es el idóneo para el diseño de un reactor estándar de medida de actividad de la IME. Será asi' mismo el más útil para el análisis de sus propiedades generales y la comparación con la SE (Vieth et al. 1976). Los problemas difusionales en este reactor están minimizados por la agitación ( Lilly et al. 1974; Lilly y Dunnil, 1976). Para la reacción catalizada por tirosinasa, se aseguró el suministro de oxigeno necesario por burbujeo de aire. Para seguir el curso de la reacción se tomaron pequeñas alícuotas a distintos tiempos y se determinó en ellas la concentración de producto (L-dopa) acumulado. 3.5.2. REACTOR DE BAÑO AGITADO CONTINUO (CSTR). Un reactor de baño agitado en régimen continuo (CSTR), se ha utilizado con un montaje como el de la Fig. 18Una característica del CSTR atr« °2 BP JL fci - • • « D 0 AM Fig. 18. CF OO J Esquema de reactor de baño agitado continuo (CSTR). A M , a gitador magnético BP, bomba peristáltica. CF, colector de fracciones. P, disolución producto R. reactor. S, disolución sustrato. T, fluido de termostatización. • , partículas de gel-IME. o, burbujas de aire. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -40- es que el volumen del reactor es mucho menor que el del volumen procesado a lo largo de la vida de uso de la IME ( V p > ^ V g ) . En este reactor hay mínimos problemas difusionales gracias a la agitación, pero en él los fenómenos de inhibición por el producto son más notables, dado que , una vez alcanzado un régimen estacionario, la concentración de producto en contacto con la enzima es en todo momento y en todo el volumen del reactor igual a la del fluido de salida (Lilly y Dunnil, 1976). En nuestro caso, el suministro de oxigeno a la reacción estuvo garantizado por un burbujeo constante del reactor. El curso de la reacción se siguió recogiendo el eluido del reactor con un colector de fracciones y midiendo la concentración de L-dopa en cada una de las fracciones recogidas en un determinado tiempo. 3.5.3. REACTOR DE COLUMNA CON LECHO EMPAQUETADO (PBCR) En este caso la disolución sustrato se hace pasar a través de una columna conteniendo gel-IME empaquetado. En la Fig 19 se muestra el esquema del sistema empleado para un PBCR. Tiene la ventaja de ser un sistema continuo y de que se evitan al máximo los fenómenos de inhibición por el producto, pero es el que presenta más problemas difusionales por el empaquetamiento y por la mínima agitación (Pitcher, 1975). La posibilodad de funcionamiento continuo y de automatización, hace que junto con otros reactores de flujo continuo (lecho fluidificado, CSTR, etc), sea el más memcionado para aplicaciones ¡ndusyriales ( Vieth y Venkatasubramanian, 1974c, Weetall, 1975, Vieth et al. 1976). Es el sistema más característico para analozar la estabilidad de la IME para la reacción a largo tiempo. Es el sistema que emplea menor volomen de reactor por unidad de volumen de disolución procesada. Con soportes y condiciones de trabajo sin problemas difusionales es tan eficaz como el STR respecto a su capacidad catalítica y tiene a su favor el que permite sistemas continuos y automatizados, además normalmente en PBCR la vida de uso de la IME es mayor. Sin embargo, con limitaciones difusionales o de baja solubilidad de algún sustrato puede dar bajos rendimientos de cara a usus industriales; por ejemplo, Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -41- aire °2 s o 1 1 0 o p 1 Hffll II i ] o (¡F o o FO Fig. 19. Esquema de montaje para reactor en columna con lecho empaquetado (PBCR) y para reactor tubular (TR). BP, bomba peristáltica. CF, colector de fracciones. FO, frasco de oxigenación. P, disolución producto R, reactor S, disolución sustrato. T, fluido de termostatización. una limitación para reacciones como la de la tirosinasa que requieren oxígeno, es que sólo se suministra el oxígeno disuelto en la disolución de sustrato Al igual que en CSTR, el curso de la reacción de la tirosinasa en este reactor, se siguió recogiendo fracciones a tiempos definidos en el eluído del reactor y determinando la concentración de producto formado. 3.5.4. REACTOR TUBULAR (TR) Con el mismo esquema de montaje que el del PBCR mos- trado en la Fig. 19, se ha empleado en este trabajo enzima inmovilizada sobre la pared interior de tubo de nylon de 1 mm de diámetro. Ofrece respecto al PBCR la facilidad de manejo y mínimos problemas de flujo y de difusión. En la bibliogrfía viene mencionado especialmente para usos analíticos (Sundaram, 1977a) y para aplicaciones médicas (Sundaram 1977b). Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 4. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE TIROSINASA EN ENZACRYL-AA Y EN CPG-AA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -42- 4. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE TIROS1NASA EN ENZACRYL-AA Y CPG-AA. En el presente capítulo se estudiará la actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA y CPG-AA. Se analizarán las propiedades generales, haciendo especial incapié en el estudio del rendimiento del proceso de inmovilización y de las condiciones óptimas para la manifestación de la actividad, su comportamiento cinético y el efecto del ascorbato y la hidracina sobre la reacción catalítica. 4.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN EN ENZACRYL-AA La estabilización por la inmovilización, de la actividad de un sistema enzimático, suele ser una de las propiedades que se argumentan para destacar la aplicación industrial de las enzimas inmovilizadas (Weetall, 1975a; Chibata y Tosa, 1976). Sin embargo es frecuente que la enzima inmovilizada manifieste una menor actividad que la enzima soluble (Ollis y Datta, 1976). En este caso, sólo está justificada su aplicabilidad si el aumento de la estabilidad supera con creces la pérdida de actividad, lo que llevaría consigo una disminución de los costos de preparación de la enzima (Weetall, 1973). Cuando se establece un nuevo método de inmovilización o la aplicación de un método ya existente a una enzima, es habitual que en los mismos se haga referencia tanto a la cantidad de proteína unida al soporte (Axén et al., 1967, 1969; Weston y Avrameas, 1971) como a la actividad manifestada por el derivado IME (Cho and Bailey, 1979; Caldwell et al., 1976a, 1976b). Además ha sido recomendada la especificación concreta de estos datos, así como el de la actividad específica de la enzima soluble y la cantidad de ésta utilizada por gramo de soporte seco en la inmovilización (Comission Biochemical Nomenclature, 1974). A partir de los datos anteriormente expuestos, puede deducirse el porcentaje ó fracción de actividad recuperada en forma Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -43- de derivado inmovilizado, lo que es una característica significativa del sistema de inmovilización utilizado (Axén y Ernback, 1971; Goldstein et al., 1974; Sundaram y Apps, 1977; Brown et al. 1978; Drobnik et al., 1979). Los parámetros que se han utilizado en el estudio del comportamiento de la tirosinasa en el proceso de inmovilización son los siguientes: 1) Rendimiento de unión de proteína ( r p r o t ) , obtenido a partir de la diferencia de protei'na existente en la disolución antes (prot¡) y después (prot r ) de la inmovilización: r = prot (P r o t ¡ - ProV Proti <11) Esta determinación indirecta de la protei'na unida es muy utilizada por su sencillez (Gabel y Axén, 1976). También se han aplicado métodos de determinación directa sobre el IME. Asi', se han empleado la determinación de aminoácidos después de hidrólisis del IME (Axén et al., 1967), medida radiométrica de la enzima unida marcada radiométricamente (Lartigue, 1975) y otros métodos, de los que Gabel y Axén (1976) hacen una recopilación. 2) Actividad sustraída de la disolución de enzima soluble como consecuencia de la reacción de inmovilización, calculada según: Actividad sustraída = (SE¡ — SE r ) SE¡ (12) siendo SE¡ y SE r la actividad de enzima soluble en unidades estándar (U) totales antes y después de la inmovilización. 3) Actividad estándar del IME (Act||^g), que se expresó en unidades de actividad manifestada por unidad de soporte seco cuando se ensayó según el método estándar (Método: 12*8*2). Se calculó por: ActjjñE r *ME/m (13) siendo, IME la actividad total (U ó mU) manifestada por una cantidad m de soporte con enzima inmovilizada; m se expresó en g ó mg de peso seco para gel-IME, en c m £ para membrana-IME y en cm lineal para tubo-IME 4) Eficacia de acoplamiento (Ef. acop.), término definido por Pitcher (1975), como la fracción de actividad que manifiesta el IME respecto a la sustraída de Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -44- la disolución. Se calculó por: Ef. acop. = IME /(SE¡ - SE r ) (14) 5) Rendimiento de inmovilización ( r ¡ n m ) . Parámetro que indica el rendimiento con que la actividad enzimática de la enzima soluble utilizada es recuparada en forma de derivado inmovilizado y que se calculó por la razón de la actividad manifestada por el IME en relación a la de la enzima soluble según : rinm = IME/SEj = "i-Act|ME / VES-ActES¡ (15) siendo: V E g el volumen de disolución de enzima soluble tratada con una cantidad m de soporte, cuyo derivado IME dio una actividad estabdar Act|(^| E ; el término Actg E ¡ representa la actividad de la disolución inicial de enzima soluble empleada por unidad de volumen. La capacidad de un soporte para retener proteínas viene limitada por la densidad de grupos funcionales reactivos de éste y por factores estéricos (Weetall, 1975b), factores determinados por la naturaleza del soporte y de la protei'na. Así, cuando el Enzacryl-AA, activado por el método del ácido nitroso, se trató con cantidades crecientes de tirosinasa activa, la actividad tirosina hidroxilasa del IME aumento de forma lineal con la cantidad de proteína aplicada, hasta que alcanzó una saturación para cantidades superiores a 80 mg /g gel (Fig. 20). El r ¡ n m fué máximo mientras no se alcanzó dicha saturación del soporte ( r ¡ n m = 0 , 7 8 ) , a partir de la cual descendió. En base a estos resultados se puede concluir que existió una cantidad óptima de proteína en la disolución a inmovilizar, que permitió obtener derivados inmovilizados con alta actividad y conservando los valores máximos posibles del rendimiento de inmovilización. Estas cantidades máximas de proteína empleadas, están incluso por enzima de los valores establecidos por la firma suministradora ( 20-50 mg/ g gel; Koch-üght, 1977). A continuación se analizó el efecto de la pureza de la tirosinasa en el rendimiento de inmovilización a Enzacryl-AA, con el fin de observar si la interacción con las proteínas presentes en el extracto afectaban a la preparación del IME. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -45- 80 £ ! 75 < 60 > "s. O 5Z •v» ">o o bü 40 O 1- z < UJ < 20 25 . i 5 zce ? I l x . 50 P R O T E I N A 100 T R A T A D A ( mg/j gel ) Fig. 20. Efecto de la cantidad de proteína sobre el rendimiento de inmovilización de tirosinasa en Enzacryl-AA. Cada ensayo de inmovilización consistió en el tratamiento de 20ml de extracto de t i rosinasa(0,85 U/mg) con concentraciones de ésta para conseguir la cantidad de proteína indicada por las abeisas de los puntos experimentales. Los resultados obtenidos en las medidas de la actividad y protema en las disoluciones antes y después de la inmovilización están expresados en la Tabla 4. Se observa que en todos los casos ensayados, el porcentaje de actividad sustraída de la disolución fué casi total y bastante mayor que el de proteína unida al soporte. Este hecho paracía indicar una unión preferente de la proteína con actividad tirosina hidroxilasa frente a las proteínas contaminantes, lo que se pone de manifiesto por la relación actividad sustraída/r prot , parámetro que proponemos como medida de la especificidad de unión de una proteína al soporte. La causa de esta especificidad de unión podría justificarse por la naturaleza y contenido de los residuos de aminoácidos de la tirosinasa. Así, la inmovilización de proteínas sobre Enzacryl-AA por medio de la diazotación de sus grupos arilamina, suele implicar fundamentalmente a los residuos de tirosina de la proteína (Goldstein et al., 1970; Meirose, 1971); el contenido de tirosina en la tirosinasa de epidermis de rana está dentro de los valores ñor- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -46- Tabla 4 Inmovilización en Enzacryl-AA de tirosinasa en distintos estados de purificación. Resultados obtenidos de las medidas de actividad y protei'na de las disoluciones de enzima antes y después de la inmovilización. Se aplicaron 50 U de SE por gramo de Enzacryl-AA liofilizado. Estado de purificación Etapa Act. esp. SE Actividad r prot sustraída Act. sust r prot (U/mg) 0,23 0,45 0,98 2,2 H 2 0/P¡ 0,50 0,41 0,98 2,4 CM 2,02 0,65 0,99 1,5 Phe 1,84 0,60 0,95 3,0 CM/Phe 3,46 0,59 0,98 1,7 P ¡ males de las proteínas globulares, alrededor del 4 % (Barisas y McGuire,1974; Mikkelsen y Triplett, 1975). Por lo tanto, en base a la composición de tirosina de la proteína, no se puede deducir una unión preferente de la tirosinasa al Enzacryl-AA con respecto a otras posibles proteínas presentes en la disolución. Por otra parte, la pérdida de actividad de la disolución de enzima por el tratamiento de inmovilización, se puede atribuir no sólo a su mayor o menor unión al soporte, si no también a la posible desnaturalización por la interacción con el soporte. A l medir la actividad de los derivados de Enzacryl-AA-IME obtenidos de distintos estados de purificación, manifestaron entre un 73 y 88 % de la actividad que se había sustraído de la disolución (Ef. acop, 0,73—0,88) Tabla 5. Dado que la actividad sustraída de la disolución fué casi del 100 % los rendimientos de inmovilización fueron valores sólo ligeramente inferiores a los de eficacia de acoplamiento ( r ¡ n m = 0,72—0,86). Cabe resaltar el hecho de que el IME manifestó on 72—86 ô de la actividad del SE tratado, cuando sólo el 32—65 % Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 de proteína se unió Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -47- Tabla 5 Rendimiento de inmovilización (r¡ n m ) y eficacia de acoplamiento (Ef. acop.) de tirosinasa a Enzacryl-AA para distintos estados de purificación. Se trataron 50 U por gramo de Enzacryl-AA en iguales condiciones que los resultados expresados en la Tabla 4. Etapa de purificación 'pur Act|ME (U/g gel) Ef. acop. r 'inm 'inm r prot (r 1 ¿obal r ) pur ' i n m ' 1,0 43 0,88 0,86 1,9 0,86 H20/P¡ 0,86 36 0,73 0,72 1,8 0,62 CM 0,52 42 0,82 0,81 1,3 0,43 Phe 0,70 44 0,83 0,79 1,3 0,55 CM/Phe 0,47 38 0,75 0,73 1,2 0,35 al soporte. A l calcular la actividad específica del IME, como U/mg de protei'na, se observó que aumentó con respecto a la del SE en un factor superior a 1. Este factor es igual a la relación r ¡ n m / r p r o t calculada en la Tabla 5. Este hecho, aparentemente sorprendente, hizo sugerir de nuevo la idea de una unión selectiva, más preferente de la tirosinasa al soporte que de las demás proteínas presentes en la disolución. Con esta interpretación, la relación citada debería ser mínima para los estados más purificados. De hecho, para el más purificado fué 1,9, y 1,2 para la disolución de SE menos purificada. Estos valores superiores a 1, también cabrían interpretarse en función de una sobreactívación de la enzima por su unión al soporte. Efectivamente; la enzima utilizada para Ja inmovilización se preparó a partir de protirosinasa que, después del proceso de purificación correspondiente, había sido activada por paso a través de una columna de tripsina-sepharosa, lográndose prácticamente la misma activación que la alcanzada con tripsina soluble; sin embargo, dado que la actividad específica de la tirosinasa aumentó con la inmovilización, se puede sugerir que la unión de la enzima al soporte provocó una sobreacti- vación , como si el tratamiento con tripsina no hubiera logrado toda la activi- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -48- dad potencial de la proenzima. La razón de esta sobreactivación podn'a basarse en el hecho de que se está estabilizando una estructura más desplegada de la enzima, al inducir a los restos de tirosina a ordenarse al exterior de la estructura proteica, por la unión de los mismos a los grupos diazotados del soporte y por la interacción de los residuos apolares con el microambiente hidrofóbico y aromático que proporcionan los grupos arilamina del Enzacryl-AA. Esta interpretación está en la li'nea de lo establecido hasta ahora para la conversión de proenzima a enzima activa. De hecho, en base a las propiedades termodinámicas de la desnaturalización térmica, se ha sugerido que la tirosinasa activa está en un estado más desordenado y más estable que la protirosinasa, tanto estudiando la actividad dopa oxidasa (Galindo, 1976) como con la actividad tirosina hidroxilasa (García Carmona, 1980). Por otro lado, los cambios en los espectros de fluorescencia apoyan la sugerencia de que la enzima se encuentra en una conformación más desplegada (Iborra et al. 1978) y que los restos de tirosina están ordenados más al exterior en la enzima que en la proenzima (Manjón, 1978). Además estas interpretaciones serian coherentes con la mayor hidrofobicidad manifestada por la enzima en la interacción con soportes hidrofóbicos (Iborra et al., 1976; Cortés, 1978). Tal como se observa en la Tabla 5, los rendimientos de inmovilización fueron similares para los distintos estados de purificación de la enzima y las diferencias observadas no guardaron ninguna relación definida con el grado de purificación. Por otro lado, el rendimiento global del conjunto de los procesos de purificación e inmovilización (•'global = r pur ' r inm' fueron mayores para los estados menos purificados, dependiendo su valor más del r_ur r inrrr que del De estos resultados se deduce que para aplicaciones industriales de la t i - rosinasa inmovilizada no parece necesaria su previa purificación. En la próxima Sección se compararán los resultados aquí' expuestos con los obtenidos en la inmovilización de protirosinasa en Enzacryl-AA, enzima en CPG-AA, así como los obtenidos con tirosinasa de champiñón y se compararán con los obtenidos por otros autores. Por otro lado, el efec- to del estado de purificación sobre la estabilidad a la actuación y en el comportamiento en reactores a largo tiempo se analizará en el Cap. 6. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -49- 4.2. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN CPG-AA. COMPARACIÓN CON TIROSINASA DE CHAMPIÑÓN. El CPG-AA posee grupos funcionales arilamina, al igual que el Enzacryl-AA, pero por su diferente esqueleto estructural y sus propiedades físicas, cabría esperar algunas diferencias en las propiedades de la enzima inmovilizada sobre él. Así, cuando se aplicó a ambos soportes la misma cantidad de enzima, con el Enzacryl-AA se obtuvieron derivados inmovilizados con Act||y|g de 35-45 U/g gel, mientras que con CPG-AA de 15-25 U/g gel (Tabla 6). De estos valores se deduce que los rendimientos de inmovilización fueron menores para la obtención del CPG-AA, lo que se atribuyó a una menor densidad de grupos funcionales del soporte. Sin embargo la modificación química provocada a la enzima fué semejante que en la obtención de Enzacryl-AA-1 ME, pues los valores de eficacia de acoplamiento obtenidas fueron semejantes. Así mismo, las propiedades cinéticas y el perfil pH-actividad fueron similares. Así pues, el Enzacryl-AA-IME y el CPG-AA-IME resultaron derivados de tirosinasa de propiedades generales muy parecidas. Las principales diferencias entre ambos están relacionadas con las óptimas propiedades mecánicas del CPG-AA,que determinó notables diferencias en el comportamiento, en reactores con IME funcionando durante largo tiempo, especialmente en reactores de columna empaquetada, lo que se analizará más adelante en relación con su aplicación a la síntesis de L-dopa(Cap. 6 y 8). La tirosinasa de champiñón, que es activa en su estado nativo, es tal vez la tirosinasa más estudiada y la única que se encuentra disponible comercíalmente. Además es la fuente de enzima utilizada en los pocos intentos anteriores de inmovilización de tirosinasa (Wykes et al. 1971; Letts y Chase, 1974; Schiller y Liu, 1976; Schiller et al. 1978), aparte de lo realizado en nuestro Departamento con tirosinasa de epidermis de rana. En este trabajo, se inmovilizó tirosinasa de champiñón en las mismas condiciones que con tirosinasa de epidermis a fin de comparar. Para ello se trataron 50 mU de enzima con CPG-AA en las condiciones indicadas en la Tabla 6. La tirosinasa de champí- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -50- Tabla 6 Comparación de los resultados de inmovilización de tirosinasa de epidermis de rana en CPG-AA y Enzacryl-AA, y con tirosinasa de champiñón en CPG-AA y en fibras de colágeno. La tirosinasa de epidermis de rana, para inmovilizar sobre Enzacryl-AA y CPG-AA, fué extracto HÔ/Pj activado por paso por columna de tripsina-sepharosa. La tirosinasa de champiñón para acoplar a CPG-AA fué obtenida de Sigma (U.S. A. ). Los valores dados para la inmovilización de tirosinasa de champiñón en membranas de colágeno están calculados a partir de los resultados indicados por Letts y Chase (1974). Soporte: Enzacryl-AA Fuente de enzima: CPG-AA CPG-AA membranas de colágeno (Letts y Chase, 1974) epid. rana epid. rana champiñón champiñón Act. esp. del SE (U/mg) : 0,85 0,85 0,05 Enzima tratada(mU/mg gel): 50 50 50 88 m U / c m 2 Fracción de actividad sustraída: 0,97 0,61 0.08 0,25 'prot 0,51 0,39 0,06 0,41 21 2,4 1,14 mU/cm 2 Act||y|E(mU/mg gel): 35 Efic. acopl.: '¡nm • r¡i n m / r (*) p r o t (*)= 0,25 0,72 0,68 0,60 0,053 0,70 0,42 0,05 0,013 1 1,08 0,83 0,031 -37 Esta razón es igual a la razón: Act esp. I ME / Act. esp. SE ñon dio muy bajos rendimiento de inmovilización (r¡ n m =0,05) en comparación con tirosinasa de epidermis de rana((r¡ nm =0,42). Asi', la baja actividad recupera da en el derivado inmovilizado, respondió a que la enzima se unió en baja proporción al soporte, lo que pudo comprobarse por la razón de protei'na unida (rp r o t =0,06) y por la fracción de actividad sustraída de la disolución de SE uti- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -51- lizada( (Act. sust.=0,08), que fueron muy inferiores a los obtenidos con tirosinasa de epidermis de rana. Estos hechos se interpretaron en función de las actividades especi'ficas de las disoluciones de enzima utilizadas, ya que las preparaciones de tirosinasa de champiñón, obtenida comercialmente, dieron una actividad especi'f ica muy inferior (0,05 U/mg) a las de rana obtenidas por nosotros (0,2 U/ /mg en extractos P¡; 7-10 U/mg en purificado CM/Phe), habiéndose empleado para estas experiencias extracto HÔ/Pj. Tal como se describió anteriormente para el Enzacryl-AA,( Fig. 20, cap.4.1), cuando se aplica una cantidad de proteína muy superior a la máxima capacidad del soporte, éste se satura y da bajos r ¡ n m . Sin embargo, de la actividad sustraída de la disolución, el 60 % se manifestó en el derivado IME (ef. acop.=0,6), lo que representó una eficacia de acoplamiento cercana a la obtenida con epidermis de rana. Así pues, aunque la cantidad de proteína en las disoluciones de tirosinasa de champiñón limitó el rendimiento de inmovilización de su actividad al CPG-AA, la eficacia de acoplamiento obtenida, demostró que el efecto de la modificación química producida en la enzima por la unión covalente al CPG-AA, fué del mismo orden que con la enzima de rana. De todo ello se deduce, que las limitaciones del uso de tirosinasa de champiñón no vienen determinadas por las características químicas de las moléculas de enzima ni por el método de inmovilización que fué apropiado, sino por el alto contenido de proteína de las preparaciones de enzima. Letts y Chase (1974) obtuvieron muy bajos valores de r ¡ n m al inmovilizar tirosinasa de champiñón en membranas de colágeno ( r ¡ n m = 0,013). La actividad específica del derivado IME que obtuvieron fué muy inferior a la del SE (Act esp. IME/Act esp. SE = •'¡nrrAprot = 0,031), lo que los autores lo atribuyeron a la unión menos preferente de la tirosinasa que de otras proteínas, en base a que la razón o rendimiento de proteína unida al colágeno fué superior a la fracción de actividad sustraída de la disolución ( r p r o t = 0 , 4 1 ; Act. sust.= 0,25); sin embargo el valor de ésta última, no puede justificar tan bajos valores de r ¡ n r n , y de actividad específica de la proteína inmovilizada. Por otro lado, a partir de los datos reseñados por los autores, puede deducirse un valor de eficacia de acoplamiento muy pequeño (ef. acop. = 0,053), lo que representa que sólo el 5,3 % de la actividad sustraída de la disolución se manifestó en el Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -52- derivado inmovilizado. Por lo tanto, en este caso las limitaciones vienen impuestas por el propio método de inmovilización, que disminuyó drásticamente la eficacia catalítica de la enzima al inmovilizarla. Dado que la inmovilización la realizaron por oclusión en el colágeno, que es un método físico, no hubo modificación química de la enzima y por lo tanto, la disminución de la actividad sólo pudo ser debida al microambiente que proporcionaba el soporte y/o a limitaciones difusionales. La importancia que tuvieron estas últimas lo prueba el hecho de que la actividad que observaron en reactor de flujo continuo fué un orden de magnitud inferior a la reseñada en la Tabla 6. Además cuando intentaron aumentar la estabilidad de la unión de la enzima al soporte tratando el IME con glutaraldehido y otros reactivos bifuncionales, la modificación química producida disminuyó aún más la actividad del IME. Cabe resaltar pues, que ¡a inmovilización covalente de la tirosinasa de epidermis de rana en Enzacryl-AA y en CPG-AA dio resultados muy superiores respecto a los rendimientos de inmovilización y eficacias de acoplamiento que lo publicado anteriormente con tirosinasa de champiñón, e incluso con esta última la alta eficacia de acoplamiento al CPG-AA demostró que con preparaciones más purificadas de enzima podrían obtenerse mejores rendimientos de inmovilización. Con todo ello se ha logrado pues dar un paso adelante en la aplicabilidad de la tirosinasa inmovilizada. 4.3. ESTUDIO DE LAS CONDICIONES ÓPTIMAS DE ENSAYO DE LA A C T I V I D A D TIROSINA HIDROXILASA DEL ENZACRYL-AA-IME. Dado que las enzimas pueden modificar notoriamente sus propiedades por la inmovilización (Vieth y Venkatasubramanian, 1974b), fué necesario analizar las condiciones óptimas para la expresión de la actividad de la tirosinasa inmovilizada. En este apartado se expresan el efecto de la fuerza iónica, pH y temperatura sobre la actividad. En primer lugar se estudió el perfil pH-actividad,. para el En- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -53- zacryl-AA-IME preparado con enzima purificada y activada, en el intervalo de pH 6 a 8 a dos fuerzas iónicas distintas suministradas por tampón fosfato 0,05 M y 0,10 M, y se compararon con el de la enzima soluble purificada de la misma forma Para las dos fuerzas iónicas analizadas, el pH óptimo se desplazó muy ligeramente (0,3 unidades de pH) hacia pH alcalino con respecto al SE. Los desplazamientos hacia zonas más básicas de pH están en consonancia con lo esperable según. Katchalski et al (1971) para soporte de naturaleza polielectrolitica con una ligera carga negativa. El tramiento matemático se basa en la consideración de una distribución de Maxwell-Boltzman para la concentración H entre la parti'cula de gel-IME y el medio: a u / a „ x t = exp H pH = pH¡ siendo: ajj y a^ xt z i e I^ kT (15) pHext = pHopt la actividad SE de H de donde se deduce: - P Hopt |ME z i el V = 0,43 —¡^ 06) en el medio interior y exterior al gel; z, la carga del ion; e, la carga eléctrica elemental; Y el potencial electrostático en el dominio de la partícula de gel-IME; k, la constante de Boltzman; T la t temperatura absoluta; pH¡ y p H e x ^ , los pHs del medio interno y externo de la partícula; p H o p j g E y p H O D j |(^£ , los pHs óptimos del SE eelME. En nuestro caso con pH = — 0 , 3 , conduciría a un valor de ^ muy ligeramente negativo en comparación =—18 mV, valor sólo m — 50-150 mV esperable de la teoría de polielectrolitos ionizados (Goldstein, 1976). Así, el valor d e ^ obtenido no es significativo, ni atribuíble a que el soporte esté cargado e influya en la expresión de la actividad con el pH. De hecho la actividad dopa oxidasa de la misma enzima en este soporte (Manjón, 1978) dio también un ligero desplazamiento del pH hacia pH ácido. El efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del Enzacryl-AA-IME, se determinó a diferentes fuerzas iónicas suministradas por distintas concentraciones del tampón fosfato de pH 7,0 utilizado (entre 0,02 y 0,36 M). La actividad del IME aumentó ligeramente al disminuir la fuerza iónica (Fig.22) Este hecho está en consonancia con la hidrofobicidad manifestada por la enzima (Cortés, 1978) y fué semejante al observado con la actividad dopa oxidasa. Da- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -54- Fig. 21 Perfiles pH—actividad del Enzacryl-AA-IME. Comparación con SE a dos fuerzas iónicas. 1.0 < > < _i UJ ce Q < 0,5 ü < A Enzacryl-AA-IME á Enzacryl AA IME OSE • SE FOSFATO 0.05 M FOSFATO 0,1 M —» 6 7 8 PH i 7 pH F U E R Z A Fig. 22. I Ó N I C A Efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del Enzacryl-AA-IME. Ensayos a pH 7,0 y T 25°C. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -55- do que la forma activa de la enzima es una conformación desplegada, la disminución de la fuerza iónica favorecerá ese desplegamiento, pues al disminuir la concentración de iones en el medio hace más favorable termodinámicamente la interacción de los residuos hidrofi'licos con el entorno acuoso. Por otro lado,el uso de tampón menos polar como tris-fosfórico en lugar de fosfato, condujo a un ligero incremento de la actividad del IME, al igual que el ocasionado por adicíón de 1 % de acetona. Este ligero aumento de la actividad es significativo de que un ambiente hidrofóbico favorece la conformación activa de la enzima. De todo esto se deduce que el uso del IME es preferible realizarlo a fuerzas iónicas bajas, con una concentración de fosfato mínima necesaria para asegurar una capacidad reguladora suficienteepara mantener el pH dentro de los valores recomendables. En general con la inmovilización, las enzimas aumentan su estabilidad térmica, ya que la unión al soporte incrementa la resistencia a perder la conformación activa (Barker y Epton, 1970). Asi', se ha observado que muchas enzimas al inmovilizarlas, se incrementa la temperatura óptima a la cual manifiestan máxima actividad (Gabel y Kasche, 1976), aumentando además la resistencia al tratamiento térmico, llegándose incluso a activación de algunas enzimas por cortos tratamientos térmicos previos a. la medida de actividad (Knigts y Light, 1974; Manjón, 1978). Los efectos del tratamiento térmico sobre la tirosinasa se han estudiado para la actividad dopa oxidasa, tanto de la proenzima y enzima soluble (Galindo, 1976), como de la enzima inmovilizada sobre Enzacryl-AA (Manjón, 1978), habiéndose encontrado un aumento notable de la resistencia térmica en esta última. Garci'a Carmona (198)) lo hizo sobre la actividad tirosina hidroxilasa de protirosinasa y tirosinasa solubles, obteniendo un resultado comparable al de dopa oxidasa. En nuestro caso se ha analizado el efecto de la temperatura sobre la actividad tirosina hidroxilasa manifestada por Enzacryl-AA-IME, encontrándose que a 25 °C la enzima manifestó un máximo de actividad (Fig. 23). De los resultados obtenidos en este apartado, se dedujo que las condiciones de pH 7,0, fosfato 0,1 M, temperatura 25 °C, eran condiciones idóneas para la utilización de Enzacryl-AA—IME, con la ventaja de ser las mis- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -56- Fig. 23 Variación de la actividad tirosina hidroxilasa de Enzacryl-AA-IME con la tempeE ratura de ensayo. LU ü < 20 40 60 80 TEMPERATURA DE ENSAYO (°C) mas condiciones óptimas de ensayo para la enzima soluble. En el Cap. 6.4 se analizará el efecto de estos factores sobre la estabilidad del Enzacryl-AA-IME para su actuación a largo tiempo. 4.4. COMPORTAMIENTO CINÉTICO DEL E N Z A C R Y L - A A - I M E Las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas suelen alterarse con respecto a sus homologas solubles por las siguientes causas: 1) La modificación química covalente, los efectos esféricos ó las fuerzas electrostáticas y las interacciones hidrofóbicas que el soporte ejerce sobre la enzima pueden afectar a su conformación. En ausencia de otros efectos, se obtendría la de- nominada velocidad de reacción intn'nseca del IME (Engasser y Horvath, 1976), de lo que se deducen los correspondientes parámetros cinéticos intrínsecos. 2) Los efectos de partición pueden determinar la existencia de concentraciones diferentes en el microambiente que rodea a la enzima y el macroambiente de la di- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -57- solución. Estos efectos, en ausencia completa porcionaba 3) la llamada velocidad inherente del entre el micro externas son fácilmente (Lilly también et por y suprimibies al., 1974). La la agitación y el macroambiente con limitación por de espesor de membrana del rentes al inmovilizado. propio derivado sus correspondientes reacción efectiva. La IME, limitaciones difusional un gradiente la enzima. ae agitación interna puede del tamaño pero en parte del reac- disminuirse pueden considerarse se obtendrá Las de partícula Para unas condiciones difusionales, relación entre de las condiciones la disminución pro- IME. Las resistencias difusionales internas y externas provocan de concentraciones tor de problemas difusionales, o inhe- reales, con la velocidad de V e f e c./ Vinh es el denominado factor efectividad (Engasser y Horvath, 1976). En nuestro caso para analizar la cinética de la actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada, se aplicó la técnica de baño fuertemente agitado, tal como se describe para el método estándar de medida de actividad del IME (Método: 12.8.2). En estas condiciones las limitaciones difusionales se redujeron al mínimo, pudiéndose afirmar que se midió la velocidad de reacción inherente y por lo tanto se determinaron los parámetros cinéticos denominados inherentes. Se compararon las diferencias de comportamiento en función del estado de purificación de la muestra de tirosinasa que se inmovilizó. Se observaron cinéticas de primer orden para los derivados de Enzacryl-AA-IME obtenidos con tirosinasa bajo la forma de extracto P¡, extracto H2O/PJ y purificado CM (Fig. 24). Sin embargo los derivados Enzacryl-AA-IME obtenidos a partir de tjro-sinasa purificada Phe y CM/Phe mostraron una cinética con parcial saturación; a partir de ellos se dedujeron los parámetros cinéticos correspondientes por la representación de Lineweaver-Burk (Fig. 25). De las abcisas de los puntos de corte de las rectas de dicha figura, se calcularon los valores de KJ^J 2,7 mM y 2,0 mM. Estos valores fueron del mismo orden que los obtenidos con enzima soluble y figuran expresados, junto con las constantes cinéticas de velocidad, en la Tabla 7. A pesar de todo, en ningún caso se llegó a una saturación completa de la velocidad de reacción respecto al sustrato, debido a la baja solubilidad de la L-tirosina (0,453 g/l ó 2,5 mM, en agua a 25 °C, Merck Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert A ' 4 s *. 8 < o o 1,0 1,5 2,0 L- T I R O S I N A Fig. 24. ( mM ) Cinética del Enzacryl-AA-IME para distintos estados de purificación de la enzima. <• CM/Ph* 0,3 % (min . j»M'' ) 0.2 _y^Ô 0.1 Ss • i 05 1,0 1/S Fig. 25. « 1,5 • 2,0 (mM 1 ) Representación de Lineweaver-Burck de la cinética de los derivados de Enzacryl-AA-IME preparados con tirosinasa purificada Phe y CM/Phe. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -584.5. EFECTO DEL ASCORBATO Y DE LA HIDRACINA SOBRE LAS ACTIVIDADES DEL SE Y DEL IME. En el capítulo 2.1 ya se ha comentado que en presencia de de ascorbato y de tirosinasa de champiñón, EI-Bayoum¡ y Frieden (1957) observaron que el catecol no se oxidaba a la quinona correspondiente, pero sí dio un consumo de ascorbato. Igual fenómeno se observó con tirosinasa de Neurospora utilizando L-dopa ó L-tirosina como sustrato (Sussman, 1961). La oxidación de ascorbato podía ser detectada a 265 nm y se podía considerar como una manifestación de la actividad de tirosinasa; incluso este método es utilizado actualmente como criterio de medida de actividad en preparados comerciales de tirosinasa de champiñón (Sigma, 1980). La estequimetría de las reacciones de oxidación en presencia de ascorbato, fueron estudiadas en tirosinasa de Neurospora por Fling et al. (1963) y sugirieron que la dopaquinona formada por oxidación enzimática de L-dopa, era reducida no enzimáticamente por ascorbato para dar de nuevo L-dopa, en lugar de oxidarse no enzimáticamente a dopacromo (Horowitz et al., 1970). Otros reductores como el ferrocianuro producen un efecto semejante al ascorbato (Sussman, 1961). Por otra parte, la h id rae ¡na y derivados manifiestan una inhibición de la melanogenesis en diferentes etapas. Así, el ácido hidracinoflorético (AHP) y otros ácidos con grupos hidroxifenólicos manifiestan inhibición competitiva respecto a la formación de dopacromo, como análogos de la L-tirosina (Fourche et al., 1977). Sin embargo disoluciones de AHP, de L-tirosina, y mezclas de L-tirosina y AHP, en presencia de tirosinasa de champiñón, consumen oxígeno a velocidades comparativamente semejantes, lo que implica que en realidad actúan como sustratos, cuyos productos oxidados no pueden ciclarse para dar las formas indólicas coloreadas de la forma con que la L-dopa lo hace a dopacromo (Fourche et al.,1978). La fenilhidracina y los derivados como el ácido o-hidracinobenzoico y p-hidrazinobenzoico, además de ser inhibidores de la melanogenesis son también inhibidores del consumo de oxígeno, pero de tipo no competitivo, lo que parece un fenómeno general debido, según afirma Fourche et al. (1977), al grupo N ^ - NH2, lo cual se haobservado con el derivado más Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -59- simple, el sulfato de hidracina. Lerner et al. (1971), habi'an observado anteriormente que la fenilhidracina mostraba inhibición no competitiva e irreversible con muchas catecolasas vegetales, incluyendo la tirosinasa de champiñón; inhibición que aumentó con el tiempo de incubación y que requirió oxi'geno, pero que fué independiente de la presencia de fenoles. Sin embargo la fenilhidracina estimulaba la oxidación enzimática de p-cresol y por lo tanto la actividad cresolasa. La hidracina ha sido también utilizada por Patel y Okun (1977) como agente reductor para evitar la oxidación de L-dopa formada a partir de L-tirosina por tirosinasa de champiñón y por peroxidasa de rábano, con tal de demostrar la posibilidad de hidroxiláción de L-tirosina por peroxidasa; el empleo de hidracina en lugar de ascorbato viene justificado por los autores para evitar la oxidación no enzimática de la L-tirosina que el ascorbato parece catalizar en presencia de peróxidos , favorecida por la presencia de los iones metálicos Cu + 2 y F e + 2 (Bezssonoff y Leroux, 1946; Udenfriend et al., 1954). 4.5.1. EFECTO DEL ASCORBATO E HIDRACINA EN LA FORMACIÓN DE DOPACROMO. En nuestro caso, hemos analizado el efecto del ascorbato y de la hidracina sobre las actividades de la tirosinasa de epidermis de rana, tanto en forma soluble como inmovilizada. La acumulación neta de L-dopa, obtenida por oxidación enzimática de L-tirosina en presencia de ascorbato, ha sido expuesta anteriormente cuando se estudió la cinética de la actividad tirosina h¡droxilasa de tirosinasa (Cap.2). En ausencia de ascorbato, la tirosinasa catalizó la formación de dopacromo, tanto si se partió de L-tirosina como de L-dopa como sustratos; la reacción se siguió espectrofotométricamente a 475 nm y el comportamiento fué semejante para enzima soluble (Fig. 26) e inmovilizada (Fig. 27). Utilizando la misma concentración para ambos sustratos (2,5 mM), la velocidad de formación de dopacromo fué, con L-tirosina, aproximadamente el 30 % que con L-dopa, siendo con L-tirosina prácticamente constante en el tiempo de reacción ensayado (5 min), mientras que con L-dopa decayó rápida- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -60- 0,10 9 Sir. inhibidores A Hrdractna ' mW O Ascorbato 1 mM Fig. 26 Efecto del ascorbato y la hidra- S L TIROSINA cina sobre la formación de dopacromo con SE. 100 I de extracto de SE con 3 mi de disolución sustrato (L-tirosina o L-dopa 2,5 mM). 2 4 6 T I E M P O 0,3 ( min ) Fig. 27. # Sm inhibidores ¿ Hidracina t mM O Ascorbato 1 mM Efecto del ascorbato y la hidracina sobre la formación de dopacromo con Enzacryl-AA-IME. 8 mg gel-IME en 20 mi de disolución sustrato (L-tirosina ó L-dopa 2,5 mM). 2 T I E M P O 4 6 ( min ) Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -61- mente. La presencia de ascorbato((l mM) provocó una completa inhibición de la formación de dopacromo, tanto con L-tirosina como con L-dopa. y el efecto inhibidor fué semejante con SE que con Enzacryl-AA-IME. Con hidracina el fenómeno observado fué similar, salvo que permaneció una ligera actividad residual. Por otro lado, con ascorbato o con hidracina la tirosinasa catalizó la formación de L-dopa a partir de L-tirosina, como ya se ha indicado en el Cap. 2; por lo tanto el proceso impedido fué la conversión neta de L-dopa a dopacromo. 4.5.2. EFECTO DEL ASCORBATO Y LA HIDRACINA SOBRE EL CONSUMO DE OXIGENO. En este apartado se analiza el consumo de oxi'geno en las reacciones catalizadas, por tirosinasa en presencia de ascorbato y de hidracina con tal de, en primer lugar, tratar de conocer el papel que pueden desempeñar estos agentes reductores, y en segundo lugar, de averiguar hasta qué grado se requiere un suministro de oxigeno en reactores con tirosinasa inmovilizada. Aunque en presencia de ascorbato o de hidracina no hay oxidación neta de la L-dopa, sin embargo no parece que, en principio, se modifique notablemente el mecanismo de acción de la tirosinasa si tenemos en cuenta los siguientes hechos observados con extractos solubles de tirosinasa: 1) La velocidad de reacción , medida como formación de ^HOH a partir de L-tirosina-3,5- H en presencia o en ausencia de ascorbato es la misma que la de formación de dopacromo en ausencia de ascorbato (Pomerantz, 1964, 1966). 2) Las propiedades cinéticas de de la actividad tirosina hidroxilasa obtenidas en presencia de ascorbato midiendo la formación de L-dopa (Cap. 2), fueron semejantes a las determinadas en ausencia de ascorbato, tanto siguiendo la formación de dopacromo, como con el método radiométrico (García Carmona, 1980). La oxidación de L-tirosina a dopacromo, probablemente con L-dopa como intermediario, comportó un consumo de oxi'geno de 12,5 U.O./min Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -62- bajo las condiciones de hidracina expresadas en la Tabla 8-A; la presencia de ascorbato o impidió la oxidación de la L-dopa formada con la correspondiente acumulación de esta, sin embargo, en este caso, la velocidad de consumo de oxi'geno ( V Q ) fué muy superior (20,5 y 25,0 U.O./min). Este hecho puede explicar la afirmación realizada por Lerner et al. (1974) de que la fenilhidracina y ascorbato estimulaba la oxidación enzimática de p-cresol en vegetales, dado que estos autores medi'an la actividad mediante el consumo de oxi'geno. Con sustrato L-dopa, que dio lugar a una velocidad de formación de dopacromo 3,2 veces superior que con L-tirosina, dio una V Q ? 1,7 veces superior que al utilizar L-tirosina (21,0 U.O./min, Tabla 8-B). Si la V 0 2 fuera 1,6 veces superior, corresponden'a proporcionalmente al hecho de que con L-dopa sólo hay una etapa de oxidación. Por lo tanto las diferencias entre L-tirosina y L-dopa como sustratos respecto de las velocidades de consumo de oxi'geno y de formación de dopacromo, parecen cumplir relaciones coherentes estequiométricamente cuando la reacción se lleva acabo en ausencia de ascorbato. Cuando a la reacción con L-dopa se le añadió ascorbato o hidracina, la V 0 2 aumentó unas 2 veces (40 — 45 U.O./min.). Con este hecho se confirma claramente que la presencia de ascorbato no detuvo simplemente la reacción correspondiente a la actividad dopa oxidasa, sino que provocó otra reacción oxidativa con una velocidad de consumo de oxigeno incluso superior. Esta reacción podn'a impedir la oxidación de L-dopa por uno de los siguientes mecanismos: A) Por la existencia de una reacción oxidativa que compita con la catálisis enzimática de la oxidación de L-dopa; esto implican'a una interacción del agente reductor con la molécula de enzima actuando como dador de electrones. El efecto del reductor podría ser , en este caso, semejante al asignado a otras hidroxilasas que contienen Cu , como por ejemplo la tirosina hidroxilasa adrenal y la dopamina-i3-hidroxilasa ( Gunsalus, 1974) que participan en la biosi'ntesis de catecolaminas; en ellas, el sustrato es monooxigenado a expensas de oxígeno molecular, al mismo tiempo que el Cu es oxidado a C u + ¿ ; el cofactor reductor, lleva a cabo la reducción del C u + ^ a la forma reducida original de Cu , inicián- dose de nuevo el ciclo catalítico y no son absolutamente específicas respecto al reductor. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -63- Tabla 8 Consumo de oxígeno, en presencia y ausencia de ascorbato o hidracina, en las reacciones de oxidación de L-tirosina y L-dopa catalizadas por extractos solubles de tirosinasa. Ensayos control realizados en ausencia de enzima o de sustrato. Condiciones de ensayo Vrk L-tirosina (mM) L-dopa (mM) Enzima (mU/ml) Ascorbato (mM) Hidracina (mM) °2 (U.O./min) (*) A 2,5 2,5 2,5 — — — 33,5 33,5 33,5 — — 2,5 2,5 2,5 33,5 33,5 33,5 2.5 2,5 2,5 2,5 2,5 — — — — — — — — — — — — — — — B C D — 10 — — — 10 — — 10 — — — — — — — — — — — 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 — — — — — — — — — — — — — 33,5 — — 33,5 33,5 5 10 — — 5 10 — — — — 10 — 10 — 10 5 10 — — — 5 10 — — — 10 — 10 12,5 20,5 25,0 21,0 40,0 45,5 0,0 1,7 2,2 0,6 2,6 0,0 1.7 2,6 0,6 1.2 0,0 0,0 0,5 0,0 1.3 1.3 (*) U.O. = Unidad de cantidad de oxi'geno consumido, que se definió como la cantidad del 1 % del oxigeno disuelto en 1 mi de disolución saturada con aire atmosférico ( O2 ~ 0,26 mM ) A) Ensayos con L-tirosina D) Controles sin sustratos B) Ensayos con L-dopa Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 C) Controles sin enzima Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -64- B) Por existencia de una reacción en que el ascorbato o la hidracina actuase reduciendo a un producto de oxidación de plican'a L-dopa, regenerando ésta; esto ¡m- que en realidad no se habn'a detenido la acción enzimática de la tirosinasa como dopa oxidasa. Sen'a la interpretación dada por Fling et al (1963), de la reducción de la dopaquinona obtenida por la oxidación enzimática de la L-dopa. La formación de estas quinonas ha sido observada en algunas fenolasas vegetales en las que la quinona es el producto final de oxidación de sus sustratos específicos. Con tirosinasas de animales y otras que emplean L-tirosina como sustrato, la formación de dopaquinona como producto de reacción enzimática es hasta ahora una suposición, dado que el dopacromo es el producto realmente observado. Se han iniciado trabajos para la detección de esta dopaquinona (García Carmona y García Cánovas, 1980). En ausencia de enzima, pero en presencia de ascorbato o de hidracina se obtuvieron valores mínimos de V 0 2 de 0,2 — 2,6 U.O./min, en las condiciones de la Tabla 8-C, lo que implica que el sistema L-tirosina/ascorbato ó el L-dopa/ascorbato son sólo muy lentamente oxidables, pero lo suficiente para detectarse la formación de L-dopa de forma no enzimática, lo que pudo comprobarse dejando L-tirosina en presencia de ascorbato o de hidracina durante 24 horas a temperatura ambiente y determinando la concentración de L-dopa formada alcanzando concentraciones dé 0,07 mM. Es conocido que las radiaciones U.V. favorecen la conversión no enzimática de L-tirosina a L-dopa, mecanismo al que se le asignó, originalmente, la oxidación de L-tirosina a L-dopa en el proceso de la pigmentación de la piel (Arnow, 1937b). Igualmente hubo un ligero consumo de oxígeno (1,3 U.O./min) en el sistema enzima/reductor en ausencia de sustrato (Tabla 8-D). Con enzima inmovilizada se observó el comportamiento sorprendente, respecto al consumo de oxígeno, que está expresado en la F¡g.28; después de 15 horas de funcionamiento continuo de un reactor empaquetada con EnzacrylAA-IME y sin reciclaje del sustrato, se perdió el 70 % d e la capacidad catalítica de conversión de L-tirosina a L-dopa en presencia de ascorbato, sin embargo, el consumo de oxígeno no sólo no disminuyó, sino que aumentó con el paso de Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -65- 0,3 • tampón fosfato i disolución sustrato < a. 0,2 ^--'"""""l 1 ~"~"---^^^ / » O 0,1 J . "V^^ i 1 1 0,0 1 0 5 1 10 T I E M P O 80 3 d^ O o 60 sz> V) z o o o zUJ 20 o 40 ^^""V. ^ ^ ^ Í _ 100 X o o 15 (horas) Fig. 28. Oxígeno consumido y L-dopa formada en un reactor de columna empaquetada (PBCR). Medidas de L-dopa y oxi'geno a la salida del reactor. Disolución sustrato suministrada: L-tirosina, 2,5 m M ; ascorbato, 2,5 mM; fosfato 0,1 M, pH 7,0; saturada de aire a 25°C. la disolución sustrato a través de la columna; el consumo de oxígeno desapare-: ció cuando se sustituyó la disolución sustrato por disolución tampón. Esto parece indicar que el citado consumo de oxígeno pueda ser debido a una interac- ción del ascorbato con el oxígeno en presencia de la enzima inmovilizada. 4.5 3. CONSUMO DE ASCORBATO EN LA REACCIÓN Cuando se ensayaron las actividades tirosina hidroxilasa y dopa oxidasa de tirosinasa se observó que la concentración de ascorbato, medida espectrofotométricamente a 265 nm, decreció con el tiempo de reacción (Fig.29), hasta que se alcanzó una concentración mínima, a partir de la cual sa inició un incremento de la absorbancia por formación de dopacromo. Cuando se utilizó L-dopa como sustrato, la concentración de ascorbato disminuyó linealmente con el tiempo, y la velocidad de consumo del ascorbato (Vasc) fué proporcional a la cantidad de enzima aplicada. Sin embargo con L-tirosina, la desaparición de ascorbato no cumplió las mismas leyes de va- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -66Extracto (mi) Fig. 29. Consumo de ascorbato en la reacción catalizada por tirosi nasa soluble.Efecto del tipo de sustrato y de la cantidad de enzima. Ensayos con 3 mi de disolución Sustrato (S) 2,5 mM, Ascorbato inicial, 0,125 mM 4 6 8 T I E M P O 10 ( min ) Fig. 30. Consumo de ascrobato en la reacción catalizada por Enzacryl-AA-IME. 0,8 4 mg gel-IME en 5 mi de LO disolución de sustrato re- ce S = L-tirosina ciclando a través de cubeta de flujo del espectrofotó- o z < metro. 0,4 Sustrato 2,5 mM CC Ascorbato inicial, 0,125 mM. O tfí 00 < 0,0 _l_ J. 1 2 T I E M P O ( min ) Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -67riación, no pudiéndose relacionar directamente con la cantidad de enzima aplicada , aunque si' existió una mayor velocidad de consumo de ascorbato al au-> mentar la cantidad de enzima. El comportamiento de la enzima respecto al con sumo de ascorbato no se modificó sensiblemente con el uso de enzima inmovilizada en Enzacryl-AA, dando curvas de ascorbato frente a tiempo del mismo tipo (Fig. 30), Para analizar el significado de las curvas de consumo de ascorbato con sustrato L-tirosina, se representó la variación de la velocidad de consumo de ascorbato con el tiempo (Fig. 31). Se observó que la V a s c aumentaba linealmente con el tiempo de reacción, al igual que lo haci'a la concentración de L-dopa formada. Este resultado indicó que la velocidad de consumo de ascorbato debi'a estar relacionada con la concentración de L-dopa formada en IDU " ^ > ^s^ ^•v. \ _ 100 \ . • \ i 5 • y * • • X. / 80 \ \ \ \ * X * o t- • \ • JT • 50 • * 8 < _J T 1 • • ao . 20 ^w z X X X^ V^^ J^ \ J* - 20 j • 1 ¡ 8 < - 40< < S ce O . 30 • 10 O i (O S t _J 2 1 1 1 4 TIEMPO i 1. 1 - „ 6 ( rnin. ) Fig. 3 1 . Variación de la velocidad de consumo de ascorbato con el tiempo de reacción en presencia de L-tirosina. Comparación con la concentración de L-dopa formada con el tiempo. Condiciones de ensayo: las de la Fig. 29 para 2 0 0 y t f de enzima y con sustrato L-tirosina. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -68- Fig. 32. S Efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de consumo de ascorbato con Enzacryl-AA-IME.4 4 mg de gel-IME en 10 mi de disolución sustrato conteniendo ascorbato 0,125 mM. Para sustrato L-tirosiV a s c fué medida como valor medio en el intervalo de 1 a 2 minutos de reacción. 0,20 1 O 5 0,15 CQ CC O ü / L-dopa C/3 < o 0,10 D z O O Q < u O O 0,05 > 0,0 [ ^ ^ ~ ^ ^ í L-tirosina 1 i 1 2 S U S T R A T O (mM) cada momento. Esta afirmación se confirmó cuando se estudió el efecto de la concentración de los sustratos sobre la velocidad de consumo de ascorbato empleando Enzacryl-AA-IME (Fig. 32), resultando lineal con la concentración de L-dopa. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 5. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -70- 5. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES GENERALES DE PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA. En este capítulo se pretende analizar el efecto de la unión de protirosinasa al Enzacryl-AA sobre la manifestación de la actividad tirosina hidroxilasa de la proenzima inmovilizada (Enzacryl-AA-1MP), ya que existía el antecedente de la activación parcial de la actividad dopa oxidasa por la unión covalente a soportes sólidos (Iborra et al, 1979). Así mismo se estudian las propiedades generales del Enzacryl-IMP, cuando este derivado fué posteriormente activado por tratamiento con tripsina soluble, y de su comparación con las propiedades manifestadas por el Enzacryl-AA-IME, en el que la activación con tripsina fué previa a su inmovilización, se dedujo la forma de proteína apropiada para la inmovilización de tirosinasa. 5.1. ACTIVACIÓN DE PROTIROSINASA. Purvis y Depstedt (1957) fueron los primeros en estraer la tirosinasa de epidermis de Rana Pipiens añadiendo tripsina antes de la homoge- neización, e interpretaron que la tripsina actuaba solubilizando las células y favoreciendo la liberación de tirosinasa. Posteriormente se consideró que, en su estado nativo, se encontraba como proenzima (McGuire, 1970; Barisas et al. 1973; Benson y Triplett, 1974), ya que los extractos solubles de ésta(SP) no manifestaban actividad dopa oxidasa. Miller et al (1970) aislaron y detectaron oxidasas de L-tirosina, dopamina y L-dopa de Rana pipiens, que en piel y ovario eran casi i- nactivas para L-tirosina y L-dopa, siendo activadas por tratamiento con tripsina. Hasta el presente se han descrito varios procedimientos de activación de la tirosinasa de epidermis de rana: 1) Interacción con tripsina o con otras enzimas proteolíticas (Barisas y McGuire, 1974; Lozano et al. 1975). La activación con tripsina es más eficaz y la actividad conseguida viene considerándose como el 100 % Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 de la actividad de la en- Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -71zima. La activación por paso de las disoluciones de protirosinasa a través de columna con tripsina inmovilizada en Sepharosa (Iborra et al. 1976; Manjón, 1978) es la técnica utilizada sistemáticamente en este trabajo (Método: 12.1.2). 2) La activación por la acción de la luz que ha sido observada con protirosinasa (Mikkelsen y Triplett, 1975), se atribuye a una molécula cromófora constituyente de la protei'na que al ser extrai'da con acetona la desensitiza. Este fenómeno puede estar implicado en el mecanismo natural de activación de tirosinasa, para . desencadenar la pigmentación de la piel como respuesta al tratamiento solar. 3) El tratamiento térmico también provoca parcial activación (Lozano et al, 1975), asi' como el envejecimiento (Galindo, 1976). 4) La inmovilización a determinadas soportes sólidos por unión covalente provocó la activación de protirosinasa (Manjón, 1978; Iborra et al. 1979) como consecuencia de la modificación química producida en la molécula de proenzima. 5) Miller et al (1970) mencionan que por incubación con L-tirosina a 0°C también hay una activación de la protirosinasa de epidermis. Este constituye el único antecedente localizado de activación por el sustrato Los estudios realizados en nuestro laboratorio, sugieren que la activación transcurre a través de un cambio conformacional provocado por una excitación luminosa, térmica ó por una modificación química covalente. Ese cambio conformacional se ha comprobado que consiste en un desplegamiento de la estructura tridimensional; diversos tipos de resultados lo confirman: los cambios en el espectro de fluorescencia (Manjón, 1978, Iborra et al. 1978), el comportamiento frente a cromatografía hidrofóbica (Cortés, 1978), la mayor accesibilidad del centro activo a fotosensibilizadores inmovilizados específicos (Llorca, 1980) y así como de los puentes disulfuro a la acción del ditiotreitol (Iborra et al. 1978; Ferragut, 1980). Por otro lado, estudios de desnaturalización térmica, han demostrado que la forma activa desplegada es una forma más estable termodinámicamente ((Galindo, 1976; García Carmona, 1980). Por lo tanto el proceso de activación es un proceso espontáneo por transición a un estado más desordenado, y las distintas formas de desencadenar el proceso proenzima —ênzima, lo hacen proporcionando la energía de activación (caso de la luz, temperatura e Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -72inmovilización) o aportando un mecanismo catalítico de menor energía de activación (catálisis por tripsina, inducción por el sustrato). Una posible explicación para la más eficaz activación con tripsina sería que ésta rompe elgún enlace peptídico y de esa forma libera la conformación de la proenzima, permitiendo así la transconformación espontánea a la estructura de enzima activa, más desordenada y estable. Además no se han observado diferencias significativas en los valores de peso molecular de protirosinasa y tirosinasa que indicaran la liberación de algún péptido, y la expresión de la actividad viene acompañada por una dimerización de las cadenas polipeptídicas desplegadas (Ferragut, 1980). 5.1.1. EFECTO DE LA TRIPSINA SOBRE LA A C T I V I D A D TIROSINA H I DROXILASA DE PROTIROSINASA SOLUBLE. La protirosinasa no manifestó actividad dopa oxidasa, en las condiciones del ensayo estándar, en presencia de su sustrato L-dopa, si no se activaba previamente con tripsina ó alguno de los métodos de activación ya citados (Galindo, 1976). Sin ambargo con L-tirosina, en presencia de ascorbato, se detectó actividad tirosina hidroxilasa por formación de L-dopa, después de un periodo de inducción (Fig. 33). Para las condiciones de ensayo, este periodo de inducción fué de unos 5-10 minutos. La velocidad de formación de L-dopa con la SP fué máxima al cabo de unos 15 minutos de reacción y alcanzó el 50 % de la que manifestó la SE desde el primer momento. Cuando la proenzima se trató durante 5 minutos con tripsina, bajo las condiciones de ensayo expresadas en la Fig. 33 , no se observó la existencia de dicho periodo de inducción y además la actividad manifestada fué notablemente superior y más estable a lo largo del tiempo de reacción. Estos resultados están de acuerdo con lo establecido anteriormente de que la activación de la proenzima puede realizarse por un cambio conformacional, que puede conducir a diferente estado de agregación de la proteína, y que es inducible todo ello por el sustrato L-tirosina. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -73- Fig. 33. Efecto del tratamiento con tripsina de protirosinasa soluble. 2 0 0 ^ 1 de SP purifi- 400- cada, se trataron con 40/U de tripsina (lmg/ml) duran- A te 5 minutos a 25 °C y se midió la formación de L-do- < pa después de la adición de Q. 5 mi de disolución sustrato (L-tirosina 2,5 mM, ascorbato 5,0 mM, en fosfato 0,1 M pH 7,0) 10 20 TIEMPO (min) Esta inducción por el sustrato L-tirosina fué observada por Miller et al. (1970) en epidermis de Rana pipiens cuando incubó disolución de proenzima con L-tirosina 1 mM, durante 160 minutos a 0°C. Igualmente en la purificación por cromatografía de afinidad en tirosina-sepharosa de protirosinasa, al eluir con L-tirosina la proenzima adsorbida, se observó un ennegrecimiento del soporte; este hecho se puede interpretar en base a que la L-tirosina soluble activaba a protirosinasa adsorbida por su interacción con el centro activo, mientras que la L-tirosina inmovilizada no lo hacía (Cortés, 1978). Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -74- 5.1.2. ACTIVACIÓN DE PROTIROSINASA POR INMOVILIZACIÓN. EFECTO DE L A TRIPSINA SOBRE ENZACRYL-AA-IMP. La protirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA por el método del ácido nitroso manifestó actividad tirosina hidroxilasa después de un periodo de retardo sin necesidad de tratamiento con tripsina. Esto indicó que había una inducción de la actividad provocada por el sustrato al igual que sucedió con el SP, pero con la salvedad de que al cabo de 30 minutos de reacción se llegó a alcanzar el 100%de la actividad del IMP que había sido tratado con tripsina. Así pues la modificación química producida por la inmovilización condujo a que la protei'na adoptara una conformación más favorable a la inducción por el sustrato y por lo tanto más próxima a la forma activa. Es equivalente a afirmar que la inmovilización produjo una parcial activación de la proenzima. Esto es coherente con el hecho observado por Iborra et al. (1979), de que la L-dopa no induci'a actividad dopa oxidasa en las condicio--. nes normales de ensayo, sin embargo manifestó actividad después de inmovilizarla covalentemente. F¡g.34. Efecto del tratamiento con tripsina sobre el Enzacryl-AAIMP. 4 mg de gel-IMP liofilizado, se trataron con 0,5 mi de tripsina (1 mg/ml) du rante 15 minutos, y se midió la formación de L-dopa después de la adición de 5 mi de disolución sustrato (L-tirosina 2,5 mM, ascorbato 5 mM fosfato 0,1 M pH 7,0). T I E M P O (min) Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -75- Para explicar el mecanismo por el que la inmovilización provocó la activación parcial de la tirosinasa se debe tener en cuanta que: 1) La inmovilización de la protei'na sobre Enzacryl-AA se realiza fundamentalmente a través de los residuos tirosina de la proteína ( Goldstein et al., 1970; Melrose, 1971). 2) En el proceso de activación se exponen más residuos de tirosina al medio, como lo juatifican los espectros de fluorescencia de proenzima y enzima (Iborra et al. 1978). 3) Es frecuente que la inmovilización covalente provoque cambios conformacionales (Zaborsky, 1973), y en el método empleado para la inmovilización de tirosinasa sobre Enzacryl-AA, es probable que ese cambio se produzca en el sentido de un desplegamiento de la estructura que hiciera accesibles a los residuos de t i rosina para su unión al soporte. De hecho, se han observado desplazamientos en la longitud de onda de emisión de fluorescencia al inmovilizar proenzima en sepharosa 4B (Iborra et al. 1979) en el mismo sentido que el observado en el proceso de conversión de proenzima a enzima (Iborra et al. 1978). El desplegamiento producido, se estabilizaría por los enlaces covalentes formados con el soporte y por los que se formarían en la interacción de la enzima con el microambiente del soporte. Junto con los cambios conformacionales favorables a la activación que se produjeran por la unión al soporte, habrá de tenerse en cuanta que el azar estadístico pudo producir modificaciones desfavorables para la acti- vación en una fracción de moléculas de proteína; dada la rigidez provocada por los enlaces al soporte sólido, estas moléculas de conformación "equivocada" no responderán al tratamiento con tripsina, ni a la inducción por ei sustrato, por lo que quederían definitivamente inactivables para su función catalítica. Además la activación provocada por inmovilización y por inducción por el sustrato no deben tener las mismas características que que la activación con tripsina, pues como se verá después, cuando se activó SP en columna de tripsina-sepharosa y la SE recogida se inmovilizó sobre Enzacryl-AA, el I ME obtenido manifestó muy distinto comportamiento que cuando se inmovilizó como proenzima, y el Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -76- Enzacryl-AA-IMP obtenido se activó luego por tratamiento con tripsina soluble. 5.2. RENDIMIENTOS DE INMOVILIZACIÓN DE PROTIROSINASA EN ENZACRYL-AA. Para el estudio del rendimiento de inmovilización y eficacia de acoplamiento de protirosinasa en Enzacryl-AA, se siguió la misma sistemática que se aplicó con tirosinasa descrita en el cpi'tulo anterior, salvo que en este caso, para la determinación de actividad de la proenzima soluble (SP¡ y SPr) e inmovilizada (IMP), se trató previamente con tripsina soluble (Método: 12.1.3). Se observó que la fracción de actividad sustraída de la disolución de proenzima, fué mayor que la de protei'na unida al soporte, por lo que la relación Act. sust./rp^ fué en todos los estados de purificación utilizados superior a 1 (Tabla 9); esto, al igual que en la inmovilización de enzima, se interpretó en función de una posible unión selectiva o de una inactivación de la proenzima no unida al soporte. Además, la actividad sustraída de la disolución de proenzima (0,66 — 0,72) fué menor que lo obtenido con enzima (0,98), lo que podría relacionarse con la menor densidad de residuos de tirosina en la superficie de la molécula de proenzima que de enzima. La eficacia de acoplamiento de la protirosinasa fué muy inferior (0,30 — 0,36) a las obtenidas con enzima (0,88 — 0,75), lo que determinó unos bajos valores de rendimiento de inmovilización y del proceso global de purificación e inmovilización ( r ¡nm xr pur)- La razón r ¡ n m / r _ r o t fué inferior a 1 lo que indicó que la actividad específica de la proteína inmovilizada fuá inferior a la de la disolución de protirosinasa original, a diferencia de lo ocurrido con la inmovilización de la enzima Los menores valores de la eficacia de acoplamiento, determinados por la baja actividad manisfestada por el gel-IMP, pueden asignarse a la resistencia Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -77- Tabla 9 Comparación de los rendimientos de inmovilización de protirosinasa y tirosinasa en Enzacryl-AA. Forma de fracción r enzima Act. sust. r. 'inm prot Act. sust. r¡nm r prot r p u r x r inm rprot IMP de extracto P¡ 0,24 0,66 2,7 0,20 0,83 0,20 IMP de purificado CM/Phe 0,58 0,72 1,2 0,26 0,43 0,14 IME de extracto P¡ 0,45 0,98 2,2 0,86 1,90 0,86 IME de purificado CM/Phe 0,59 0,98 1,7 0,73 1,20 0,35 del IMP a adquirir la conformación yor rigidez más activa, como consecuencia de la ma- que le proporciona a la enzima la unión al soporte; asi' a pesar del tratamiento con tripsina empleado para la medida de actividad del IMP, la actividad manifestada por éste fué muy inferior a la obtenida cuando se activó antes la proenzima soluble y se inmovilizó después en forma de enzima activa. Otra confirmación de que el Enzacryl-IMP no ha alcanzado la conformación desplegada más activa, a pesar del tratamiento con tripsina, fué el comportamiento de la actividad del IMP con la temperatura de ensayo y su comparación con la del Enzacryl-AA-IME (Fig. 35). Con el Enzacryl-AA-IME, la temperatura de máxima actividad, en las condiciones del método estándar, fué de unos 25°C; por enzima de esta temperatura el IME manifestó menor actividad, indicando con ello una inactivación por la mayor agitación térmica. Sin embargo, a pesar de que la proenzima soluble es menos estable a la desnaturalización térmica (Galindo, 1976; Garci'a Carmona, 1980), la temperatura de máxima Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -78- actividad del IMP fué superior, próxima a 40 °C. Esto sugiere que la mayor agitación térmica favorece cambios hacia conformaciones más desordenadas y desplegadas que se aproximaron a la conformación más activa, mientras que el IME que se encuentra en una conformación óptima, el aumento de temperatura conduce a conformaciones menos activas. =5 60 O) E c 1 o E a < o £ > 40 - 20 ü < 20 40 TEMPERATURA Fig. 35. 60 ( °C ) Comparación del efecto de la temperatura sobre la actividad de Enzacryl-AA-IMP activado con tripsina ri y de Enzacryl-AA-IMP.Actividad medida por la L-dopa formada en 10 minutos de ensayo. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -79- 5.3.- COMPORTAMIENTO CINÉTICO DEL ENZACRYL-AA-IMP. Cuando se analizó el comportamiento cinético del derivado Enzacryl-AA-IMP activado con tripsina soluble, la si'ntesis de L-dopa ocurrió sin existencia de un periodo de retardo apreciable, y con un crecimiento lineal de la concentración de L-dopa con el tiempo, dentro de los primeros 20 minutos de reacción, para todas las concentraciones de L-tirosina utilizadas (Fig. 36). Cuando se realizó la representación de la velocidad de reacción frente a la concentración de sustrato (Fig. 37), al igual que lo obtenido con los Enzacryl-AA-IMe preparados con tirosinasa poco purificada (Cap. 4.3), que puede asociarse a un aumento del valor de KM,, valor no determinado por causa de la baja solubilidad de la L-tirosina y que se refleja en una menor afi- 0 5 TIEMPO Fig. 10 DE 15 REACCIÓN (min) 36. Formación de L-dopa catalizada por Enzacryl-AAIMP activado con t-ipsina para diferentes concentraciones de sustrato L-tirosina. 4 mg de Enzacryl-AAIMP activado 15 min. con 0,5 mi tripsina (1 mg/ml) 5 mi disolución sustrato conteniendo ascorbato 2,5 mM. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -80- o. |§ o> E c 1 "5 E z o ü ü < LU ce tu O O < Q ü O _l LU > 1,0 2,0 T I R O S I N A (mM) Fig. 37. Cinética de primer orden del Enzacryl-AA-IMP tratado con tripsina. Velocidad medida por la formación de L-dopa en las condiciones de ensayo expresadas en la Fig. 36. nidad de la proenzima activada por su sutrato L-tirosina. Todos los derivados Enzacryl-AA-IMP obtenidos a con proenzima a distintos estados de purificación manifestaron una cinética de primer orden. Las constantes cinéticas obtenidas fueron similares entre sí, salvo la correspondiente a la proenzima purificada por CM-sephadex, y que correspondió con el hecho de que la proenzima purificada por este método dio un mayor rendimiento de purificación. La mayor actividad manifestada en esta caso por el IMP no puede interpretarse sólo por el grado de pureza del proenzima, ya que con proenzima más purificada (CM/Phe), se obtuvo un valor de K" inferior. Por lo tanto, la diferencia pudo corresponder a que se eliminara un tipo de proteínas. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -81- Tabla 10 Constantes cinéticas de primer orden del Enzacryl-AA-IMP Proenzima purificada Un di'a de almacenamiento 30 dias de a Imacenamiento K K' K (min"') (min"'-lit - g" ') (min"1) por K' (min* 1 -lit-g" 1 ) extracto P¡ 9,1 11,4 8,5 10,6 extracto H 2 0 / P ¡ 9,2 11,5 7,3 9,1 purificado CM 17,4 21,8 12,2 15,3 purificada Phe 8,3 10,4 5,9 7,4 purificada CM/Phe 11,4 14,2 6,2 7,8 Cuando se midieron las mismas constantes de velocidad después de 30 di'as de almacenamiento (liofilizado, a — 30°C), se observó que habi'an disminui'do en todos los casos, manifestando una pérdida de actividad por el almacenamiento. Esta pérdida fué máxima para el caso con proenzima más purificado (CM/Phe) que perdió un 45 % de actividad. Sin embargo, en el caso de proenzima menos purificada (P¡), las pérdidas fueron sólo de un 7 % (Ta- bla 10). Como resumen de este capítulo, podemos afirmar que la inmovilización de protirosinasa en Enzacryl-AA conformacionales provocó en la protei'na cambios en el sentido de un acercamiento hacia la forma activa de la enzima, pero que los rendimientos de inmovilización fueron menores que cuando se inmovilizó tirosinasa previamente activada con tripsina-sepharosa. Por ésto, y por la pérdida de sus propiedades catalíticas con el almacenamiento, la inmovilización de protirosinasa ofrecía pocas ventajas para aplicaciones posteriores. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 6. ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME, ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -83- 6. ESTABILIDAD DE LOS DERIVADOS ENZACRYL-AA-IME, ENZACRYL-AA-IMP y CPG-AA-IME. En el presente capi'tulo se pretenden analizar aquellas propiedades de la tirosinasa inmovilizada en Enzacryl-AA y CPG-AA, relacionadas con su capacidad de utilización durante largo tiempo. Asi', la estabilidad al almacenamiento, estabilidad de la reacción catali'tica, en función del tipo de reactor, estado de purificación de la enzima inmovilizada, condiciones de pH, temperatura, fuerza iónica, etc.; al igual que otros factores que afecten especialmente al uso del IME en reactores de columna, como la P Q , , la velocidad de flujo volumétrico y la velocidad lineal, etc. 6.1. EL FENÓMENO DE LA INACTIVACIÓN DE LA TIROSINASA POR LA ACTUACIÓN. Es característico y conocido desde hace tiempo que las tirosinasas de diversas fuentes sufren el fenómeno de su rápida inactivación con la actuación con sus sustratos (Nelson y Dawson, 1944; Shimao, 1962; Horowitz et al., 1970) y por lo tanto es la principal dificultad para su aplicación con f i nes analíticos, terapéuticos o industriales (Wykes et al. 1971). Se ha observado que la melanización produce un efecto de inactivación de tirosinasa (Seiji y Fitzpatrick, 1960; Seiji y Fukuzawa, 1972) y que la tirosinasa se une a la melanina formada como producto de oxidación de L-dopa por la tirosinasa, con lo que la inactivación parece estar relacionada con la propia melanización (Seiji y Miyazaki, 1971). Shimao et al. (1974), estudiando el proceso de inactivación, dedujeron que la inactivación dependía de la concentración de enzima presente y que la unión de los productos a la enzima no parece jugar un papel importante en el mecanismo; y puesto que la unión conocida de las melaninas es posterior a ia reacción de inactivación de ésta, deducen que la inactivación que la inactivación se debía a un bloqueo de los centros activos de la enzima con los intermediarios quinoideos. De hecho Wood e Ingra- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -84- ham (1965) observaron la incorporación de radioactividad a la protei'na cuando emplearon 1- C-fenol como sustrato de tirosinasa de champiñón, habiendo sugerido la posibilidad de que la nueva quinona formada pueda, antes de dejar el centro activo, llevar una reacción de Mitchaell con un grupo amino libre de la enzima, como se da en la ciclación de la dopaquinona formada para dar dopacromo. Sin embargo Lerch (1978) no encontró incorporación de radioactividad empleando C-fenol con tirosinasa de Neurospora crasa, mientras que sí detec- tó, por análisis de aminoácidos, la pérdida de un residuo de histidina que podría explicar la inactivación de la enzima; además especula que algún intermediario generado en el ciclo catalítico pueda atacar al residuo de histidina. Los diversos mecanismos cinéticos sugeridos (Ingraham, 1954, 1955; Laidler y Burting, 1973; Shimao et al. 1974), suponen la formación de enzima inactiva a partir de un intermediario del proceso catalítico. Sin embargo, no llegan a conclusiones reales, en unos casos por haber aplicado en el trata miento la suposición de un estado estacionario que en realidad no existió por la inactivación de la enzima, o en otros por la dificultad de resolución de las ecuaciones diferenciales planteadas. En base al tratamiento matemático desarrollado por Varón (1979) de la teoría de los compartimentos, García Carmona (1980) ha deducido los parámetros cinéticos del proceso de inactivación de la actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa de epidermis de rana, según el esquema: E +- S ^ = i ES I E > EP + I P' > E + Q (16) i concluyendo que el fenómeno de inactivación se ajusta bien a una cinética de primer orden, lo que apoyaría una inactivación a través de un intermediario, dentro del concepto de enzima suicida (Abeles y Maycock, 1976), en que la inactivación depende del número de veces que la enzima actúa y es indepen - Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -85- diente de la concentración de sustrato. Los tiempos de semiinactivación (ty2)> obtenidos midiendo la actividad tirosina hidroxilasa por el método radiometrico de Pomerantz (1964), dio valores de 4 - 5 minutos (Garci'a Carmona, 1980), semejantes a los obtenidos por nosotros siguiendo la formación de dopacromo, y del mismo orden que los obtenidos para la actividad dopa oxidasa (Manjón, 1978). En presencia de ascorbato, y midiendo la concentración de L-dopa formada a partir del sustrato L-tirosina, durante estos tiempos de reacción e incluso superiores (unos 20 mir. ñutos, observamos que la reacción transcurría sin pérdida apreciable de la actividad (Cap. 2.3), lo que también ha sido observado por García Carmona (1980) midiendo por el método radiometrico, indicando que en presencia de ascorbato el mecanismo puede discurrir por otro camino. El papel del ascorbato debe estar relacionado con la eliminación rápida de algún intermediario que podría acelerar su transformación a la forma inactiva (E¡). Por ello no hay que descartar, como se ha comentado anteriormente, una interacción entre la enzima y ascorbato. Sin embargo, aún en presencia de ascorbato hay una inactivación con t-^n del o r - den de 30 a 90 minutos, que aumentaron al disminuir la concentración de enzima. Por otro lado, la inmovilización de tirosinasa de epidermis de rana en Enzacryl-AA aumentó la estabilidad a la reacción de la actividad dopa oxidasa con valores de t - j ^ de unos 150 minutos en reactores de columna (Iborra et a l . , 1978). Esto demostró que en el proceso de inactivación existe algún efecto conformacional que es parcialmente impedido por la mayor rigidez de la estructura de la enzima inmovilizada. Así pues las causas de la inactivación de la tirosinasa por su actuación no están totalmente aclaradas. En nuestro caso, las experiencias llevadas a cabo se realizaron para encontrar condiciones óptimas de máxima estabilidad a fin de abrir posibilidades de aplicación de la enzima tirosinasa y de encontrar nuevos puntos de vista respecto al problema de su inactivación. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -86- 6.2. ESTABILIDAD AL ALMACENAMIENTO. Para asegurar una aplicabilidad de una enzima inmovilizada es necesario que posea una suficiente estabilidad al almacenamiento (Smiley y Straridberg, 1972). La inmovilización de enzimas, por lo general, suele aumentar la estabilidad de éstas al almacenamiento, especialmente por acoplamiento covalente (Johnson, 1979; Klemes y Citri, 1979). Para estudiar la estabilidad al almacenamiento de los derivados Enzacryl-AA-IME, Enzacryl-AA-IMP y CPG-AA-IME, se almacenaron a — 30 °C muestras liof¡tizadas, protegidas de la luz y con ambiente seco proporcionado por gel de si'lice, y se midió la actividad tirosina hidroxilasa con el tiempo de almacenamiento a porciones diferentes de derivado. Se observó que el Enzacryl-AA-IME, durante 90 días de almacenamiento conservó prácticamente inalterada su actividad, sin embargo con IMP, en el mismo tiempo, perdió más del 50 % de actividad (Fig.38). La ma : yor estabilidad de la tirosinasa inmovilizada como enzima activa que como proenzima, puede guardar relación con las interpretaciones dadas anteriormente respecto a la estabilidad conformacional de las dos formas de tirosinasa. Igualmente el derivado CPG-AA-IME liofilizado mantuvo prácticamente inalterada su actividad durante 30 di'as; una muestra almacenada durante 120 di'as conservó el 80 % de la actividad. Asi' pues, los derivados de enzima inmovilizada mantuvieron suficiente estabilidad al almacenamiento como para que ésta no limitara su aplicabilidad, no siendo asi' el derivado de proenzima; ni los extractos solubles de proenzima que almacenados a 5 °C perdieron el 70 % y con enzima, de actividad, en 60 día?, en las mismas condiciones, perdió el 50 % en 55 días. En las demás experiencias de esta Memoria, dada la pérdida de actividad, los derivados inmovilizados de proenzima, se utilizaron sólo dentro de 15 di'as desde su preparación. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -87- 100 >, - • • T • Enzacryt-AA-IME \ o 8 RELATIVA ¿75 < c > Enzscryl-AA-IMP 30 TIEMPO Fig. 38. DE ' ' 60 90 A L M A C E N A M I E N T O ' « 120 160 (din) Estabilidad al almacenamiento de Enzacryl-AA-IME e IMP. Ensayos realizados con alícuotas tomadas de muestras liofüizadas y almacenadas en ambiente seco a — 30 °C. 6.3. ACTIVIDAD DE LOS REACTORES CON GEL-IME Y ESTABILIDAD DE LA REACCIÓN A LARGO TIEMPO. Cuando una enzima inmovilizada se emplea en un determinado reactor, para decidir si el sistema es utilizable para funcionamiento a largo tiempo es necesario conocer las siguientes variables: a) La actividad que el gel-IME manifiesta en las condiciones del reactor (Actp). Esta va a depender de la naturaleza del gel-IME, del tipo de reactor y de las condiciones de trabajo. Bajo las condiciones de un reactor determinado objeto de estudio, la actividad manifestada por el IME puede variar notablemente respecto a la manifestada con el método o reactor estándar (Act|^j^). Por ello se empleó el término actividad del reactor (Actp), entendida como la actividad manifestada por gramo de gel-IME, en las condiciones del reactor en estudio. Como Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -88- la actividad del reactor vana con el tiempo de uso, el valor de A c t p 0 se refiere en principio, al momento de máxima actividad, que para los reactores STR fué a tiempo inicial y para los reactores continuos (CSTR y PBCR), fué el valor máximo que se obteni'a una vez alcanzado el estado estacionario. El concepto de Capacidad de reacción del reactor (Cp), empleado para describir la capacidad catalítica total de éste (Vieth y Venkatasubramanian, 1976), vendría dado por: CR = m • Act R (17) b) La estabilidad de la reacción a tiempo largo. Para su determinación se empló como criterio el tiempo de semiinactivación (t-j/?)' definido como el tiempo transcurrido para disminuir la Actp hasta la mitad de su valor máximo. En las Figs. 39, 40 y 41 se indican ejemplos del comportamiento del Enzacryl-AA-IME a largo tiempo en reactores de baño agitado (STR), en reactores de baño agitado continuo (CSTR) y en columna empaquetada (PBCR), Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Fig. 39 Comportamiento del Enzacryl-AAIME a largo tiempo en reactor de baño agitado (STR). Se representa concentración de L-dopa acumulada en el reactor con el tiempo, para las condiciones de p (Unidades estándar de gel-IME por litro de disolución sustrato procesada) que se indican. Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -89- T I E M P O 40. ( hr ) Comportamiento del Enzacryl-AA-IME a lo largo del tiempo en reactor continuo de baño agitado (CSTR). m = 4 mg de gel-IME de Act||YjE = 45 mU/mg gel a las velocidades de flujo (Q) indicadas en cada caso. T I E M P O 41. Comportamiento del Enzacryl-AA-IME a largo tiempo enreactor de columna empaquetada (PBCR). m = 4 mg de gel-IME de A c t ^ Act|Mp.=-45 mU/mg gel, para las condiciones de velocidad de flujo indicadas. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -90- respectivamente. Para poder estudiar de forma comparable la actividad y estabilidad de los derivados inmovilizados en los distintos reactores, se ensayó la actividad en condiciones idénticas, no sólo de los factores ambientales (pH, T, PQ?> concentraciones, etc.), sino también respecto al valor del parámetro p del reactor, definido como la cantidad de enzima inovilizada, expresada en unidades estándar de actividad, utilizada por unidad de volumen total de sustrato procesado a lo largo da la vida de uso del reactor, y que se calculó por: m p=ME_ siendo = Act v IME (u/l) (18) V§ el volumen de sustrato procesado en el tiempo total de uso del reactor ( t j ) . Para un reactor dei tipo STR: V g = V p (volumen del reactor) (19) Para reactores continuos: Vs = Q t En reactores STR, t j T (20) se tomó como el tiempo necesario para consumir la actividad del gel-IME, y en reactores de flujo como el tiempo que tardó la Actp en reducirse al 10-20 7ode su valor inicial (valor residual límite). Como se observa en las citadas Figs. 43-45, el parámetro del reactor, p, condiciona la actividad del gel-IME en los distintos reactores, o bien directamente o a través del valor de la velocidad de flujo Q. En la Tabla 11 se compara la actividad manifestada (Actp) y la estabilidad a la reacción (t<|/«), de los reactores STR, CSTR y PBCR en igualdad de condiciones respecto a p. Con ello, las diferencias observadas para un mismo reactor, dependerán fundamentalmente del tipo de soporte y para un mismo soporte, del tipo de reactor. En STR la actividad manifestada por los derivados inmovilizados varió bajo las mismas proporciones que los valores de r ¡ n m ; este paralelismo respondió a que en el método estándar de medida de actividad del gel-IME (Método: 12.8.2), empleado para determinar r ¡ n m el ensayo se realiza en un reactor de baño agitado, aunque bajo otras condiciones. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -91- Tabla 11 Actividad (Actp ) y estabilidad (t-\/7) de los derivados IME en varios reactores. Proenzima o enzima inmovilizada a partir de un extracto l-Ô/Pj. Forma de ActRo r h/2 (¡i), (üi) inm <«> enzima (U/g gel) STR (h) (üi) CSTR PBCR (iv) STR CSTR PBCR (iv) SE — — — — 0,7 — — Enzacryl-AA-IMP 0,26 18 14 4 1,5 — 5,7 Enzacryl-AA-IME 0,72 45 40 10 4,2 6,5 12,0 CPG-AA-IME 0,41 25 22 18 6,0 — 16,0 (i) Actividades medidas en las condiciones de los métodos estándares (Métodos: 12.8.1. y 12.8.2.), habiéndose preparado el IME (P) son SE/m=50 U/g soporte (ii) Actividad máxima inicial manifestada por el reactor (üi) Valores obtenidos para condiciones de parámetro del reactor p= 2 U/1 (iv) Con disolución sustrato saturada con aire. En PBCR el Enzacryl-AA-IME y el Enzacryl-AA-IMP manifestaron mucha menos actividad que en STR, siendo la razón ActpgQp/ActgjR de 0,22 para Enzacryl-AA-IME y para Enzacryl-AA-IMP, mientras que con el soporte de vidrio poroso, el CPG-AA-IME, esa razón fué de 0,72, indicando que este caso la capacidad de reacción del derivado en el PBCR es más cercana al STR, que en el caso del Enzacryl-AA-IME La menor actividad manifestada en PBCR que en STR se interpretó en función de las limitaciones inherentes al reactor en estudio: a) Deficiencia de oxígeno, que sólo es aportado a la columna por el disuelto en la propia disolución sustrato que abastece al reactor; el consumo de oxigeno está potenciado por la presencia de ascorbato, como se indicó anteriormente. La influencia de esta limitación estuvo minimizada en los reactores de baño STR y Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -92- CSTR, pues la agitación restituía el oxi'geno consumido a partir del aire burbujeado en la disolución (Van suijdam et al. 1978). b) Limitaciones por difusión de los sustratos , determinadas por el grado de empaquetamiento de la columna y de la mínima agitación de la disolución, sólo debida a la velocidad de circulación del fluido. Esta limitación fué menor en CP CPG-AA-IME, gracias a la mayor porosidad del soporte; en este caso la limitación más significativa fué la del oxi'geno, con lo cual la actividad manifestada en PBCR, aún no llegando a la alcanzada en STR (72 % ) , se acercó más que en el caso del soporte de poliacrilamida. Como también se observa en la Tabla 11 , la estabilidad de la reacción y por lo tanto la vida de uso del reactor, también varió notablemente con la forma de tirosinasa, el tipo de soporte y el tipo de reactor. La estabilidad a la reacción en reactores STR, medida por los t-j/_, fué en todos los casos mayor para la tirosinasa inmovilizada que soluble (0,7 h), mayor cuando se inmovilizó como enzima activa que proenzima (4,2 y 1,5 en Enzacryl-AA), y algo mayor con CPG-AA como soporte que con Enzacryl-AA (6 y 4,2 h). La estabilidad a la reacción de los derivados I ME mejoró en reactores CSTR y fué máxima en ensayos utilizando el reactor PBCR, alcanzando valores de hasta 19 horas y conservando en algunos casos el 30 % d e actividad después de 30 horas de funcionamiento continuo de reactor de columna. La mayor estabilidad de los derivados inmovilizados en PBCR respecto a STR y CSTR, se interpretó en función de los siguientes factores: a) Menores efectos de inhibición por la acumulación del producto L-dopa, cuya concentración forma un gradiente a lo largo del reactor y es asi' elui'do de este, mientras que en los reactores de baño, especialmente en CSTR , su acumulación provocó una disminución de la actividad manifestada por el reactor. En la Fig. 42 puede apreciarse el efecto inhibidor de la Actp ciales de concentraciones ini- de L-dopa añadidas al reactor, con la correspondiente pérdida de la productividad del mismo. En un reactor de baño discontinuo, el producto L-dopa permanece en el reactor, aumentando su concentración con el tiempo y por lo Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -93- 0) 40 III a o •o ~S o E E O) 30 < > - O < 20 I 10 4 Z O = o ü O o ce I 0 0 0,2 0,4 L-DOPA INICIAL (mM) Fig. 42. Efecto de la concentración de L-dopa añadida sobre la actividad inicial y sobre la producción en STR. t T = 12 horas; p = 1,7 U/1 tanto su efecto inhibidor es creciente a lo largo del tiempo de uso del reactor y será más notorio cuanto mayor sea la actividad enzimática que se aplique al reactor; esto sen'a una razonable explicación de la rápida pérdida de actividad en STR por el uso dando menores t-j/2 °. u e los demás tipos de reactores. En el reactor de baño continuo CSTR, el producto es eliminado continuamente, por lo que no se produciría alta acumulación de L-dopa y asi' la velocidad de inacti tivación fué menor que en STR, pero por otro lado, dada la agitación del CSTR, en todo el espacio del reactor actuaba el efecto inhibidor de una concentración de L-dopa igual a la de salida limitando la Actp desde los momentos iniciales. En PBCR se establece un gradiente de concentración de L-dopa, de forma que sólo en las últimas capas del lecho de gel-IME sufrían los efectos de una concentración igual a la de salida. Asi' pues, los valores de t - j ^ observados experimentalmente, no corresponden exactamente a la inactivación de la enzima, sino Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -94- que interviene además la inhibición competitiva provocada por la acumulación de producto, deteniendo la reacción enzimática, especialmente en los reactores de baño. b) Ausencia de turbulencia que puede provocar efector de desnaturalización en los reactores de baño agitado y que es mi'nima en PBCR. c) La menor actividad manifestada en PBCR, determina que también son probablemente menores los fenómenos de inactivación por reacciones secundarias propias de la actuación de la enzima. Esta afirmación adquiere coherencia si se ad- mite que el mecanismo de inactivación de la enzima parte de un intermediario del ciclo catali'tico, con lo que la velocidad de inactivación dependen'a del número de veces que la enzima es utilizada, por unidad de tiempo, para el proceso catalítico, y de la probabilidad de que el mecanismo se desvi'e hacia la reac- ción de inactivación. De hecho, es significativo que los valores de t - ] ^ son menores en los reactores en que la enzima manifiesta más su actividad. Así en los reactores de baño, dado que el IME manifiesta mayor actividad que en los reactores de columna, conllevarán en general una mayor producción de L-dopa a lo largo de su vida de uso, a pesar de sus bajos valores de t^/2 • 6.4. INFLUENCIA DE VARIOS FACTORES SOBRE LA ESTABILIDAD Y ACTIVIDAD DEL IME. 6.4.1. EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA Y DEL pH La influencia del pH y de la fuerza iónica del medio sobre la vida de uso del IME y su productividad, se estudió determinando t-j/2 y ' a producción de L-dopa en un reactor de columna empaquetada. Las variaciones de la fuerza iónica se suministraron con concentraciones de tampón fosfato comprendida entre 0,02 y 0,50 M (Tabla 12). En este intervalo no se observó una variación definida de los valores de t-j/2 con la fuerza iónica, sin embargo la productividad disminuyó ligeramente con el Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -95- Tabla 12 Efecto de la fuerza iónica sobre la estabilidad a la reacción y productividad Reactor PBCR, 2 mg de gel-IME, Q = 7,5 m i / h . Fosfato (M) Producción de L-dopa *1/2 . en 12 h. (h) 0,02 10,0 7,0 0,05 8,5 7,0 0,10 9,5 6,5 0,15 9,5 6,5 0,20 9,0 5,7 0,50 8,8 5,5 (yii moles) Tabla 13 Efecto del pH sobre la estabilidad a la reacción y productividad de Enzacryl-AA-IME Reactor PBCR, 2 mg gel-IME, Q = 7,5 ml/h. pH t'i/ *1/20 ( h ) Producción de L-dopa en 12 h. 6,0 8,0 5,1 6,5 9,5 7,9 7,0 11,5 8,0 7,5 12,5 7,5 8,0 9,5 6,1 Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 (/timóles) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -96- aumento de la concentración de fosfato, en consonancia con lo observado anteriormente en el efecto de la fuerza iónica sobre la actividad del IME (Cap. 4.3). Las variaciones del pH comprendidas entre 6,0 y 8,0 suministradas con tampón fosfato 0,1 M, tampoco produjeron drásticas variaciones en los valores de t ^ / ^ , que fueron máximos para pH 7 — 7,5. La productividad también fué máxima a estos valores de pH, disminuyendo notablemente para pH inferior a 6,5 y superior a 7,5, como consecuencia de la pérdida de actividad en estas condiciones de pH (Cap. 4.3), tal como puede apreciarse en la Tabla 13. Asi' pues de estos factores, especialmente el pH es el que puede afectar en mayor grado a la actividad y por lo tanto a la productividad del IME, mientras que la vida de uso del IME se altera sólo ligeramente dentro de los márgenes de fuerza iónica y pH ensayados. 6.4.2. EFECTO DE L A TEMPERATURA La actividad manifestada por el IME frente a temperatura, me medida por el método estándar alcanzó un máximo a 25 °C (Cap. 5.2). Dicho método estándar está referido en términos de velocidad inicial, en el que se emplean tiempos cortos de reacción y con reactor en condiciones de alto valor del parámetro p. .Para tiempos largos de reacción y con reactores de valores bajos de p (volumen grande de disolución sustrato procesada), el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad del Enzacryl-AA puede apreciarse en las experiencias representadas en la Fig. 43, para reactores STR y PBCR. Se observó que en STR un aumento de la temperatura por enzima de 20 °C fué en detrimento de la producción total. Asi' por ejemplo a 37 °C, temperatura que dio aproximadamente la misma actividad estándar que a 20 °C condujo en STR a un comportamiento diferente; durante las primeras horas de funcionamiento mostró algo más de actividad a 37 °C, pero a las 2 h perdi'a rápidamente actividad y a las 3 h la producción de L-dopa estaba detenida, mientras que a 20 °C necesitó unas 7 h para la pérdida total de actividad, Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -97- 0 4 8 12 T I E M P O Fig. 43. 16 ( h ) Efecto de la temperatura sobre el comportamiento a largo tiempo de Enzacryl-AA-IME en STR y PBCR. m = 4mggel-IME; V s = 50 míen STR; Q = 5 ml/h en PBCR. consiguiendo aproximadamente el doble de producción que a 37 °C. La mayor actividad a 37 °C durante las 2 primeras horas, puede interpretarse por las mi mismas razones que determinan la Ley de Arrenhius (mayores energías de colisión y más rápida disusión de sustratos y productos}, y la rápida inactivación posterior por desnaturalización térmica. Sin embargo, en PBCR a lo largo de 15 horas de funcionamiento, a 20 °C manifestó aproximadamente un 30 ^ menos de actividad que a 37 °C, lo que debe estar realcionado con los fenómenos de difusión, dado que es uno de los factores limitantes del Enzacryl-AA-IME en PBCR. Por enzima de 45 °C no mostró prácticamente actividad, tanto en STR como en PBCR. después de 30 minutos de funcionamiento. El comportamiento con la temperatura de la tirosinasa inmo- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -98- vilizada indicó que una temperatura comprendida entre 18 y 25 peratura idónea para su utilización en STR y de 20 a 37 °C 25 °C la temperatura 6.4.3. C es una temen PBCR, siendo que normalmente se empleó para ambos tipos de reactores EFECTO DEL ASCORBATO E HIDRACINA El uso de hidracina como reductor para prevenir la oxidación de L-dopa, provocó un ligero aumento de la producción de L-dopa, conrespecto al uso de ascorbato, tanto en reactor de baño como de columna (Fig. 44). No obstante a lo largo del presente trabajo se ha seguido utilizando el ascorr bato como agente reductor. Por otro lado, concentraciones de ascorbato entre 1 y 10 mM no mostraron diferencias significativas sobre la actividad inicial ni 12 LU 8 "33 D> o> o E E 4 < a. O O • 0 4 8 T I E M P O Fig. 44. 12 16 (h) Comportamiento a largo tiempo del Enzacryl-AA-IME en presencia de ascorbato y de hidracina como reductor. m = 4 mg gel-IME; V s = 50 mi en STR; Q = 5,2 ml/h en PBCR. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -99- 15 0 O " o o • .C _ 10 í • 2 CM ,3" II 5 - « i_ 1 4 6 A S C O R B A T O Fig. 45. » 8 » 10 ( mM ) Efecto de la concentración de ascorbato sobre la actividad y estabilidad del Enzacryl-AA-IME. Reactor PBCR; m = 2 mg gel-IME; Q = 5,0 ml/h sobre la estabilidad de la reacción. Asi' por ejemplo , en PBCR el Enzacryl-AA-IME mostró valores de t - j / 2 muy semejantes (Fig. 45), por lo que no se apreciaron diferencias notables en la productividad del reactor. Asi' pues la concentración de ascorbato no resultó un factor determinante de la productividad de los reactores, siendo sólo necesaria la precaución de que la concentración del ascorbato sea lo suficiente alta para que en el tiempo de residencia de la disolución sustrato en el reactor, el ascorbato no sea consumido totalmente, pues en ese momento empezaría a darse la oxidación de L-dopa a dopacromo (Cap. 4.5). Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -1006.5. FACTORES QUE AFECTAN ESPECIALMENTE A REACTORES DE COLUMNA 6.5.1. EMPAQUETADA. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE OXIGENO. La velocidad de consumo de oxigeno que se da en las reacciones catalizadas por la tirosinasa en presencia de ascorbato (Cap. 4.5), sugirió que una de las razones de la menor productividad del PBCR respecto al STR, podn'a ser una deficiencia del oxígeno necesario para la reacción. En STR éste problema no existió dado que el oxígeno consumido por la reacción era repuesto por nuevo oxígeno atmosférico burbujeado y que se disolvió gracias a la a- gitación. En PBCR el único oxígeno disponible fué el aportado por la disolución que abastece al reactor. Que la concentración de oxígeno era un factor limitante de la productividad del PBCR se demostró al sustituir una disolución sustrato saturada por burbujeo con aire atmosférico ( P Q 9 0-21 atm) por una disolución saturada con oxígeno (Fig. 46) La concentración de L-dopa en el eluído, y por tanto la productividad del PBCR, aumentó notablemente al introducir la disolución saturada de oxígeno, y disminuyó de nuevo al utilizar la disolución original saturada de aire. Se comparó la productividad de dos reactores PBCR, uno alimentado con disolución saturada con oxígeno y otro con aire (Fig. 47). Cuando el flujo fué suficientemente alto y por lo tanto el tiempo de residencia pequeño ( tpiu 0,48 min.mg gel), hubo poca diferencia en la productividad de ambos reactores, lo que indicó que en estas condiciones, la disolución saturada de aire suministró casi todo el oxígeno que requería el reactor. Sin embargo a flujos lentos, en el tiempo de residencia del sustrato en el reactor, el oxígeno de la disolución saturada con aire no fué suficiente para abastecer el necesario en la reacción; con ello la deficiencia de oxígeno limitó notablemente la actividad manifestada por el I ME en el reactor. Así en el ejemplo de la Fig. 47 a Q 4 ml/h con un tp|y| de 1,8 min-mg gel, la actividad inicial del reactor con disolución saturada de oxígeno fué 2,6 veces que con saturación por aire. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -101- Fig. 46. Efecto de la concentración de oxígeno en la actividad de un reactor de columna. m = 4 mg gel-IME; Q = 7 ml/h. Las flechas indican el momento en que se inicia el suministro de disolución sustrato saturada de oi'geno ó aire. Fig. 47. Influencia del oxígeno en un reactor PBCR, en relación con la velocidad de flujo (Q). m = 4 mg Enzacryl-AA-IME Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 10 15 T I E M P O (h) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -102- 6.5.2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO (L-TIROSINA). Ya se ha indicado (Cap. 5.1.) que la interacción de la L-tirosina con la protirosinasa provocaba tanto de la forma soluble como del derivado IMP. Si el derivado favoreció el paso a la conformación activa, también podría ser que las variaciones en la concentración del sustrato modificaran la estabilidad del IME en el mismo sentido. Para ello se realizaron determinaciones de *1/? y c e ' ^ctR en P^CR, para concentraciones de L-tirosina comprendidas entre 0,25 y 2,5 mM. La estabilidad a la reacción, medida por los tiempos de semiinactivación, disminuyó con la concentración de L-tirosina, en contraposición al hecho de que el sustrato pudiera estabilizar la conformación de la proteína en su forma activa (Fig. 48). La actividad máxima inicial, sí aimentó con la con- ce z I I [•2 e 8c - o a. < -1 I 0,5 1,0 1,5 L - T I R O S I N A Fig. 48. i 2,0 LO - _ (mM) Efecto de la concentración de sustrato L-tirosina sobre la actividad, estabilidad y producción de L-dopa en PBCR. m = 4 mg gel-IME; Q = 5 m l / h . Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -103- centración de sustrato y como consecuencia la producción de L-dopa. La actividad del IME medida por el método estándar, en STR, dio una respuesta casi lineal con la concentración de sustrato y con el empleo de enzima purificada dio K ^ de 2,7 mM. Sin embargo en estos ensayos en PBCR la actividad aumentó con la concentración de sustrato con tendencia a la saturación al aumentar la concentración del sustrato. Una representación de Lineweaver-Burk dio un valor de K ^ de éstos valores de 0,47 mM, , lo que da un valor de 5,7 para la rela- ción K|y|(PBCR)/K|y|(STR), que al estar muy alejado del valor 1,0, normalmente se considera indicativo de existencia de limitaciones difusionales en el reactor PBCR (Ngo et al. 1979). Pero en nuestro caso la saturación de la actividad con la concentración del sustrato observada, también puede interpretarse teniendo en cuanta que al aumentar la actividad con la concentración de sustrato, aumentó no solo la velocidad de síntesis de L-dopa, sino también la velocidad de consumo de oxi'geno; asi' se llega a situación de deficiencia de oxi'geno que limita la actividad manifestada por el IME en PBCR, aparte de los efectos de limitaciones por difusión. Desde esta punto de vista pierde sentido real los valores de K ^ calculados para este sistema. A pesar de que los valores de t*/_ disminuyeron con la con- centración de sustrato, dado que aumentó la actividad manifestada por el IME, la producción de L-dopa a lo largo de 18 foras de uso continuo del reactor aumentó con la concentración de sustrato; este aumento fué pequeño por enzima de S 1 mM. Este comportamiento sugirió que la disminución de estabilidad a la reacción y por lo tanto los valores de t - j / ^ , no fué consecuencia de un efecto inestabilizador del sustrato; más bien parece haber una realación entre la actividad manifestada por el IME y la inactivación por el uso, de forma que a una velocidad alta de la reacción catalizada por el IME, le correspondió una mayor velocidad de inactivación. Esto equivale a afirmar que la inactivación no dependió sólo del tiempo de uso del IME, sino también del número de veces que cada centro activo ha sido utilizado. Esto sería coherente con el mecanismo de inactivación en el cual un intermediario del proceso catalítico iniciase una reacción secundaria de inactivación, tal como se ha descrito anteriormente (Sec. 6.1), y que tiene una determinada probabilidad de ocurrir cada vez que una molécula Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -104- de sustrato es transformada en producto. 6.5.3. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE FLUJO VOLUMÉTRICO (Q) Y DE LA VELOCIDAD L I N E A L (u). La velocidad de flujo volumétrico puede afectar al comportamiento del IME en PBCR en base a que éste determina dos variables: 1) La velocidad de suministro de sustratos, especialmente el oxígeno, lo que puede limitar la Actp si Q no es lo suficiente elevado para para suministrar la de- manda de oxígeno de la reacción. El efecto de la concentración de oxígeno ya ha sido analizada anteriormente en relación con Q (Secc. 6.5.1.). 2) La velocidad lineal (u , cm/h) de avance del fluido (calculada por u=Q/A,siendo A la superficie transversal de la columna) puede afectar a los fenómenos de difusión interna y externa. Para analizar la importancia de este factor, se determinó la actividad, estabilidad y producción de L-dopa, en reactores PBCR, bajo condiciones en las que la velocidad lineal fuera la única variable del sistema. Para ello, se tomaron varios reactores de columna que poseían distintas dimensiones de altura y diámetro (Fig.49-A), en los que se empaquetó la misma cantidad de gel-IME (4 mg) y por lo tanto el mismo volumen de lecho (30 mm ), y fueron alimentados con disolución sustrato a la misma velocidad de flujo volumétrico (Q = 6 ml/h), de forma que los reactores estuvieran en las mismas condiciones respecto a los distintos parámetros determinantes del reactor ( V p , Q, tpjyj, p, q, etc.), pero a una velocidad lineal diferente en cada reactor.. Este tipo de experiencias han sido sugeridas (Pitcher, 1975), como método sencillo y práctico de demostrar la existencia de problemas difusionales; de forma que si la actividad del IME aumenta con u corresponde a la existencia de limitaciones por difusión. La actividad máxima inicial manifestada por el reactor y la producción de L-dopa aumentó con la velocidad lineal (Fig.49-B), lo que demostró que en PBCR la difusión de los sustratos fué uno de los factores que limi- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -105- 0= 2 mm 3 mm 6 mm 10 mm Fig.49-A.. Dimensiones relativas de reactores en columna con lecho empaquetado, Formas cih'ndricas. Se representa una sección longitudinal. IZZZ3 lecho de gel-IME O) ! H1 ? i 3 ~4 5 6 7 8 910 M VELOCIDAD LINEAL (cm/h) Fig. 49-B. Efecto de la velocidad lineal en PBCR . m = 4 mg Enzacryl-AA-IME; Q = 6 ml/h Ensayos en reactores con dimensiones variables (Fig. 49). Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -106- taron la acitividad del IME. Asi' pues, respecto a la productividad del reactor, resultó más ventajoso utilizar un reactor PBCR con una altura mucho mayor que el diámetro, aunque dichas columnas tienen el inconveniente de que requieren altas presiones para mantener el flujo del fluido de alimentación. En general, el aumento de Q proporcionó condiciones que fafavorecieron a una mayor capacidad de reacción del reactor y por lo tanto una mayor cantidad de producto formado en un determinado tiempo, sin embargo el volumen de sustrato procesado fué mucho mayor y el producto formado quedó con menor concentración de L-dopa. En la Tabla 14 se dan los resultados experimentales obtenidos en el efecto de Q sobre el comportamiento del IME en PBCR. Se observó que efectivamente, la actividad inicial del reactor (Actpl aumentó con Q, pero por otro lado, disminuyó la estabilidad a la reacción, lo que pudo apreciarse por los valores de t-|/_ que disminuyeron de 13,5 a 5 horas al aumentar Q de 2,9 a 70 ml/h; sin embargo el aumento de la Actp fué suficiente para compensar sobradamente la pérdida de actividad ocasionada, con lo que la producción finalmente obtenida en 15 horas de funcionamiento continuo (Pr-j-) fué 4 veces superior con Q 70 ml/h que a 2,9 ml/h, pero con el inconveniento de que a valores altos de Q el producto obtenido se recogió en un volumen mayor y por lo tanto con bajo factor de conversión medio (X= L-dopa formada/L-tirosina inicial), según puede apreciarse en la misma Tabla 14. Que los valores de t-|/£ disminuyeran al aumentar Q podría atribuirse a: a) Mayores efectos mecánicos sobre la enzima, dado que al aumentar Q , aumenta la velocidad lineal del fluido con la mayor probabilidad de inactivación por turbulancia, arrastre de subunidades, eliminación de cobre, etc. b) Más inactivación por un mayor uso, dado que al aumentar Q aumenta la Actp , favoreciendo la posibilidad de las reacciones secundarias que parten del intermediarios del ciclo catalítico, según el mecanismo de inactivación que se ha descrito anteriormente. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -107- Tabla 14 Efecto de la velocidad de flujo (Q), sobre el comportamiento del IME en PBCR m = 4 mg Enzacryl-AA-IME de 45 U/mg. Columna de 3 mm de diámetro. Acto «o (mU/mg gel) Q (ml/h) l 1/2 (h) Pr T en 15 h. (mg dopa/mg gel) X ' '° ' 2,9 7,2 13,5 0,68 6,2 5,0 9,2 10,0 0,98 5,2 13,2 17,6 8,5 1,6 3,2 70,0 46,7 5,0 2,6 1,0 6.6. COMPARACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON OTROS INTENTOS DE ESTABILIZACIÓN DE TIROSINASA POR INMOVILIZACIÓN. Al comparar lor resultados obtenidos con otros intentos anteriores de estabilizar la actividad de tirosinasas, cabe destacar que se ha conseguido mayor estabilidad de la enzima al almacenamiento y a su utilización conti- nuada, acompañado de mayores rendimientos de inmovilización. Asi' Wykes et al. (1971) inmovilizó tirosinasa de champiñón sobre DEAE-celulosa activada con 2,4-dicloro-6-amino-S-triazina, a fin de estabilizar la actividad tirosina hidroxilasa, que midió por la formación de L-dopa en presencia de ascorbato. El derivado inmovilizado que obtuvo perdió el 20 % de actividad después de un di'a de almacenamiento a 15 °C. En cuanto a la estabilidad a la actuación sólo menciona que en 24 horas en un reactor de flujo, habi'a perdido el 75 % de la actividad trabajando a baja temperatura (15 °C) y Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -108- con sustrato L-tirosina a concentración por debajo de la saturación (1,6 mM), condiciones en las cuales la estabilidad lograda se hizo a consta de infrautilizar la actividad de la enzima; además no menciona los rendimientos de inmovilización alcanzados. Por otro lado, el trabajo de estos autores representa la primera sugerencia de la aplicación de la tirosinasa inmovilizada a la si'ntesis de L-dopa. El otro intento significativo es el de Letts y Chase (1974) que inmovilizaron tirosinasa de champiñón por atrapamiento en membranas. De los resultados que publicaron puede deducirse que la oclusión de la enzima en las membranas de colágeno, se consiguó con una eficacia de coplamiento del 12,4 % lo que condujo rendimientos de inmovilización muy bajos, de 0,7 a 3,1 % según se ensayase en reactor de flujo aumentó respecto a la enzima ó de baño. La estabilidad lograda soluble, Dero sólo hasta valores de t-¡/2 de unas 2-3 horas; la modificación por entrecruzamiento con adipimidato aumento los tiempos de semiinactivación a 3-4 horas, y con gíutaraldehido a unas 8-10 horas, pero en este caso con una pérdida de actividad por la modificación del 70 % . Asi' la estabilización lograda de la tirosinasa no logró compensar los bajos rendimientos de inmovilización, de cara -a su utilización para la producción de L-dopa. Schiller et al. (1976) y Schiller y Liu (1978), al inmovilizar tirosinasa de champiñón por atrapamiento en gel de poliacrilamida para usos analíticos, obtuvieron un derivado IME que perdi'a el 53 % de la actividad en 19 días de almacenamiento, y del que no especifican eficacia de acoplamiento ni el rendimiento de inmovilización alcanzado. No estudiaron la estabilidad al uso continuo, pero perdió el 40 % de la actividad después de utilizarse en 4 ensayos repetidos discontinuos de 15 minutos cada uno. Madhosing y Sundberd (1974) mencionan la inmovilización de tirosinasa sobre agarosa activada con BrCN, para su utilización como soporte de cromatografía de afinidad para detectar proteínas inhibidoras de tirosinasa en champiñón, pero no mencionan la actividad ni la estabilidad del derivado de t i rosina-agarosa obtenido. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -109- En nuestro caso, habiendo obtenido con tirosinasa de epidermis de rana, derivados inmovilizados con altos rendimientos de inmovilización, de hasta 90 % , que implica un alto aprovechamiento de la actividad del IME respecto a la del SE en reactores de baño, y una estabilidad que proporciona valores de t-|/_ próximos a 20 horas en reactores de flujo, podemos considerar que se ha dado un paso adelante en las posibilidades de aplicación de tirosinasa inmovilizada a procesos industriales y a usos anah'ticos. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN GELES DE NYLON MODIFICADO. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -110- 7. INMOVILIZACIÓN Y PROPIEDADES DE TIROSINASA EN GELES DE NYLON MODIFICADO. Tirosinasa purificada y activada con tripsina-sepharosa, se inmovilizó sobre geles de nylon modificado aplicando los métodos descritos anteriormente (Cap. 3). De la comparación de los rendimientos de inmovilización obtenidos y del comportamiento de los derivados IME en reactores de baño y de columna, se seleccionaron aquellos que condujeron a mejores resultados; de éstos, se estudiaron algunas propiedades caracten'sticas, como perfil pH-actividad, cinética, estabilidad al almacenamiento, efecto de la cantidad de protei'na, etc.. Todo ello con vistas a las aplicaciones que se describen en los Capi'tulos 8 a 10. 7.1. RENDIMIENTOS DE INMOVILIZACIÓN. Para estudiar los rendimientos de inmovilización, se trató cada derivado modificado de nylon con una determinada cantidad de disolución de enzima, y se analizó el comportamiento frente a la inmovilización con la misma sistemática utilizada para el estudio del Enzacryl-AA-IME. Se observó que, en general, el rendimiento de protema unida al gel fué menor que el de actividad manifestada por el gel-IME (Tabla 15). Este hecho determinó que la actividad específica del IME respecto a protema aumentara respecto a la de la enzima soluble en un factor que vino dado por el valor de la relación ' , ¡ n m / r D r o t * ' ° c ue ' ûe es P e c ¡ a 'mente notorio en el derivado NB-glut-IME que manifestó el 110 °/o de la actividad de la enzima soluble, mientras que sólo se unió el 35 % de la protema nativa. Esto significó que la unión de la enzima al soporte produjo una activación de ésta, de forma semejante a lo observado anteriormente con Enzacryl-AA. El derivado NPAA-IME se obtuvo por las mismas reacciones de acoplamiento que para el Enzacryl-AA-IME y proporciona igualmente un mi- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -111- Tabla 15 Rendimientos de inmovilización en geles de nylon-6 modificado. Disolución de enzima utilizada: 0,181 U/ml; act. esp. 4,89 U/mg de protei'na. Cantidad de enzima tratada: SEj/m = 10 U/g de gel derivado Act|ME gel-IME (U/g) r Efic. prot acopl. r inm r inm/rprot NH-IME 6,6 0,33 0,85 0,66 2,00 NAQA-IME 7,6 0,54 1,60 0,76 1,41 NPI-acético-IME 3,7 -(*) 0,43 0,37 — NPI-IME 3,3 -(*) 0,44 0,33 — NPAA-IME 9,3 0,76 0,99 0,93 1,22 11,0 0,35 1,42 1,10 3,14 5,0 0,43 1,56 0,50 1,16 NB-glut-IME NB-nitroso-IME (*) Los reactivos de acoplamiento interfieren la medida de protei'na en la disolución residual. croambiente eléctricamente neutro; de hecho, al igual que en Enzacryl-AA se obtuvieron altos valores de r ¡ n m y la sobreactivación producida por la inmovilización pudo interpretarse también por un desplegamiento de la estructura favorecido por la unión de residuos de tirosina al soporte. En el caso de NB-glut-IME, el soporte también aporta un microambiente neutro, a diferencia de los otros derivados activados glutaraldehido que proporcionan carga negativa (NH-IME) ó positiva (NAQA-IME). Además el NB-glut-IME posee en su estructura grupos hidrófobos aromáticos aportados por la bencidina; estos hechos pueden interpretar los altos valores de r ¡ n m obtenidos. En este caso, la sobreactivación no puede interpretarse, como se ha realizado con el Enzacryl-AA y con el NPAA, por un desplegamiento consecuente de la unión al soporte de residuos que estuvieran ocluidos en la estructura de la enzima. Esto es asi porque la unión se realizó fundamentalmente a través de residuos de Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -112- I Fig. 50 . I Esquema por el que la inmovilización a soporte activado con glutaraldehido puede provocar un mayor desplegamiento de la conformación de la enzima en su unión a residuos de Usina. ——{glutaraldehido; — o residuos de Usina; E enzima; CA centro activo N matriz del soporte derivado de nylon. lisina, que están localizados en la superficie de la proteína. Sin embargo, dado que el nylon es un soporte poco poroso, la unión de la enzima fué superficial y se puede esperar una modificación de la conformación de la proteína de la forma expresada en la Fig. 50. Los bajos rendimientos obtenidos con los derivados de NPI, pueden ser debidos a que los reactivos de acoplamiento estuvieron en contacto con la disolución de enzima, provocando un bloqueo de los residuos de aminoácidos de la enzima. En los demás casos, la activación del soporte se realizó previamente a la interacción del soporte con la disolución de enzima. Para la preparación de NH-IME, NB-glut-IME y NAQA-IME, la activación del soporte fué por tratamiento con glutaraldehido como reactivo bifuncional, obteniéndose derivados IME activos con elevados rendimientos; sin embargo cuando se ha empleado el glutaraldehido como reactivo para entrecruzamiento de la enzima con albúmina (Manjón, 1979), la enzima se inactivo ca- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -113- s¡ por completo. En el mismo sentido se comportó cuando Letts y Chase (1974, entrecruzaron con glutaraldehido tirosinasa de champiñón que había sido ocluida en membranas de colágeno; el tratamiento redujo la actividad a una tercera parte. Los menores r ¡ n m obtenidos en la unión de la enzima sobre NB activado con nitroso que en la obtención de NB-glut-IME y que NPAA-IME, puede atribuirse a la carga neta positiva que proporcionó el soporte al microambiente de la enzima. 7.2. COMPORTAMIENTO DE LOS GELES-NYLON-IME A TIEMPOS LARGOS DE REACCIÓN. Se estudió el comportamiento de los geles-IME tanto en STR como en PBCR, para seleccionar el sistema de inmovilización que era más idóneo para su utilización a tiempos largos. Cuando en reactores STR se ensayaron para producción de L-dopa con las mismas cantidades de gel-IME por unidad de volumen de sustrato (q — 1 mg/ml), se observó (Fig. 51) que a lo largo del tiempo, la reacción se detuvo llegando a unas concentraciones finales de L-dopa que fueron máximas en los casos de NPAA-IME, NB-glut-IME y mínimas para NB-nitroso-IME y para los derivados de NPI. Esto era esperable en función de los rendimientos de inmovilización y actividad mostrada por cada uno de los derivados. Al determinar la productividad en STR de los geles-IME al cabo de 6 horas de utilización con las mismas unidades de actividad inicial por volumen de sustrato procesado (p = 4 mU/ml), las diferencias de comportamiento fueron debidas a las diferencias en la estabilidad con el uso de los distintos derivados. Así las mayores concentraciones de L-dopa final se obtuvieron con NB-— -glut-IME, NPAA-IME y NH-IME (Tabla 16), Así pues, éstos fueron los derivados que en reactor STR dieron mayor estabilidad y que manifestaron mayor actividad, con lo cual la producción de L-dopa por mg de gel fué notoriamente supe- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -114- _- -^ NB^kit-IME 0,8 t NHIHF « N P I IME 0,6 - * NPI acéticolME 0,4 0,2 l i i i i 20 40 60 900 T I E M P O ( min ) Fig. 5 1 . Comportamiento de los geles-nylon-IME en STR. q = 1 mg gel/ml de sustrato. Tabla 16 Productividad de los geles-nylon-IME en STR p = 4 U de IME/litro de sustrato; t-|- = 6 horas GEL-IME L-DOPA Producción en 6 horas gel-IME (mM) mo)/U de IME NB-glut-IME 0,41 102 1,02 NPAA-IME 0,39 98 0,82 NH-IME 0,37 92 0,55 NPI-acético-IME 0,32 79 0,27 NPI-IME 0,31 77 0,23 NB-nitroso-IME 0,28 71 0,36 NAQA-IME 0,22 56 0,38 Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 mol/mg gel Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -115- rior a los restantes de la serie; dado que en la inmovilización se habi'a aplicado en todos los casos la misma cantidad de enzima soluble, son también éstos derivados los que permitieron un mayor aprovechamiento en la utilización de la enzima. El comportamiento en reactor PBCR de los distintos derivados se expresa en los datos de la Tabla 17. A diferencia de lo obtenido en STR, el NPAA-IME dio en PBCR una menor actividad que los demás derivados, lo que pudo ser debido a que, por sus características físicas mostró mayor empaquetamiento con mayores problemas difusionales. La mayor actividad la mostraron los derivados NB-glut-IME y NH-IME, que a su vez fueron los más estables a la reacción dando mayores valores de t^/~ (11 y 8,5 horas, respectivamente). Por ello fueron los que condujeron a una mayor producción de L-dopa después de 15 horas de funcionamiento. El hecho de que el NB-glut-IME sea más estable que los otros dos derivados acoplados también con glutaraldehido((NH-IME y NAQA-IME), puede interpretarse en relación con que en el NB-glut-IME el so- Tabla 17 Actividad, estabilidad (t-j/J y productividad de los geles-nylon-IME en PBCR m = 10 mg gel-IME; gei-IME Q = 5 ml/h. *1/2 (h) Act Ro (U/g gel) Producción en 12 horas (m mol dopa/g gel ) NB-glut-IME 11.0 2,17 1,15 NAQA-IME 7,0 1,97 0,75 NH-IME 8,5 2,04 0,83 NB-nitroso-IME 3,5 1,90 0,61 NPAA-IME 6,5 1,43 0,57 Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -116porte es neutro, mientras que en el NH-IME y en el NAQA-IME los soportes aportan cargas negativas y positivas, respectivamente. El NB-nitroso-IME dio baja producción, debido a su rápida inactivación (t-|/« 3,5 h.), a pesar de dar alta actividad inicial en el PBCR. Como resumen, los geles que se consideraron de mejor comportamiento fueron: 1) el NB-glut-IME, que tanto en STR como en PBCR dio alta estabilidad, actividad y productividad. 2) el NH-IME que dando un nivel me medio en su comportamiento en ambos reactores, ofreció la ventaja de que su preparación es la menos laboriosa. 3) el NPAA-IME dio buenos resultados en STR, pero no en PBCR, lo que junto con el hecho de que su preparación es muy laboriosa, limitan lias posibilidades de su utilización. 7.3. EFECTO DE LA CANTIDAD DE PROTEINA SOBRE LA INMOVILIZACIÓN. Para estudiar la capacidad de unión de los soportes NB y NH, para la obtención de los derivados NB-glut-IME y NH-IME, que fueron los seleccionados para su uso posterior, se trataron con cantidades crecientes de protei'na y se midió la actividad manifestada por los geles-IME obtenidos. Se observó que para el NH-IME se alcanzó antes la saturación del soporte que en el caso de NB-glut-IME (Fig. 5 2 ) , lo que debe ser debido a la existencia de mayor número de grupos funcionales en el soporte NB. A cantidades bajas de protema no hay apenas diferencia de comportamiento entre ambos soportes, dado que están muy por debajo de las cantidades necesarias para saturarlo. De estos resultados se deduce que, las cantidades óptimas de enzima aplicada para conseguir alta actividad en el gel-IME, pero sin pérdida de rendimiento de inmovilización, son de unas 10 U/g gel para el NH-IME y de 20 U/g gel para el NB-glut-IME, con la preparación de enzima purificada utilizada, lo que correspondió a 1,53 y 3,07 mg de protei'na/g gel. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -11730 r— 0 I • i 0 i i 20 P R O T E I N A J 40 • 1 • 60 ( U d e SE/g gel) Fig. 52 Efecto de la cantidad de proteína sobre la inmovilización en NH y NB. Enzima purificada CM/Phe con actividad específica de 6,5 U/mg de protei'na. 7.4. ESTABILIDAD A L ALMACENAMIENTO. Para estudiar cómo se comportaban los derivados NH-IME y NB-glut-IME con el almacenamiento, una porción de gel se guardó en frigorífico (5 °C) suspendida en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0, y otra se liofilizó y almacenó en congelador (—30 °C), y se midió la actividad en pequeñas porciones tomadas a distintos tiempos. (Fig. 53) Se observó que, tanto el NH-IME como el NB-glut-IME sufrían una notoria pérdida de actividad por el proceso de liofilización, pero se mantenía la actividad residual estable al menos durante 60 días. En cambio los geles suspendidos en tampón fosfato experimentaban una pequeña pérdida de actividad con el tiempo, lo que fué algo más notorio con el NH-IME que con el NB-glut-IME. Normalmente, en la realización de los trabajos de esta Memoria, los preparados de nylon-gel-IME se almacenaron en frigorífico suspendidos en tampón fosfato. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -118- NB-glut-IME (Pi.5°C) 20 T I E M P O Fig. 53. 40 60 ( di» ) Estabilidad al almacenamiento del NH-IME y del NB-glut-IME P¡: suspendido en tampón fosfato a 5°C L: liofilizado y conservado a —30°C 7.5. PERFILES pH-ACTIVIDAD. Cuando se comparó la variación de la actividad con el pH para varios derivados inmovilizados en los soportes de nylon, se observó en general muy ligeros desplazamientos del pH óptimo hacia pH alcalino, y que aumentó la estabilidad a los cambios del pH con respecto a la enzima soluble, especialmente con NH-IME y NPAA-IME, en que la actividad sufre sólo pequeñas variaciones entre pH 6,0 a 8,0. Los ligeros desplazamientos del pH óptimo ob servados, no son significativos a la hora de interpretar los efectos de la concentración de H en la actividad del IME. De los resultados obtenidos se optó por el pH 7,0, como valor óptimo para la utilización de los derivados de gel-nylon-IME, valor igual al que se veni'a utilizando con la enzima soluble y con la enzima inmovilizada en Enzacryl-AA y en CPG-AA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -119- 7.6. PROPIEDADES CINÉTICAS DE LOS G E L E S - N Y L O N - I M E . Para el estudio de la propiedades cinéticas de los derivados inmovilizados se utilizó, al igual que con Enzacryl-AA, el reactor de baño agitado, en las condiciones del método estándar de medida de actividad (Método: 12. 8.2). Se analizó la cinética para NH-IME, NPAA-IME y NB-glut-IME. Los datos experimentales de v frente a S, se ajustaron también a una ecuación de primer orden (Tabla 18). El hecho de que la actividad responda proporcionalmente a la concentración del sustrato, puede proporcionar algunas ventajas de cara a las aplicaciones anah'ticas de estos derivados inmovilizados de enzima en nylon. Tabla 18 Cinética Ecuación Cinética de primer orden de los geles-nylon-IME ajustada: v = k-S -f- b; k xlO3 k' = k/q , siendo q = m / V g (mg gel/ml) bxlO3 k' (mM/min) (min r gel-IME (min NH-IME ) • g gel • mi) 9,6 2,1 2,4 0,996 NPAA-IME 13,6 2,4 3,4 0,994 NB-glut-IME 16,4 3,5 4,1 0,908 r: coeficiente de correlación. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 8. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS DE L-DOPA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -121- 8. APLICACIÓN DE LA TIROSIIMASA INMOVILIZADA A LA SÍNTESIS DE L-DOPA. El compuesto L-dihidroxifenilalanina, conocido como L-dopa ó levodopa es un fármaco que se ha utilizado y sigue empleándose en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (Van Woert, 1976). También se ha sugerido entre otras, su aplicación a determinados cánceres de piel por la toxicidad selectiva que muestra la L-dopa sobre células de melanoma (Wick et al. 1977 ) y también en procesos de desarrollo infantil (Chakmakyan et al. 1973) y en tratamientos de enfermedades afectivas (Costa y Gessa, 1977). Por ello, en la actualidad existen varios métodos de si'ntesis qui'mica, bajo diversas patentes comerciales (Merck Index, 1978). En nuestro caso, hemos estudiado la capacidad de reactores con tirosinasa inmovilizada para la si'ntesis de L-dopa a partir de L-tirosina, en presencia de ascorbato. El desarrollo de un método bioqui'mico para la si'ntesis de este fármaco, estuvo encaminada tanto hacia la posibilidad de su aplicación industrial, como hacia la implantación del sistema inmovilizado en seres vivos, para la si'ntesis in situ 8.1. de L-dopa CRITERIOS DE COMPARACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE DISTINTOS REACTORES Y SOPORTES. La producción de L-dopa se estudió en los reactores de baño agitado (STR), de baño agitado continuo (CSTR) y de columna de lecho empaquetado (PBCR), utilizando los derivados de tirosinasa inmovilizada Enzacryl-AA-IME, CPG-AA-IME, NB-glut-IME y NH-IME, en cada uno de los anteriores reactores. Todos los ensayos para un determinado gel-IME se realizaron con muestras del mismo, obtenidas a partir de una misma preparación de <ME, e inmovilizada inmediatamente después de la purificación del extracto de tirosinasa.. Además todas las experiencias se realizaron dentro de un intervalo de tiempo lo suficientemente cor* to, como para que de acuerdo con lo expresado para la estabilidad al almacenamiento, no se dieran cambios significativos en las propiedades del gel-IME. Asi' Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -122- pues los resultados para un determinado gel-IME se obtuvieron en condiciones perfectamente comparables. La disolución sustrato que se procesó en todos los casos estaba constitui'da por: L-tirosina 2,5 mM, L-ascorbato 2,5 mM en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0, sin adición de otros aditivos y a una temperatura de 25°C. Para poder comparar la producción de L-dopa en los reactores con geles-IME de distintos soportes, se optó por no expresar la cantidad de gel-IME en unidades de masa (g ó mg), sino en unidades estándar de actividad enzimática (U), medidas por el método estándar (Método: 12.8.2). Asi', IME representó la cantidad en U de gel-IME aplicad a a un reactor y que se calculó por IME = m - A c t , M E siendo m (2D la masa en gramos de gel-IME utilizada, y Act||y|£ la actividad están- dar del mismo en U/g gel. Por otro lado, dado que los reactores de gel- IME perdían actividad con el tiempo, la productividad del reactor (producto sintetizado por unidad de tiempo) disminuía paralelamente con la actividad manifestada por el gel -IME en el reactor (Actp), cuya estabilidad a la reacción a largos tiempos ya se ha analizado (Cap. 6 y7) y se cuantifico según los valores de t - j / Por todo ello, para espresar de forma cuantitativa la producción de un reactor a lo largo de su vida de uso, se empleó el término Producción específica (Pr ) para indicar la cantidad de L-dopa sintetizada en un tiempo t por unidad estándar de gel-IME y se expresó en mol dopa/U ó g dopa/U, y el de Producción específica total ( P r j ) para la producción específica en el tiempo total ó vida de uso del reactor (ty). Para t j se adoptó en STR el tiempo necesario para agotar la actividad y en PBCR el tiempo en que la Actp se redujera al 1 5 % de la Actp . El valor de Pr-j- obtenido para un determinado reactor, en unas determinadas condiciones, nos indicó el grado de aprovechamiento o el rendimiento en la utilización del IME para la síntesis de L-dopa, y teniendo encuenta el rendimiento de inmovilización, se puede calcular la productividad del IME respectó a la cantidad de SE utilizada para su preparación. Para expresar el rendimiento de utilización del sustrato L-tirosina, se empleó el factor de conversión (X) definido por la fracción de L-tirosina transformada en L-dopa y calculada por: X = (dopa)/(tir) Q Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 (22) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -123- y el denominado factor de conversión medio (X) como el del volumen de sustrato total ( V g j ) procesado por el reactor en el tiempo t y . Todos los datos necesarios para calcular Pr-|- y X de un reactor se obtuvieron a partir de la medida experimental de las concentraciones de L-dopa en las disoluciones producto, de las características conocidas del gel-IME utilizado y de las condiciones impuestas al reactor. Asi' para calcular la producción específica se empleó la definición operativa: Pr = dopa t /m • A c t | M E (23) y la dopa sintetizada en un tiempo t, dopa t , se cálculos En STR por: dopa t = (dopa) t • M • Vg (24) siendo, (dopa) t la concentración molar de L-dopa en el reactor en el tiempo t; M el peso molecular de la L-dopa y V g el volumen de sustrato en el reactor. En reactores continuos (CSTR y PBCR) por: n d a °P t = n d a - 2 1 (( °P )f ' Q Atf j = Q 2 1 ((dopa)f • Atf ) (25) 1 1 siendo: f una fracción individual eluída del reactor y n el número de fracciones eluídas en el tiempo t; (dopa)f la concentración de L-dopa en la fracción f; A t f en tiempo empleado en eluir dicha fracción; Q el caudal o flujo volumétri- co, constante a lo largo del proceso. El factor de conversión en el tiempo t se calculó en STR por: X = (dopayí tir )Q (26) y en reactores continuos por: X = (dopa) t / (tir ) Q (27) siendo la concentración media de L-dopa obtenida en tiempo t: n y (dopa)1 (dopa)f 1 Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 (28) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -124- Dado que existi'a una inhibición por el producto, era esperable que la cantidad de gel-IME afectase a la producción, en el sentido de que una mayor cantidad de gel-IME por unidad de volumen de sustrato procesado, acumulase mayor concentración de producto, con el correspondiente detrimento de la actividad manifestada por el IME. Además con una mayor velocidad de consumo de los sustratos dará condiciones de menor concentraciones de éstos, especialmente del oxígeno en PBCR. Por todo ello, en el estudio de la producción de un determinado reactor, se empleó como variable definitoria de las condiciones del reactor el parámetro p que se ha definido anteriormente como las unidades estándar de gel-IME empleadas por litro de disolución sustrato procesado en el tiempo t y . Asi' mismo se indicó anteriormente cómo afectaban las variaciones de este parámetro a la actividad y estabilidad del IME en los distintos reactores (Cap. 6.2). Para comparar la producción de dos tipos de reactores distintos ( p. ej. STR y PBCR) ó dos reactores iguales con distintos derivados IME (p. ej. Enzacryl-AA-IME y CPG-AA-IME en STR), es necesario que ambos reactores están en condiciones que podamos considerar "equivalentes". En nuestro caso se consideró que dos reactores estaban en condiciones operativas equivalentes cuando teni'an el mismo valor del parámetro p, De esta forma, a igualdad de p, las diferencias observadas en la producción específica, se atribuyeron al efecto del tipo de reactor ó a los efectos microambientales del tipo de soporte. Para ello, especialmente al comparar diferentes derivados IME, fué necesario que la producción se expresase en términos de cantidad de dopa sintetizada por unidad estándar de IME, tal como se ha definido Pr y Pr-p El resultado del estudio de un determinado reactor en unas determinadas condiciones estuvo resumido en los valores de la Producción específica total (Prj) y del factor de conversión medio o final (X) obtenidos. Ambas magnitudes pueden relacionarse con el valor de p impuesto al reactor, teniendo en cuenta lo siguiente: <*epat pr : = IME = (dTpa)t- VST ' 1 IME Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 M (g dopa/U) (29) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -125- y siendo que: X • = (dopa)t/(tjr) y que : p = IME/VST según (18), se deduce que: Pr T = X-(tir) - -M y por lo tanto: para ( tir ) Q 2,5xlO~-3J M (30) y M 197 dalton se obtiene: (31) Asi' pues el valor de p determina directa y necesariamente el valor de la razón Pr-p / X, pero los valores concretos de estas magnitudes dependerán del tipo de reactor y del soporte. En unos ejes de coordenadas en los que se representen los valores de P r j en ordenadas, frente a X en abcisas, los puntos del plano que toman un determinado valor de p, y por lo tanto un determinado valor de la razón P r j / X , forman lineas rectas para cada valor de p que convergen al centro de coordenadas (isoli'neas de p ó I meas iso-p). Esto permitió hacer representaciones en el plano P r j — X como los de las Figs. 55 a 59, en las que cada punto experimental representa una experiencia con un reactor que produjo la ca cantidad de L-dopa expresada como P r j en ordenadas, con el factor de conver- sión medio X dado en abcisas, cuando el reactor se sometió a las condiciones de trabajo que corresponden al valor de p que se expresa por la proximidad a las i meas iso-p. Estas representaciones con tres variables tuvieron una coherencia impuesta por la relación teórica que existi'a entre P r j , X y p, y sirvieron de comparación de la capacidad de producción de L-dopa de la tirosinasa inmovilizada en los diferentes soportes y funcionando en los distintos reactores que se han estudiado, lo que se analizará én las siguientes Secciones de este Capi'tulo Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -126- 8.2. PRODUCCIÓN DE L-DOPA EN REACTORES CON ENZACRYL-AA-IME. EFECTO DEL TIPO DE REACTOR. 8.2.1. PRODUCCIÓN EN REACTORES DE BAÑO AGITADO (STR). Se ensayaron a microescala reactores STR, utilizando en todos los casos la misma cantidad de gel-IME ( m = 4 mg) de la misma Act||y|£ (45 U/g gel), y con volúmenes variables de sustrato, lo que determinó valores variables de p. Se observó que la concentración final de L-dopa obtenida, y por lo tanto X , aumentó con el valor de p, mientras que la producción específica total obtenida (Pty) disminuyó al aumentar p (Fig. 54), lo que fué debido a que la capacidad catalítica disminuyó notablemente con el aumento de p P Fig. 54. ( U/1 ) Variación de la producción (Pr-¡-) y conversión (X) con las variaciones del parámetro p del rector STR zacryl-AA-IME. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 con En- Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -127- Estos datos se representaron en la Fig. 55 bajo la forma de en vistas a la comparación con otros reactores. La Pr-j- frente a X curva de Producción-Conver- sión indicó que si se pretende un alto rendimiento en la utilización del sustrato, habrá que utilizar reactores que den alta conversión, lo que puede conseguirse con altos valores de p; en estas condiciones la P r j es baja y por tanto se obtiene un bajo rendimiento en la utilización de la enzima. La elección entre condiciones que den un mejor rendimiento en el uso del sustrato o de la enzima, dependen de la finalidad de la aplicación, y si esta es la síntesis industrial de L-dopa, dependerá de los costos correspondientes. 8.2.2. PRODUCCIÓN EN REACTOR CONTINUO DE BAÑO AGITADO (CSTR). Se empleó un reactor tipo, con un volumen de reactor V p de 10 mi conteniendo 4 mg de Enzacryl-AA-IME, siendo el V p mucho menor que el volumen total de sustrato procesado V g j . La concentración de L-dopa en el eluído del reactor aumentó inicialmente con el tiempo de reacción, hasta alcanzar un estado estacionario, a partir del cual fué disminuyendo, debido a la pérdida gradual de actividad del IME (Cap. 6.2). Al igual que en STR, el aumento de p condujo a obtener concentraciones mayores de L-dopa en el eluído y por tanto mayor conversión de producto, disminuyendo la producción específica. Para un mismo valor de p, los valores de P r j y X fueron inferiores en CSTR que en STR (Fig. 55). En este tipo de reactor el efecto inhibidor por el producto L-dopa, fué un factor limitante de la producción, dado que al estar agitado la concentración de L-dbpa fué en todo el volumen del reactor y en cada instante, la del producto de salida, que sólo disminuyó con la pérdida de actividad del gel-IME. En STR, la concentración de L-dopa sólo fué alta sólo fué alta después de que el reactor funcionara durante laro tiempo y se hubieran producido grandes cantidades de L-dopa y en el reactor PBCR se estableció un gradiente a lo largo del reactor. Por ello, la producción de un CSTR sólo se acercó la la de un STR para condiciones de muy bajos valores de conversión. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -128- o. 120 < hO »- S? < s ü — <3> •o ü UJ O. co UJ so Q. O O) ü E ü O O ce a. 20 PORCENTAJE Fig. 55. 40 DE CONVERSIÓN Curvas de Producción-Conversión ( Prj—X ) de L-dopa en reactores con Enzacryl-AA-IME. 8.2.3. PRODUCCIÓN EN REACTOR DE COLUMNA EMPAQUETADA (PBCR). Microcolumnas de 3 mm de diámetro interior, conteniendo 5 mg de Enzacryl-AA-IME de 45 U/g gel, se emplearon como reactores tipo de PBCR. Reactores con distintos valores de p se consiguieron sometiendo los reactores a diferentes valores de velocidad de flujo Q. Conocida la existencia de problemas de suministro de oxigeno (Cap. 6.5.), se estudiaron reactores PBCR con sustrato saturado de aire y de oxígeno. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -129- A) PBCR con sustrato saturado de aire Se observó que para bajos valores de Q y por lo tanto para altos valores de p, proporcionó mayores concentraciones de L-dopa en elui'do.Asf, al igual que en los reactores de baño, aumentó el procentaje de conversión, pero fué en detrimento de la productividad. Las curva de Pry—X obtenida con PBCR con disolución saturada de aire (Fig. 55) sugirió la existencia de un valor h'mite de X y que además resultó muy bajo con respecto a los valores máxi- mos de conversión observados con los otros reactores (menor del 11 % en PBCR , 70 % en STR y 45 % en CSTR). Este h'mite de conversión se consideró debida fundamentalmente a la deficiencia de oxi'geno a que se sometió el sistema cuando se trabajó a flujos lentos; el tiempo de residencia del sustrato fué elevado y la reacción catalizada consumió casi completamente el oxi'geno disuelto. Para flujos elevados, valores bajos de p, el oxigeno se convirtió en un factor menos limitante y la ca cantidad de L-dopa sintetizada fué mayor, pero eluyó del reactor a menor con- centración. Por otro lado, incluso a valores altos de Q la producción fué inferior a la observada en los otros reactores en las mismas condiciones, por loque otros factores limitantes , como problemas difusionales, como consecuencia del empaquetamiento del gel-IME en la columna influyeron en la obtención de menores rendimientos. B) PBCR con disolución sustrato saturada de O^ Comparando la diferencia de comportamiento al saturar la disolución de sustrato con O? puro ( P Q 1 atm) en lugar de con aire atmosféri- co ( P Q 0,21 atm), se observó que para un mismo valor de p dio mayor producción y conversión (Fig. 55), especialmente en condiciones de valores altos de p, Asi' pudieron obtenerse factores de conversión de hasta 30 % . De todas formas, en PBCR la producción fué menor que en los otros tipos de reactores, por lo que su utilización para síntesis de L-dopa sólo estan'a justificada cuando lo que se pretenda sea mantener un nivel de con- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -130centración de L-dopa en un fluido durante largo tiempo y no una máxima producción. En resumen, desde el punto de vista de la producción y siguiendo el criterio de las curvas Pry—X con respecto al parámetro p, podemos afirmar que el orden de eficacia de los diferentes tipos de reactores fué el de STR > C S T R ' > PBCR y este último mejor con disolución saturada con O2 que con aire. Una discusión más detallada de los factores que limitaron la producción en los distintos reactores se hará al final del capítulo en comparación con los resultados obtenidos con CPG-AA-IME. y con los geles-nylon-IME. 8.3. PRODUCCIÓN DE L-DOPA CON CPG-AA-IME. EFECTO DE LA POROSIDAD DEL SOPORTE. Como se vio anteriormente (Cap. 6.2), la estabilidad de la t i rosinasa en CPG-AA fué algo superior a la observada en Enzacryl-AA-IME en un factor de 1,4 -1,5 veces, tanto en STR como en PBCR. Por otro lado, la actividad del Enzacryl-AA-IME. en reactores PBCR fué muy inferior que en STR, cumpliéndose que A c t p B C R o = 0 , 2 1 - A c t ^ ^ , mientras que con CPG-AA-IME fué ActpRpD = 0,72. Act PBQRQ para unas condiciones determinadas de ensayo (p = 2 U/1). Con ello, aunque el CPG-AA-IME retuvo menos actividad que el Enzacryl-AA-IME en la inmovilización ( Act^pQ.|j v1 £ / Act|r n z a c r y|_|ME = 0,55), la columna empaquetada manifestó 1,8 veces más actividad que con Enzacryl-AA-IME. Estas diferencias de comportamiento se interpretaron como debidas fundamentalmente a la porosidad del CPG-AA, en el cual quedaron minimizadas las limitaciones difusionales. Estas propiedades determinaron las diferencias observadas cuando se empleó CPG-AA-IME para la síntesis de L-dopa, con respecto al EnzacrylAA-IME. En la Fig. 56 se dan las curvas Pry—X obtenidas con los reactores Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -131STR, CSTR y PBCR con disolución saturada de aire. La diferencia más significativa respecto al uso de Enzacryl-AA-IME, es que las curvas P r T - X del reactor de columna se acercan más al comportamiento del reactor de baño. Por ello, mientras en STR el comportamiento es muy semejante con ambos soportes, en PBCR resultó más eficaz el empleo de CPG-AA como soporte. PORCENTAJE Fig. 56. DE CONVERSIÓN Producción de L-dopa en reactores con CPG-AA-IME. Curvas Pr-y - X. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -132- 8.4. PRODUCCIÓN DE L-DOPA EN REACTORES CON G E L E S - N Y L O N - I M E . Los derivados de nylon que habi'an sido seleccionados por su mejor comportamiento respecto a rendimientos de inmovilización y por la e s t a bilidad de la reacción a latgo tiempo (Cap.7), se ensayaron para producción de L-dopa. En reactor de baño STR, se estudió de L-dopa la capacidad de síntesis de los derivados NPAA-IME, NB-glut-IME y NH-IME. Desde el punto de vista de las curvas de P i y - X se apreció que la capacidad de síntesis fué del mismo orden que lo observado anteriormente para el Enzacryl-AA-IME y el CPG-AA-IME (Fig. 57) 10(0,5.' 2.0. • 1,0 3.0 . • O. < H O H < O UJ I 60 0) "O LU O. (/i Ul (0 Q. O •o O) o o D O O CC E 20 OL J 30 Ü¿ 10 C O N V E R S I Ó N L 50 ( XxlOO) Fig. 57. Curvas P r j — X en reactores STR con geles-nylon-IME. Ensayos con 10 mg gel-IME y Vg variable para dar los valores de p que se indican. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -133En el reactor de columna PBCR no se aplicó el derivado NPAA-IME, ya que había dado muy baja actividad en este reactor. El derivado NB-glut-IME dio en PBCR mayor producción específica que el NH-IME como consecuencia de la mayor estabilidad a la reacción, especialmente para bajos valores de p, ya que para altos valores de p ambos estaban limitados por el suministro de oxígeno. (Fig. 58). Q2 0.5 H i0. p (U/1) \ 120. < O < ü LU LL. — O "O LU O. \ o 80 NH-IME w LU 1,0 . \ NB-glut-IME V ra o. o •o O O 2.0 O) E 40 O o • CE 4,0 O. Ü - ; L 1 12 16 20 24 PORCENTAJE DE CONVERSIÓN (Xx 100) Fig. 58. Curvas P r j - X en reactor PBCR con geles-ny Ion-I ME Ensayos con 10 mg del-IME y condiciones variables de Q. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -134- Cuando se comparó las curvas Pr-j- — X para los reactores STR y PBCR con un mismo gel-IME, por ejemplo NH-IME en la Fig. 59, se observó que efectivamente en PBCR la productividad fué menor que en STR, co como consecuencia de las limitaciones que ya se han comentado para este tipo de reactores. Ahora bien, las citadas curvas, indican que la producción con los geles-nylon-IME aplicados en PBCR fué del mismo orden que con CPG-AA-IME y por lo tanto mayor que con Enzacryl-AA-IME; lo que fué especialmente cierto con NB-glut-IME a bajos valores de p. Esto no era debido a la estabilidad de la reacción, dado que los geles de nylon-IME dieron menores t - j / j que el Enzacryl-AA-IME, sino que puede relacionarse con el hecho de que la razón de Actpg£ R / A c t j j f p fué mayer con íos geles-nylon-IME, lo que debe encontrar ex- explicación en la existencia de menores limitaciones difusionales que en el caso del Enzacryl-AA-IME. 100 O ui o. CO LU ü O => O O ce o. : o.s .'l ,0 . 2 , 0 _80 .•' 3,0 T» UJ 2 V i / 0) "0| Z3\& ( mg dopa/ < O H < ü • • 4,0 \ • '^^^• - . . • ' 6,0 . 'ó \ STR 20 ~ •' •••'.•' & » PBCR • • • 20 ' ,. , 1 ,, t 40 PORCENTAJE DE CONVERSIÓN ( X x 100) Fig. 59. Curvas Pr T - X en reactores STR y PBCR con NH-IME. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 60 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -135- Como resumen de este capítulo, en base a la comparación de las curvas de Producción — Conversión para los reactores estudiados, tanto con Enzacryl-AA-IME (Fig. 55) como con CPG-AA-IME (Fig. 56) y con los derivados de geles-nyIon-I ME (Fig 57 a 59), respecto a la producción de L-dopa con reactores de tirosinasa inmovilizada podemos decir que: 1) En todos los tipos de reactores y con los diferentes soportes, se aumenta la producción al disminuir el valor de p, pero en este caso disminuye el factor de conversión. La elección entre una mayor producción (mayor rendimiento en el uso del IME) o un mayor factor de conversión (mejor rendimiento de aprove- . criamiento del sustrato), puede depender de la finalidad a la que se aplique el reactor. 2) El reactor de baño agitado, no modificó apenas su comportamiento al modificar la porosidad del soporte y resultó más eficaz que los demás tipos de reactores. En reactor de columna empaquetada con empaquetada con Enzacryl-AA-IM -IME dio muy baja productividad que mejoró saturando la disolución sustrato con C>2- El comportamiento descrito por las curvas de Producción-Conversión se acercó más a la del baño agitado cuando se utilizó un soporte de mayor tamaño de poro, como ef CPG-AA, ó que no fuera poroso y por lo tanto la unión de la enzima al soporte fuera superficial, como en el caso de. los geles-nylon; esto se debe a que en ambos casos disminuyen las limitaciones difusionales respecto al caso del Enzacryl-AA. Los factores que limitaron el rendimiento de los reactores en los procesos de transferencia de masa fueron principalmente: a) Acumulación de producto. Dado que existe un efecto de inhibición por la acumulación de L-dopa, en todos los reactores disminuyó la productividad cuando se aplicaron condiciones para dar altos factores de conversión. En CSTR, e'ste factor fué más determinante que por ejemplo en STR, porque en él la concentración de L-dopa fué en todo el volumen y en todo el tiempo de uso del reactor, la del flujo de salida, dando menor producción que en STR, aunque en el CSTR no había tampoco problemas difusionales ni de suministro de C>2- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -136b) Problemas de difusión. Fueron especialmente importantes en PBCR, como consecuencia del empaquetamiento y la falta de agitación. Los problemas difusionales dismunuyeron su importancia con el uso de CPG-AA y de soportes de nylon por sus características de porosidad. Para un mismo flujo, cuando se aumentó la velocidad lineal diaminuyendo la sección de paso del reactor, se mejoró ligeramente la eficacia del reactor. En STR la producción fué semejante con los diferentes soportes ya que no hubo problemas difusionales gracias a la agitación. c) Suministro de oxígeno. El proceso catalizado por la tirosinasa consume oxígeno, por lo que en el reactor PBCR sin más oxígeno que el aportado por la propia disolución de sustrato, se tienen serios problemas de rendimientos a pesar de dar mayores t - j / ? que en los demás tipos de reactores. d) La inactivación por el uso. La pérdida de actividad del IME a lo largo del tiempo de funcionamiento del reactor, limitaron la productividad de acuerdo con lo expuesto anteriormente respecto a la estabilidad de la reacción medida por lo los valores de t - | / „ . La acumulación de las limitaciones b y c, hicieron a los reactores de lecho empaquetado los menos productivos, aunque su vida de uso fuera mayor, por lo que su utilización sólo estará justificada para aplicaciones en los que se pretenda mantener un nivel de L-dopa en un fluido durante largo tiempo. Así por ejemplo en aplicaciones para investigaciones fisiológicas o terapéuticas. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 9. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y MEMBRANAS DE NYLON. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -138- 9. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA EN TUBOS Y MEMBRANAS DE NYLON. Los métodos de inmovilización seleccionados en el estudio con los geles de nylon (NH y NB activados con glutaraldehido) por dar majores resultados y por la sencillez de su preparación, se aplicaron a otras formas f í s k . cas de nylon, como tubos capilares y membranas o mallas. Se intentó aplicar estos derivados inmovilizados con fines analíticos en la realización de un electrodo de enzima para la determinación de sustratos de la enzima. 9.1. INMOVILIZACIÓN EN TUBO DE NYLON 9.1.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN. En la inmovilización de tirosinasa sobre la superficie inteeior de tubo de nylon, resultó significativo que el rendimiento de inmovilización fuera mayor en la preparación del tubo NH-IME que en la del NB-IME (Tabla 19) contrariamente a lo ocurrido con los geles-IME (Cap.7.1). La explicación de este hecho podría atribuirse al propio proceso de preparación del gel-IME y del tubo-IME que se diferencian entre sí en el tratamiento físico-químico previo a la modificación química. Así, para la preparación del gel de nylon, éste se suspendió en una disolución de ClCa anhidro al 20 % en metanol y luego se precipitó en medio acuoso como partículas finas de gel (Método: 12.2.2). Sin embargo el tratamiento en eJ caso de tubo fué más suave puesto que la disolución de ClCa contenía también agua (18,6 % de ClCa y 18,6 % de H2O en metanol), con lo cual no se llegaba a disolver, sino simplemente sufría un efecto superficial de hinchamiento y de aumentar el carácter amorfo de la superficie. En esta diferencia de tratamiento es en lo único en que podría basarse las diferencias entre gel y tubo. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -139- Tabla 19 Rendimiento de inmovilización en tubo de nylon Enzima tratada: SE/m = 10 mU/cm de tubo. Tubo de 1 mm de diámetro. Tipo de nylon activado con ^ctIME (mU/cm) r 'nm NH glutaraldehido 9,6 0,96 NB glutaraldehido 6,0 0,60 9.1.2. PROPIEDADES CINÉTICAS DEL TUBO-IME Para estudiar el comportamiento cinético, se midió la actividad a distintas concentraciones de sustrato por el método estándar (Método: 12.5.2) en el cual el sustrato se recicló a través del tubo-IME a alta velocidad de flujo para garantizar la ausencia de problemas difusionales y de suministro de oxi'geno para la reacción. A l igual que en geles-IME, respondió a una cinética de seudoprimer orden (Fig.60). Realizando una representación de Lineweaver-Burk de las inversas de velocidad y la concentración de sustrato, se obtuvo un valor de K|y| de 4,7 mM, valor lo suficientemente superior a la concentración de suistratQ?que permite la solubilidad de la tirosina, como para dudar seriamente de su significación.. El hecho de que la actividad del tubo-IME respondiera de forma lineal con la concentración de sustrato, sugirió la posibilidad del uso del sistema tubo-IME para fines analíticos de determinación de sustratos específicos de la enzima. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 6 4 (mU/cm) . • j 2 ¡" O * O / / i !" / / ' • ' ' 1 -J ' 2 ' — L - T I R O S I N A (mM) Fig. 60. Cinética de seudoprimer orden del tubo NB-IME. 9.1.3. ESTABILIDAD A L USO CONTINUO E INTERMITENTE DEL TUBO-IME. POSIBILIDADES ANALÍTICAS. Las posibilidades del uso de las enzimas inmovilizadas en tubo de nylon para métodos analfticos, ya fueron sugeridas por Hornby et al. (1973) de cara a análisis automáticos. Sundaram (1977a) hace una revisión de las enzimas inmovilizadas en tubo de nylon que se han utilizado para análisis de metabolitos en sistemas bilógicos. Recientemente se han descrito métodos acoplados a un analizador automático para la determinación de glucosa en suero empleando glucosa deshidrogenasa inmovilizada en tubo de nylon (Sundaram et al., 1979); asi* como creatinina y creatina mediante el uso de creatinasa acoplada a piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa (Sundaram e Igloi, 1979). También se ha aplicado el sistema de tubo-IME para la determinación de urea en la orina y suero, por medio de un sencillo sistema de acoplamiento del tubo-IME a una micropipeta de émbolo (Sundaram yJayarama, 1979). Este sistema deno- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -141- minado " I m p e t t e " por Sundaram (1979), evita el costoso empleo de un analizador automático para determinaciones de rutina. Pensando en estas posibilidades se ha estudiado la estabilidad del tubo-IME a la reacción para uso continuo a lo largo del tiempo o para uso repetitivo con cortos tiempos de reacción. Cuando se ensayó a largo tiempo se observó que la velocidad de inactivación era mayor que la que dio el gel-IME preparado por el mismo procedimiento (Fig. 61). Este hecho cabe interpretarse en función de que la inmovilización en tubo de nylon es más superficial y por lo tanto, la enzima está expuesta a los fenómenos de desnaturalización mecánica más en el tubo que en el gel. Esta inactivación limitó enormemente la posibilidad de utilización del sistema para un análisis continuo de un sustrato de la enzima. 0,3 s E < a. 0,2; O O i 0,1 ¡ 0,0 0 5 10 T I E M P O Fig. 61 15 ( horas ) Estabilidad del tubo-NB-IME al uso continuo. Comparación con gel-NB-IME. Ensayos con 0,16 U de gel ó tubo -IME a Q 5,2 ml/h. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Se analizó también el efecto de la interacción de pequeñas muestras de sustrato (1 mi) durante periodos cortos de tiempo (10 min.) y de forma intermitente sobre la actividad del tubo-IME. Al término de cada ensayo el tubo-IME se lavó con disolución de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 durante 5 minutos y se reutilizó en el siguiente ensayo. Se observó suficiente estabilidad durante al menos 9-10 ensayos, salvo una notable pérdida de actividad en el primer ensayo en el tubo-NH-IME (Fig. 62). Esta pérdida de actividad en el primer ensayo puede ser debida a la eliminación de enzima que no estuviese unida covalentemente al soporte. La posibilidad de aplicación de la tirosinasa inmovilizada entubo de nylon dependió de la obtención de un sistema idóneo de almacenamiento, ya que después de almacenarlo durante cinco di'as en tampón fosfato en nevera a 5 °C, no sólo habi'a perdido más del 50 % de actividad, sino que la estabilidad del I ME al uso intermitente decayó notablemente. —m. I-i 2 1 1 1 • 4 « S 10 I NUMERO DE ENSAYOS Fig. 62. Estabilidad del tubo-IME al uso intermitente.Los ensayos de actividad se realizaron al di'a siguiente de su preparación según método estándar (12.8.2). Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -1439.2. INMOVILIZACIÓN EN MEMBRANAS DE NYLON. Se inmovilizó tirosinasa sobre membranas de nylon modificadas como NB y NH activadas con glutaraldehido, con el fin de obtener membranas sensibles a los sustratos específicos de la tirosinasa para aplicaciones analíticas. 9.2.1. RENDIMIENTO DE INMOVILIZACIÓN EN FUNCIÓN DE LA CANTIDAD DE PROTEINA. En experimentos en los que se aplicó hasta 65 mU de enzima purificada, no se logró saturar toda la capacidad de unión del soporte. La actividad manifestada por las membranas-IME obtenidas fué aproximadamente proporcional a la cantidad de protema ¡nicialmente presente en la disolución de inmovilización (Fig. 63). Los rendimientos de inmovilización que pueden de- 20 PROTEINA TRATADA 40 60 2 ( mU/ cm ) Fig. 63. Efecto de la cantidad de proteína sobre la actividad manifestada por las membranas-IME. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -145berse a la menor porosidad, rugosidad y carácter amorfo del material que constituye el tejido o malla de las membranas de nylon, en comparación con el del gel de nylon, lo que se reflejaría en una menor protección de la estructura de la enzima inmovilizada. En el Capítulo siguiente se analizará la aplicación de estas membranas de nylon con tirosinasa inmovilizada para la determinación analítica de sus sustratos por medio de un electrodo de enzima. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 10. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEMBRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -147- 10. APLICACIÓN DE LA TIROSINASA INMOVILIZADA EN MEMBRANA DE NYLON A UN ELECTRODO DE ENZIMA. Una de las aplicaciones analíticas de las enzimas inmovilizadas son los electrodos de enzima. Un electrodo de enzima- se define básicamente como la unión de una enzima y un sistema electroquímico. La enzima inmovilizada en un soporte insoluble en agua se acopla a un electrodo selectivo de iones que puede medir la desaparición de un sustrato ó el aumento de la concentración de uno de los productos de la reacción catalizada por la enzima. La sustancia a medir difunde en la capa de la enzima del electrodo, produciendo o consumiendo una sustancia electroactiva, la cual se detecta por el electrodo. El potencial o la corriente producida es una función de la concentración de la sustancia detectada. Updike y Hicks (1967) fueron los primeros en" emplear un electrodo con glucosa oxidasa inmovilizada en gel de poliacrilamida y fijada sobre un electrodo de oxígeno. A partir de entonces se han desarrollado diferentes electrodos de enzima para la detección de sustratos y metabolitos (Guilbault y Lubrano, 1973, 1974a, 1974b; Clark, 1972; Clark y Clark, 1973), basados fundamentalmente en métodos amperométricos. En la bibliografía se ha sugerido el uso de tirosinasa para la determinación analítica de L-t¡rosina en muestras fisiológicas de suero y orina. Así Kumar y Christian (1976) mencionan el empleo de tirosinasa soluble de champiñón para la determinación de L-tirosina, basado en la velocidad de consumo de oxígeno midiendo éste con un electrodo de Clark. Schiller y Liu (1976) utilizaron la tirosinasa inmovilizada en gel de poliacrilamida para la detección de fenoles y compuestos relacionados, en efluyentes industriales y aguas residuales mediante medidas espectrofotométricas de la velocidad de reacción, y más tarde Schiller et al. (1978) describieron el empleo del mismo sistema, acoplado a un electrodo de platino para la medida potenciométrica frente a un electrodo de calomelanos como referencia. Aunque el método fué muy Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -148- Cat. Ar El Fig. 65. Detalle del electrodo de enzima. An, conexión al ánodo de Ag. Cat, conexión al cátodo de Pt. BE, bloque del electrodo. M-PTFE, membrana de teflóm. M-NY-IME, membrana de nylon con enzima inmovilizada. Ar, arandela de goma. El, electrolito. Fig. 66. Esquema general del electrodo de enzima. E, electrodo de oxigeno. S, disolución de sustrato. BM, barra magnética. A M , agitador magnético. T, fluido de termostatización. UE, unidad electrónica. R, registrador. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -149- sensible, la enzima asi' inmovilizada fué muy inestable al uso y al almacena miento y no permitía el uso repetitivo del electrodo de enzima. 10.1. DISEÑO DE UN ELECTRODO DE TIROSINASA. Se diseñó y construyó un electrodo de enzima basado en tirosinasa inmovilizada por unión covalente a las membranas de nylon modificadas como NB y activadas con glutaraldehido. La membrana de NB-IME se acopló posteriormente a un electrodo de Clark, el cual es sensible a las concentraciones de oxígeno. La reacción enzimática de la tirosinasa lleva consigo un consumo de oxi'geno, por lo que era de esperar una respuesta del sistema al interaccionar con los sustratos especi'ficos de la enzima. El esquema del montaje del electrodo de enzima diseñado se describe en las Figs. 65 y 66. 10.2. RESPUESTA TÍPICA DEL ELECTRODO DE ENZIMA Y CRITERIOS DE MEDIDA. En la Fig. 67 se muestra la respuesta característica que dio el electrodo de enzima en su interacción con una disolución de sustrato. Para cuantificar esta respuesta se adoptaron los siguientes criterios de medida de la actividad: A) Pendiente máxima. Representa el valor máximo de velocidad de consumo de oxígeno a lo largo de la duración del ensayo. Esto viene a coincidir con la velocidad inicial, una vez que se ha superado un corto periodo de retardo, el cual en la mayor parte de los casos no era detectable. B) Porcentaje de oxígeno consumido a un tiempo fijo, por ejemplo 36 D 60 segundos. La medida por este método pudo hacerse con más precisión que en el caso anterior. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -150100 *- 80 _ » ( O j l «n i O 20 Q | co Z O Ü O • t-1 •*< 60 z O ] ipimniHg 40 LU i l - M m C? 60 z LU O >< O 80 20 o >< O 100 0 1 2 T I E M P O 3 ( min. ) Fig. 67. Respuesta del electrodo de enzima con el tiempo. Criterios de medida. (Ver texto). C) Porcentaje de oxígeno consumido a largo tiempo, una vez alcanzado el estado estacionario. Este criterio, en principio, parece el más adecuado, pero tiene el inconveniente de una mayor duración del ensayo, lo que implica una mayor fatiga del electrodo. 10.3. EFECTO DE LA AGITACIÓN, DE LA PRESENCIA DE ASCORBATO Y DEL TIPO DE SUSTRATO SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO. Para comprobar en qué grado influían los fenómenos de transferencia de masa con limitaciones difusionales sobre la respuesta del electrodo, se comparó la diferencia de respuesta que dio el electrodo en ensayos, realizados en iguales condiciones, pero unos con agitación magnética de la disolución y otros sin ella. La agitación dio respuestas con menor velocidad inicial y menor consumo de oxígeno para alcanzar el estado estacionario ( Fig. 68). Este hecho sugirió la presencia de fenómenos de difusión externa en la actividad del electrodo. Respecto a la presencia de ascorbato, tanto al utilizar Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Fig. 68. Efecto de la agitación, de la presencia de ascorbato y del tipo de sustrato sobre la respuesta del electrodo de enzima. Sustrato 1 mM, ascorbato 2,5 mM Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -152- L-tirosina como L-dopa, la respuesta fué más intensa respecto a la velocidad lineal y al oxi'geno consumido para alcanzar el estado estacionario. Este hecho era esperable dado que el ascorbato es a su vez oxidado por el sistema de reacciones que se dan en presencia de tirosinasa (Cap. 4.5). También se observó que a igualdad de concentraciones de los dos sustratos empleados, la respuesta fué notoriamente más intensa con L-dopa que con L-tirosina. Esto fué coherente con el hecho de que la actividad dopa oxidasa sea mayor que la acividad tirosina hidroxilasa. Dadas estas diferencias de comportamiento, a la hora de estudiar las propiedades analíticas del electrodo pareci'a conveniente analizar cada una de estas condiciones de ensayo. 10.4. EFECTO DEL VOLUMEN Y DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO DE ENZIMA. Si la velocidad de difusión de oxígeno a la membrana fuera mucho mayor que la velocidad de la reacción enzimática, el oxígeno estaría en equilibrio de difusión en el exterior e interior de la membrana, en cuyo caso la respuesta del electrodo respondería a las variaciones de concentración de oxígeno de la disolución. Si esto fuera así, dos ensayos realizados con la misma membrana y en las mismas condiciones consumirían la misma cantidad de oxígeno por unidad de tiempo; si en uno de ellos se emplease un volumen mayor de muestra, el consumo de oxígeno sería menor en términos de concentración, y por lo tanto la intensidad de respuesta del electrodo también sería menor. Sin embargo, se observó que al aumentar el volumen del medio de 1 a 4 mi, no se producía una disminución de la señal registrada, tanto respecto a velocidad inicial como al oxígeno consumido a un determinado tiempo Esto significó que los equilibrios de difusión son más lentos que la velocidad de reacción y que por lo tanto se está midiendo solamente la concentración local de oxígeno en las inmediaciones de la membrana, que son las inmediaciones del electrodo. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -153- Por otro lado, al variar la concentración del sustrato la respuesta del electrodo varió proporcionalmente (Fig. 69). Esto sugirió que verdaderamente podía aplicarse el sistema para la determinación de L-tirosina y L-dopa con fines analíticos, dado que era propiamente un electrodo que respondía a la concentración y es específico para los sustratos propios de la enzima. La validez como sistema analítico dependerá de la precisión, exactitud, sensibilidad, fatiga, etc., características que se analizarán a continuación. ESCALA Fig. 69. DE TIEMPO 1 min. (" <) Variación de la respuesta del electrodo de tirosinasa con la concentración de sustrato. L-tirosina a la concentración indicada en presencia de ascorbato 2,5 mM. El origen de cada curva representa el tiempo inicial para cada ensayo. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -154- 10.5. EFECTO DE LA A C T I V I D A D ENZIMATICA DE LA MEMBRANA SOBRE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO DE ENZIMA. La respuesta del electrodo aumentó con la actividad enzimática de la membrana utilizada de forma aproximadamente proporcional con los distintos criterios de medida (Fig. 70). Esto demostró que, por un lado la respuesta del electrodo es realmente un fenómeno dependiente de una actividad enzimática y que por lo tanto es un verdadero electrodo de enzima, y por otro lado indicó que la sensibilidad del electrodo podía aumentarse empleando mem branas con más actividad enzimática. o 9-° ¡ I 6 W ACTIVIDAD Fig. 70. MEMBRANA 15 ( mU/cmM Efecto de la actividad enzimática sobre la respuesta del electrodo de tirosinasa. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -155- 10.6. INTERPRETACIÓN DE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO. Es difícil interpretar el mecanismo que se da en un electrodo de enzima debido normalmente a los fenómenos de superficie que se dan por lo general en los electrodos especi'ficos. Las caracten'sticas de la respuesta del electrodo indican que son tres los fenómenos que intervienen y que se esquematizan en la Fig. 71 y que se describen a continuación: 1) Difusión del oxígeno y del sustrato de la disolución a la membrana de enzima. En la velocidad de este proceso influye la concentración de sustrato en la disolución. La concentración de oxígeno inicial no afectó a la diferencia de respuesta en los diferentes ansayos, ya que en todos los casos se empleó disoluciones saturadas de aire en las mismas condiciones. 2) La reacción en zimática catalizada por la tirosinasa que consiste en la oxi- dación de un sustrato específico de ella. La velocidad de esta reacción depende de la concentración de sustrato y va acompañada de la correspondiente velocidad de consumo de sus inmediaciones, y le seguirá una difusión de los productos de reacción hacia el exterior (disolución de sustrato). 3) Difusión del oxígeno a través de la membrana de teflón del electrodo de Clark. El oxígeno que difunde es el que se encuentra en las inmediaciones de la membrana de enzima dando una respuesta polarográfica que es electrónicamente traducida por el aparato que la registra como porcentaje de concentración de oxígeno respecto a la disolución blanco con que se ajusta el aparato. La combinación de estos procesos da como consecuencia una respuesta que depende de la concentración de sustrato que puede explicarse de la siguiente forma: La concentración de oxígeno detectada en las inmediaciones de la membrana depende fundamentalmente de la velocidad de reacción enzimática que lo consume y de los equilibrios de difusión que lo incorporan a partir de la disolución. Estos equilibrios son más lentos que la reacción enzimática, como se ha confirmado anteriormente. Por lo tanto, ante la presencia Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert ÁNODO ÁNODO CÁTODO 0 2 + 2 H 2 0 + (4 e ) electrolito (BrK) I ME • membrana de nylon IME y H20 m } 2ext -\-—X >ext ext DISOLUCIÓN ENSAYO Fig. 7 1 . Interpretación de la respuesta del electrodo de enzima. Las flechas de trazo grueso indican el sentido neto de flujo. S, sustrato. P, producto de reacción. IME, tirosinasa inmovilizada en la membrana de nylon. ext, en la disolución externa, m, en las inmediaciones de la enzima situada en la membrana de nylon. i, intensidad de corriente registrada. Potencial dé polarización del electrodo: 0,8 voltios. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 DE Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -157- de sustrato, la reacción enzimática disminuirá la concentración de oxígeno en la membrana a una velocidad inicial que depende de [a concentración del propio sustrato. Conforme la concentración de oxígeno disminuyó con el tiempo, la velocidad de difusión de éste desde la disolución hacia la membrana aumentó. Así, el balance neto fué que la concentración de oxígeno detectada en la membrana disminuyó a una velocidad cada vez más lenta, hasta alcanzar una situación de estado estacionario, en que la velocidade de incorporación de oxígeno por difusión y la de consumo por la reacción enzimática fueran iguales. Así, la concentración de oxígeno alcanzó un valor final estacionario, cuyo valor fué menor cuanto mayor fué la concentración de sustrato en la disolución, tal como se observó en la Fig. 69. 10.7. FATIGA DEL ELECTRODO CON EL NUMERO DE ENSAYOS. Para estudiar las posibilidades analíticas de un electrodo hay que tener en cuenta la fatiga de éste, es decir, la pérdida de actividad con su uso. Si la fatiga es muy pequeña, el electrodo puede calibrarse inicialmente y después utilizarse para hacer determinaciones hasta que la pérdida de actividad por el uso sea como máximo del mismo orden que el error admisible del método. Si la pérdida de actividad en cada ensayo es próxima al error admisible, sólo podría utilizarse el electrodo para fines analíticos, si previamente se estudia la fatiga por el uso y en cada ensayo se le aplica el factor de corrección correspondiente. En nuestro caso se ha analizado la pérdida de actividad con el número de ensayos utilizando L-tirosina ó L-dopa como sustratos, en presencia y ausencia de ascorbato y aplicando los distintos criterios de medida de la respuesta del electrodo. Con sustrato L-tirosina, los valores experimentales de actividad relativa representados frente al número de ensayos se ajustaron a una recta (ejemplo en Fig. 72). El valor de la pendiente ( m ) de ésta recta, nos Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -158indicó la pérdida de respuesta por ensayo. Como puede verse en la Tabla 20, el valor de la pendiente de la recta no varió notablemente al aplicar los distintos criterios de medida ó las condiciones, como la presencia ó ausencia de ascorbato. Cabe señalar que cuando se empleó como criterio de medida el oxi'geno consumido a un tiempo fijo, en general se obtuvieron coeficientes de correlación superiores a los otros dos criterios de valoración de la respuesta del electrodo. A l medir la respuesta del electrodo con sustrato L-dopa, las curvas obtenidas se ajustaron a una ecuación de segundo grado, obteniéndose curvas de pérdida de actividad (fatiga), como la representada en la Fig. 73. En éste caso a diferencia de lo ocurrido con L-tirosina, en ausencia de ascorbato las pérdidas de respuesta fueron mucho mayores, lo que se puede observar si se comparan los valores de los coeficientes de primer grado ( —b ) obtenidos en la Tabla 2 1 . También fueron bastante distintos según el criterio de medida empleados. Esta pérdida de respuesta del electrodo debe atribuirse a la pérdida de actividad de la enzima inmovilizada en la membrana. Por ello, cada membrana fué utilizada generalmente para 15 ensayos como máximo, y en todos los casos el valor obtenido se dividió por la actividad relativa correspondiente al número de ensayo. Este valor se calculó según las condiciones de trabajo con los valores de las Tablas 20 y 2 1 . Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -159Tabla 20 Fatiga del electrodo por el número de ensayos para sustrato L-tirosina. Ecuación de la recta ajustada: *x Act Q _ b — m x Act x , respuesta del electrodo en el ensayo número x. Act 0 , respuesta inicial del electrodo. Criterio de L-tirosina ascorbato b m 2,5 0,94 0,015 0,900 1.5 2,5 0,98 0,016 0,737 B 1,0 2,5 0,98 0,017 0,967 B 1,5 2,5 1,06 0,018 0,910 B 1,0 — 1,01 0,013 0.895 medida (mM) (mM) A 1,0 A coeficiente de correlación. E N S A Y O S Fig. 72. Fatiga del electrodo de enzima por el uso con sustrato L-tirosina (1 mM con ascorbato 2,5 mM). Criterio B. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 r Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -160Tabla 21 Fatiga del electrodo de enzima con el número de ensayos para sustrato L-dopa Act Acuación ajustada: x = c — bx H- a x* Act r x, número de ensayo. Act x , actividad en el ensayo x, Act Q actividad inicial. Criterio de L-dopa medida (mM) A 2,5 A 2,5 B (36 seg) 2,5 B (36 seg) 2,5 B (60 seg) 2,5 B (60 seg) 2,5 ascorbato a -10 (mM) 2,5 2,5 2,5 1,13 0,100 41,0 0,93 0,035 3,9 1,08 0,065 9,7 1,02 0,031 -- 1.9 1,01 0,060 5,2 1,00 0,018 -7,5 Fig. 73. Fatiga del electrodo de enzima por el uso con sustrato L-dopa (2,5 mM con ascorbato 2,5 mM). Criterio B. NUMERO DE EXPERIENCIAS Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -16110.8. DEPENDENCIA DE LA RESPUESTA DEL ELECTRODO CON LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO. Como ya se ha mencionado anteriormente, la respuesta del electrodo varió con la concentración de sustrato. Cuantificando la respuesta para cada uno de los criterios de medida sugeridos, se observó que la respuesta fué lineal para cada uno de los sustratos en función de la concentración de éste. Con el criterio basado en la medida del consumo de oxígeno a un tiempo fijo, las medidas fueron más precisas, lo que puede observarse en la Tabla 22, si se comparan los valores de los coeficientes de correlación de las curvas de calibrado, obtenidas en la aplicación de los distinto criterios de medida utilizados. En las Fig 74 y 75 se muestran dos ejemplos de curvas de calibrado del electrodo con el criterio de medida a un tiempo fijo, para los sustratos L-tirosina y L-dopa respectivamente. Tabla 22 Calibrado del electrodo para los distintos criterios de medida de la respuesta. Ensayos con L-tirosina variable ( 0 - 2 , 5 mM) y ascorbato 2,5 mM. Ecuación ajustada: Act = b + Criterio de medida m x b A) Velocidad inicial 1,19 B) Oxi'geno consumido en 36 seg. 9,40 C) Oxígeno consumido al alcanzar el estado estacionario 24,2 r, coeficiente de correlación. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 m 0,599 r 0,949 26,3 0,992 32,0 0,969 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 -162- Fig. 74. Calibrado del electrodo de enzima con sustrato L-tirosina. Ensayos con ascorbato 2,5 mM. Ecuación ajustada: y = 9 , 0 4 + 27,7 (L-tir) (r = 0,990) Fig. 75. Calibrado del electrodo de enzima con sustrato L-dopa. Ensayos con ascorbato 2,5 mM. Ecuación ajustada: y . 0,04 + 44,0 (L-dopa) ( r = 0,991) Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -163- La presencia de ascorbato en el medio de medida, condujo a un consumo de oxigeno mayor que en ausencia del mismo pero que fué debido a una mayor respuesta del blanco. Aparentemente, parece más idóneo trabajar sin ascorbato, ya que la curva de calibrado convergía asi' al centro de coordenadas, (Fig. 76). Sin embargo se propone la realización de los ensayos en presencia de exceso de ascorbato, pues cabe la posibilidad de que en muestras biológicas a las que se le aplicase el método contengan ascorbato u otro agente reductor equivalente, y de no tenerlo en cuenta ¡nterferería en el comportamiento del electrodo de tirosinasa. Otra razón para utilizar ascorbato fué que en la interacción con L-dopa, la fatiga del electrodo fué menor en los ensayos en presencia de ascorbato. Además la precisión de las medidas fué suparior con ascorbato, como lo demuestra los mayores coeficientes de correlación obtenidos o 80 -con ascorbato / o - 40 Fig. 76. Influencia del ascorbato sobre -- /o o la ley de respuesta-concentra- JO • o z o/ x Ecuación ajustada: o ~s O C ción del electrodo de enzima. • sin ascorbato Con ascorbato 5 mM j7 20 c s y = 17,5 + 3 V) Z O Sin ascorbato: - • 1 0,5 y = ...1— 1,0 i 1,5 T I R O S I N A i 2,0 i 2.5 ImMI Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 0,0 + 18,5(L-tirosina) r = 0,993 17,5(L-tirosina) r = 0,985 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -164- 10.9. APLICACIÓN DEL ELECTRODO A LA DETERMINACIÓN DE MUESTRAS DE L-TIROSINA Y L-DOPA. En la Tabla 32 se muestra una aplicación del electrodo de tirosinasa a 4 muestras distintas, 2 de L-tirosina y 2 de L-dopa de concentra- ción conocida. Para cada muestra se empleó una membrana distinta, sobre la cual se hicieron siete ensayos con patrones para calibrar el electrodo, y otros siete ensayos para la determinación de la muestra.. De los resultados obtenidos se ha podido establecer que el electrodo de enzima contrui'do con tirosinasa inmovilizada en membranas de nylon acopladas a un electrodo de oxigeno, permite posibilidades anali'ticas. La sensibilidad del método (0,1 mol en 1 mi de muestra), no es superior a otros métodos analíticos de fenoles, pero permite medidas en muy corto tiempo ( u n ensayo dura un minuto) y con la especificidad propia de la enzima. El inconveniente principal del método, radica en la fatiga del electrodo por la pérdida de actividad de la enzima. Este inconveniente creemos que se podrá superar en un futuro próximo, pues la estabilidad de la enzima inmovilizada en estos soportes fué superior a la observada por su u- so en el electrodo. Por ejemplo, los valores de t - j / - de tubo-IME fueron de 5 — 8 horas y en gel-IME de 8 — 1 3 horas. Asi' en gel-IME, implica que en 10 horas de uso continuo perdi'a el 50 °/o de actividad, por lo tanto 0,08 % por minuto, mientras que en las membranas-IME utilizadas en el electrodo tuvieron pérdidas del 1-2 % por ensayo de 1 minuto. La forma de lavado y tratamien- to del electrodo entre cada ensayo, podn'a ser otra de las causas que alteraron la estabilidad de la enzima. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -165Tabla 23 Aplicación del electrodo de tirosinasa a la determinación de muestras de L-tirosina y L-dopa. Sustrato Concentración añadida (mM) Val or medio medido de 7 ensayos (mM) desviación estándar L-tirosina 0,50 0,50 ± 0,02 L-tirosina 1,00 1,01 ± 0,04 L-tiros¡na 1,50 1,47 0,05 L-tirosina 2,00 1,95 ± ± L-dopa 0,30 0,29 ± 0,03 L-dopa 0,60 0,62 0,05 L-dopa 1,00 0,93 L-dopa 1,50 1,55 ± ± ± Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 0,05 0,05 0,06 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 11. CONCLUSIONES. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -16711. CONCLUSIONES. 1. Se han analizado las propiedades generales de la actividad tirosina hidroxilasa de la tirosinasa inmovilizada por unión covalente a soportes modificados de poliacrilamida, de vidrio poroso y de nylon, bajo distintas formas fi'sicas y reactores. Se ha aplicado a la síntesis bioenzimática de L-dopa y a la determinación analítica de L-tirosina y L-dopa mediante un electrodo de enzima. 2. En general, la inmovilización produjo derivados de la enzima con una mayor actividad específica tirosina hidroxilasa que la enzima soluble, al contrario de lo que se había obtenido anteriormente con la actividad dopa oxidasa. Estas diferencias, junto a lo establecido, en base a la extracción y purificación, de que ambas actividades se manifestaron por la misma proteína, sugirieron que los centros activos para L-tirosina y L-dopa actúan en la misma proteína, pero con un comportamiento catalítico independiente. 3. La protirosinasa se activó parcialmente por la inmovilización, dando aproximadamente un 30 °/ 0 de la actividad de la proenzima soluble activada con tripsina-sepharosa, y después de un tiempo de interacción con el sustrato alcanzó el mismo grado de activación que la proenzima inmovilizada tratada con tripsina. Esta activación se produce como consecuencia de cambios conformacionales provocados por la unión al soporte. 4. El estudio sistemático del comportamiento de la tirosinasa frente a los distintos métodos de inmovilización ha permitido encontrar sistemas de alta eficacia de acoplamiento y proporcionando rendimientos de inmovilización que en algunos casos fueron del orden del 100 % . Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -168La actividad manifestada por los derivados inmovilizados se vio notablemente afectada por las características del tipo de reactor utilizado y de la porosidad del soporte. En reactores de columna empaquetada manifestaron en general menor actividad que la observada en reactores de baño agitado, como consecuencia de las mayores limitaciones difusionales y de suministro de oxi'geno que se dan en el reactor de columna. La inmovilización a los soportes estudiados aumentó notablemente la estabilidad de la tirosinasa, tanto al almacenamiento como a su utilización durante largo tiempo, con respecto a la enzima soluble. La estabilidad dependió de la forma de enzima, del tipo de soporte, y muy notablemente del tipo de reactor y de las condiciones de trabajo de éste. Se obtuvo una mayor estabilidad en reactores continuos de columna empaquetada que en los reactores de baño, llegándose a obtener en algunos casos tiempos de semiinactivación próximos a 20 horas, lo que representó una estabilización de unas 30 veces superior que la actuación de la enzima soluble en presencia de ascorbato y de unas 250 veces en ausencia de éste. Este aumento de la estabilidad, junto con lo; altos rendimientos de inmovilización abrieron el camino para aplicaciones industriales de la tirosinasa inmovilizada. En general, el tipo de reactor y las condiciones de trabajo aplicadas al mismo influyeron en el sentido de que las condiciones que favorecieron un aumento de la actividad manifestada por el derivado inmovilizado, aumentaron la producción de L-dopa a lo largo de la vida de uso del reactor, pero disminuyeron la estabilidad del derivado inmovilizado cuando se midió por los valores de tiempo de semünactivación. Esto demostró que la probabilidad de inactivación, dependió no sólo del tiempo de uso, sino que además, en gran, medida de pendió del número de veces que su centro activo es utilizado en ciclos catalíticos. Esto apoyó la hipótesis de que la reacción de inactivación parte de un intermediario del ciclo catalítico. Por otro lado, el aumento de la estabilidad por inmovilización sugirió que el proceso de inactivación puede implicar cambios conformacionales ó del es- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -169tado de agregación y que son parcialmente impedidos por la unión al soporte sólido. 8. Se han aplicado los derivados de tirosinasa inmovilizada a la si'ntesis de L-dopa en los distintos tipos de reactores. Se han analizado los resultados obtenidos en base a curvas de Producción-Conversión, que permitieron la comparación de la capacidad de producción de L-dopa, utilizando como criterio de comparabilidad de los distintos reactores y de los distintos derivados inmovilizados, la igualdad de una parámetro p asignado al reactor y definido por las unidades de actividad estándar utilizadas por litro de disolución procesada durante la vida de uso del reactor. Para un mismo derivado y con reactores con el mismo valor del parámetro p del reactor, se obtuvo mayor producción en todos los casos, empleando el reactor de baño agitado. La mayor producción en este tipo de reactor, a pesar de que en él la enzima inmovilizada tenía menos estabilidad al uso, estuvo asociada a la mayor actividad manifestada en este tipo de reactor. 9. Un electrodo de enzima construido con tirosinasa inmovilizada en membranas de nylon, acopladas a un electrodo de oxígeno tipo Clark, ofrece posibilidades analíticas para la determinación de los sustratos de la enzima, por un método sencillo y rápido, y con la especificidad propia de la enzima, pero con el inconveniente de una fatiga del electrodo por su utilización, Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 12. MÉTODOS EXPERIMENTALES Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -170- 12. 12.1. MÉTODOS EXPERIMENTALES. OBTENCIÓN DE E N Z I M A . Como fuente de enzima se empleó epidermis de Rana esca- lenta ridibunda, obtenida de suministradores locales durante los meses de Octu- bre a Marzo, que es el periodo durante el cual manifestaron mayor actividad (Galindo, 1976). 12.1.1. EXTRACCIÓN DE PROTIROSINASA. Para la extracción de la tirosinasa bajo la forma de proenzima, se utilizó el mismo procedimiento que ha sido empleado anteriormente en el Departamento por Cortés (1978) y Manjón (1978). Las pieles de rana se maceraron con BrK 2 M en cámara fn'a a 5 °C durante 24 horas, después de lo cual las epidermis se separaron de la dermis por simple raspado. Las epidermis se lavaron varias veces con agua destilada hasta eliminación de bromuros; se liofiiizaron en un liofilizador TelstarCriolab y se almacenaron a —30°C en ambiente seco hasta su uso. La extracción de la protirosinasa se llevó a cabo por el siguiente procedimiento estándar: se homogenizaron 600 mg de epidermis liofilizada con 30 mi de agua bidestilada en un homogenizador Potter con émbolo de vidrio. El homogenado se centrifugó a 18.000xg durante 30 minutos en centrífuga angular Sorvall con cabezal SS-1. El sobrenadante sk decantó y desechó. El sedimento se volvió a homogenizar con 30 mi de tampón fosfato 0,1 M pH=7,0, y se centrifugó de nuevo a la misma velocidad, recogiéndose el sobrenadante como fuente de proenzima. El extracto obtenido por este procedimiense etiquetó como extracto estándar H 2 0/P¡, y el obtenido suprimiendo el tratamiento previo con agua, como extracto Pj. Todo el proceso de extracción se llevó a cabo en cámara fría a 5 o C. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -171- 12.1.2. PURIFICACIÓN DE PROTIROSINASA. La purificación de la protirosinasa se llevó a cabo en dos etapas consecutivas: 1) Interacción por intercambio iónico con CM-Sephadex G50 2) Cromatografía de afinidad hidrofóbica con Phenyl-Sepharosa CL-4B. Para ello se aplicó el siguiente procedimiento: Se pesaron 0,5 g de CM-Sephadex y se hincharon con agua destilada durante 1 hora en baño maría; se filtró en una placa de vidrio poroso (porosidad 4) y se equilibró con tampón fosfato 0,05 M pH 7,0. Cien mi de extracto de proenzima, obtenido por el método descrito anteriormente, se diluyeron al doble de volumen con agua destilada, para que la concentración en tanpón fosfato fuese 0,05 M. A continuación se adicionaron al CM-Sephadex y se mantuvo la interacción gel-enzima durante 30 minutos con agitación suave, A l cabo de este tiempo se filtró en placa porosa y el filtrado se desechó. La elución de la proenzima se realizó en la misma placa porosa por adición de 10 mi de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 con suave agitación con varilla de vidrio, los cuales se succionaron después de 10 minutos por medio de vaci'o. Se repitió esta operación cuatro veces más, recogiéndose 50 mi de disolución de proenzima purificada por CM-Sephadex, con rendimiento del 60/o y un factor de purificación de 4-5 veces el extracto original. Estos 50 mi de extracto de proenzima que habían sido purificados con CM-Sephadex, se adsorbieron en una columna (9 mm $) empaquetada con 3 mi de Phenyl-Sepharosa, previamente embebidos en tampón fosfato 0,5 M, a una velocidad de flujo de 12 ml/h. Previamente, a la disolución de proenzima se le añadió la cantidad de fosfato monosódico y disódico sólidos necesarios para dar una concentración final de 0,5 M. A continuación se lavó el gel con la proteína adsorbida con 10 mi de tampón fosfato 0,5 M, pH 7,0. La proenzima se eluyó de la columna con 25 mi de tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0. El rendimiento de esta etapa fué del 8 0 % con un factor de purificación de 2-3. Una muestra de proenzima así purificada, se sometió a caracterización analítica de su pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida y se Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -172- etiquetó como protirosinasa purificada CM/Phe. 12.1.3. ACTIVACIÓN DE LA PROTIROSINASA. Para la conversión de protirosinasa a tirosinasa activa se utilizó la activación que provoca la enzima tripsina, según procedimientos descritos por Iborra et al.(1976). La activación se llevó a cabo, en cada caso, por uno de los dos métodos siguientes: a)Activación con tripsina soluble. Este procedimiento se empleó solamente en la activación de pequeñas cantidades de disolución de proenzima para la medición de su actividad enzimática. Para ello, a 0,1 mi de disolución de proenzima se añadieron 0,01 mi de disolución de tripsina ( 1 mg/ml) y se incubaron a 37°C durante 5 min.. La enzima se utilizó inmediatamente después. b)Activación con tripsina inmovilizada. Este método se utilizó cuando fué necesario disponer de grandes cantidades de tirosinasa, sin que estuviera contaminada por la enzima proteolítica. Para conseguir la activación, se inmovilizó previamente la tripsina en Sepharosa activada con BrCN, según el procedimiento descrito por Axen y Ernback (1971). Un gramo de tripsina-Sepharosa, se colocó en una columna de 9 mm de diámetro, se lavó con tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 y a través de ella se pasó disolución de proenzima a una velocidad de flujo de 20 ml/h, a temperatura ambiente. Una vez elui'da de la columna, la enzima activa mostró iguales niveles de actividad que la alcanzada por la activación con tripsina soluble y pudo conservarse durante 1-2 semanas sin pérdida apreciable de actividad. 12.1.4. CRITERIO DE HOMOGENEIDAD. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA A pH 4,3. Para determinar el grado de purificación de las disoluciones de tirosinasa y para comprobar la identidad de la proteiha con actividad dopa Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -173- oxidasa con la de actividad tirosina hidroxilasa, se utilizó como criterio la electroforésis de disco en geles de poliacrilamida, de tipo catiónica a pH 4,3. Se utilizó para ello el equipo de la firma Buchier Inst.Co. de electroforésis anali'tica con fuente estabilizada. Se emplearon geles con grados de reticulación de 5% de bisacrilamida, cuyo límite máximo de separación de proteínas era de unos 500.000 dalton (Shuster, 1971). Los geles separadores de poliacrilamida, de 6 cm de longitud se formaron por copolimerización de acrilamida y bisacrilamida en presencia de riboflavina y persulfato amónico como catalizadores. Se procedió a realizar la electroforésis conectando la fuente de alimentación a los terminales. Se aplicó corriente de 1 mA por tubo durante 10 min. y a continuación 2 mA por tubo hasta que el indicador visual llegó al extremo inferior ( polo negativo ). Una vez concluida la electroforésis, unos geles se fijaron y tiñeron durante 5 horas con disolución de azul Comassie R 250 ( 1,25 g en 500 mi de agua conteniendo 227 mi de metanol y 46 mi de ácido acético). Después los geles se destiñeron electroforéticamente en una disolución de 50 mi de metanol y 75 mi de ácido acético glacial por litro. Lina vez desteñidos se conservaron en la misma disolución de destinción y se procedió a realizar densitogramas por lectura de absorbancia a 685 nm en un densitómetro Transdyne Por otro lado y simultáneamente otros geles se tiñeron con una disolución de L-dopa ( 2 mg/ml) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, conteniendo tripsina (0,1 mg/ml), para visualizar la proteína con actividad dopa oxidasa (Pomerantz, 1963 ; Ferragut, 1980). No se añadió tripsina cuando la muestra sometida a electroforésis había sido previamente activada por su paso a través de la columna de tripsina inmovilizada. También se tiñeron geles con L-t¡rosina (2mM), en las mismas condiciones que la tinción con L-dopa, para detectar la banda de proteína con actividad tirosina hidroxilasa. Así pues, la comparación de los geles teñidos con los tres procedimientos indicados permitió identificar las bandas de proteína con la tinción con azul Comassie y su correspondencia con las bandas que poseyeron actividad tirosina hidroxilasa y/o dopa oxidasa. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -174- 12.2. PREPARACIÓN DE SOPORTES. 12.2.1. ENZACRYL-AA Y CPG-AA. El Enzacryl-AA, soporte de poliacrilamida, modificado con grupos reactivos arilamina fué suministrado por Koch-Light Lab. (England), en estado liofilizado. El soporte CPG-AA es de vidrio de poro controlado, recu- bierto con óxido de circonio y modificado también con grupos funcionales arilamina, preparado por la firma Corning y que fué suministrado por Pierce Chem. Co. (USA). 12.2.2. PREPARACIÓN DE POLVO DE NYLON. Para la preparación de los distintos soportes a partir de polvo de nylon, se partió de nylon-6 comercial en forma de granza, proporcionado gentilmente por BASF ESPAÑOLA S.A.. Para la preparación del polvo de nylon se utilizó el procedimiento descrito por Hornby y Goldstein (1976). Para ello , se suspendieron 15 g de nylon-6 comercial en 500 mi de una disolución de cloruro calcico anhidro al 2 0 % en metanol; se agitó a temperatura ambiente hasta que se obtuvo una disolución homogénea muy viscosa. La disolución de nylon se adicionó gota a gota a un gran volumen de agua en fuerte agitación. El gel así precipitado se separó por filtración en placa porosa ( porosidad 3). Se lavó y se resuspendió dos veces con agua y por último se volvió a lavar con etanol y éter, y después se secó con corriente de aire. El polvo seco se trituró en mortero y se conservó en desecador conteniendo pentóxido de fosforo. 12.2.3. MODIFICACIÓN DE MEMBRANA Y TUBO DE N Y L O N . Para la preparación de membranas se utilizaron mallas de 10 mieras de tamaño de poro ( NY-10 HD Super) suministrada por ZBF (Switzerland). El tubo de nylon-6, de 1 mm de diámetro interno, se obtuvo de la fir- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -175- ma Portex (U.K.), en grado estándar. Para hinchar y hacer amorfa la superficie de las membranas y del interior de los tubos de nylon, se trataron con una mezcla de cloruro calcico al 18,6 % y agua al 18,6 % en metanol, a 40 °C, durante 30 minutos ( Daka y Laidler, 1978). Se lavó después con agua durante 20 minutos. El nylon amorfo obtenido se empleó inmediatamente en los tratamientos o modificaciones posteriores. 12.2.4. PREPARACIÓN DE NYLON A L Q U I L A M I N A (NAQA). Se realizó según el método descrito por Hornby y Goldstein (1974). Se suspendieron 100 mg de polvo de nylon con 2 0 mi de N,N-dimetilmetilendiamina en baño termostatizado a 70 °C durante 12 horas. Se filtró y lavó con agua destilada eb frío ( 5 °C). Se almacenó suspendido en agua a 5 °C. 12.2.5. PREPARACIÓN DE NYLON PARCIALMENTE HIDROLIZADO (NH). El gel de nylon parcialmente hidrolizado se preparó por el método descrito por Goldstein et al. (1974b),modificado ligeramente por nosotros: 3 g de polvo de nylon, obtenido por el método 12.2.2, se suspendieron en 90 mi de CIH 4 M y se dejó agitando durante un di'a en agitador mecáríictr de vaivén a temperatura ambiente. A l cabo de dicho tiempo, se filtró a través de placa porosa (porosidad 4) y se lavó con agua destilada y sucesivas porciones de etanol y éter. Después se pasó durante 15 minutos aire seco para eliminar el éter, y se almacenó en un desecador con pentóxido de fósforo. En el caso de utilizar membrana de nylon, aproximadamente unos 80 cm 2 de membrana con su superficie amorfa, se introdujeron en un matraz de 50 mi. Se le añadieron 45 mi de CIH 4 M, sometiéndose a continuación al mismo procedimiento descrito para el gel de nylon, salvo que los lavados se hicieron por decantación. Cuándo se empleó tubo de nylon, un metro de tubo con Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -176- su superficie amorfa, se introdujo en un baño a 40 ° C , y se le reciclaron, por medio de una bomba peristáltica, 50 mi de CIH 4 M a 40 ° C durante 3 horas y a un flujo de 20 ml/h. La hidrólisis se detuvo por lavado con agua destilada, etanol y éter. Se guardó en desecador hasta su utilización. 12.2.6. PREPARACIÓN DE NYLON-BENCIDINA (NB) NH (200 mg de gel, 50 cm de tubo ó 40 cm 2 de membrana), preparado por el método 12.2.5, se trató durante 4 horas a 10 °C con 50 mi de cloruro de metileno, 50 mi de bencidina y diciclohexilcarbodiimida al 0,5 % cada una de ellas en cloruro de metileno. Se lavó con 50 mi de cloruro de metileno, 50 mi de acetona y finalmente con 50 mi de agua destilada y se utilizó inmediatamente después de su preparación.(Daka y Laidler, 1978). 12.2.7. PREPARACIÓN DE NYLON POLIISONITRILO (NPI) Gel de NPI se preparó según el método descrito por Goldstein et al. (1974b). En un matraz de 100 mi se suspendió 1 g de NH en 40 mi de isopropanol, se adicionaron 10 mi de acetaldehido y 4 mi de 1,6-diisocianohexano, sintetizado como se describe posteriormente, y se dejó agitando a temperatura ambiente durante 24 horas. Se filtró en placa porosa ( por. 4) y se lavó en pequeñas porciones con 25 mi de isopropanol, 100 mi de éter y se secó con aire seco.Para su conservación se guardó en un desecador con pentóxido de fósforo a 5 °C en la oscuridad. La si'ntesis de 1,6-diisocianohexano se llevó a cabo según Goldstein et al. (1974a). Se disolvieron 60 g de 1,5-diaminohexano en 170 mi de formiato de etilo por agitación sobre baño de hielo. Después de la completa disolución y formación de un precipitado blanco, se le añadieron 50 mi más de formiato de etilo. El compuesto insoluble formado, N,N-diformil,l,6-diaminohexano, se separó por decantación y se secó en rotavapor. El punto de fusión del sólido fué de 105 ° C . A una disolución de 150 g de cloruro de Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -177- p-tolueno sulfonilo en 300 mi de piridina secada con KOH, se le añadieron 30 g de N,N-diformil,l,6-diaminohexano, en pequeñas porciones y con agitación. Una vez disuelto este compuesto y que el medio adquiriera un color oscuro, se siguió agitando durante 2 horas a temperatura ambiente. A l cabo de este tiempo, se añadieron 250 mi de agua y hielo picado para bajar la temperatura. El 1,6-diisocianohexano formado, se extrajo con tres porciones de 150 mi de éter, el extracto etéreo se lavó tres veces con 250 mi de agua, se secó con sulfato sódico anhidro y el éter se evaporó en evaporador rotatorio Buchi. El aceite crudo obtenido se destiló a vacío a presión inferior a 0,3 mm Hg y temperatura de 90 °C. Se guardó en viales cerrados a —30 °C. 12.2.8. PREPARACIÓN DE NYLON P O L I A R I L A M I N A (NPAA). El NPAA se preparó a partir del NPI por el método de Goldstein et al. (1976). Se suspendieron 0,5 g de NPI en 50 mi de metanol conteniendo 0,5 g de p,p<J¡aminofen¡lmetano y 0,15 mi de isobutiral. Después se añadieron 0,5 mi de ácido acético glacial y se dejó durante 24 horas con agitación a temperatura ambiente. El NPAA obtenido se separó por filtración en placa porosa y se lavó con metanol y éter en pequeñas porciones, y se secó durante 15 minutos con aire seco. El NPAA se guardó en un desecador con pentóxido de fósforo a 5 °C. 12.3. INMOVILIZACIÓN DE TIROSINASA. 12.3.1. INMOVILIZACIÓN A SOPORTES CON GRUPOS A R I L A M I N A ACTIVADOS CON ACIDO NITROSO. Este método de unión se aplicó para la inmovilización de tirosinasa a los soportes Enzacryl-AA, CPG-AA, NPAA y NB, en forma de gel. Con Enzacryl-AA también se acopló protirosinasa. El procedimiento que se si-., guió para la unión ciones, por activación con ácido nitroso, fué, con ligeras modifica- el especificado por las casas suministradoras para el Enzacryl-AA y el Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -178- descrito por Hornby y Goldstein(1976) para el soporte NPAA.Cuando se emplearon cantidades de gel menores de 100 mg para inmovilización, el tratamiento con los distintos reactivos de acoplamiento se realizó por técnica de columna de 0=0,9 mm, por reciclaje de los reactivos a través de la columna a una velocidad de flujo de 30 ml/h. Cuando las cantidades de gel fueron de 100 mg, activación y acoplamiento se realizaron por técnica de baño con suave agitación y se eliminaron los reactivos por filtración a vacío en placa de vidrio poroso (por. 4). Todas las operaciones se realizaron en cámara fn'a a 3-5 °C. El tratamiento fué el siguiente: 100 mg de gel se suspendieron en CIH 2M, después se trataron con una mezcla de 10 mi durante 1 hora. El derivado del de CIH 2 M y 4 mi de N 0 2 N a al 4 % soporte diazotado se lavó con 10 mi de tam- pón fosfato 0,1 M pH 7,0, después de lo cual se trató durante 48 horas con disolución de proenzima o enzima en el mismo tampón conteniendo, según el el experimento, de 5 a 10 U de actividad tirosina hidroxilasa, lo que correspondía a 1-50 mg de proteína, según el estado de purificación. El derivado de enzima o proenzima inmovilizada se lavó con tampón fosfato 0,5 M pH 7,0, a temperatura ambiente, después con fosfato 0,1 M pH 7,0 y finalmente con agua destilada. Los derivados de enzima inmovilizada se etiquetaron como Enzacryl-AA-IME, CPG-AA-IME, NPAA-IME y NB-nitroso-IME. 12.3.2 INMOVILIZACIÓN A SOPORTES CON GRUPOS A L Q U I L A M I N A Y/O A R I L A M I N A ACTIVADOS CON GLUTARALDEHIDO. Se inmovilizó tirosinasa en los derivados NH, NAQA y NB por activación con glutaraldehido por el siguiente procedimiento: Se trataron 100 mg de gel ó 40 cm] de membrana con 30 mi de disolución de glutaraldehido al 12,5 % en tampón borato 0,2 M pH 8,5. La suspensión se dejó agitando durante 1 hora a temperatura ambiente. Después el gel se filtró en placa porosa y la membrana o el gel se lavaron con tampón fosfato 0.1M pH 7,0 Posteriormente se les adicionó una disolución de enzima purificada CM/Phe (5-50 mU de enzima por mg de gel o cm 2 de membrana). Se dejó agitando Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -179- suavemente durante 24 horas en cámara fn'a (5°C). El derivado inmovilizado se separó de la disolución por filtración o decantación y se lavó con tampón fosfato 0,1M pH 7,0. El gel-IME se almacenó suspendido en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 a 5°C o se liofilizó y almacenó a —30°C, mientras que las membranas-I ME se almacenaron en el tampón fosfato a 5°C. Para la inmovilización sobre tubo de nylon se siguió el mismo procedimiento que con geles, salvo que el tratamiento con giutaraldehido y enzima se realizó por reciclaje de de los reactivos a través del tubo a una velocidad de flujo de 2 0 m l / h ; se unieron 5-50 mU de enzima por cm lineal de tubo, y el tubo-IME se almacenó a 5°C lleno de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Los derivados obtenidos se denominaron como NAQA-IME, NH-IME y NB-glut-IME. 12.3.3. INMOVILIZACIÓN SOBRE NPI ACTIVADO CON ACETALDEHIDO. Se inmovilizó enzima sobre gel de NPI por acoplamiento de ambos con acetaldehido en presencia o ausencia de acetato, por el procedimiento descrito por Hornby y Goldstein (1976). Para la unión de la proteína en presencia de acetato, se suspendieron 100 mg de gel de NPI en 10 mi de una disolución de fosfato sódico y acetato sódico 0,5 M de pH 7,0; se añadieron 25 mi de disolución de enzima ( 50 mU/mg de gel) y 0,5 mi de acetaldehido y se dejaron agitando durante 24 horas, después de lo cual se filtró y se lavó con agua destilada. El derivado obtenido se etiquetó como NPI-acético-IME y se almacenó suspendido en agua destilada a 5°C. Todas las operaciones se realizaron en cámara fría (0-5°C) Para el tratamiento en ausencia de acetato, se suprimió la adición de los 10 mi de disolución: fosfato-acetato y se aumentó el volumen de acetaldehido a 2 mi. En este caso el derivado se denominó NPI-IME. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -180- 12.4. DETERMINACIÓN DE PROTEINA. Para la determinación de proteína se utilizó una modificación del método de Lowry propuesta por Hartree (1972). El procedimiento fué el siguiente: A 1 mi de disolución, conteniendo 5-120 g de proteína, se le adicionaron 0,9 mi de disolución A, y la disolución resultante se calentó durante 10 minutos en un baño a 50 °C. Posteriormente se enfrió a temperatura ambiente y se añadieron 0,1 mi de disolución B y se agitó. Después de 10 minutos a temperatura ambiente se añadieron 3 mi de disolución C, se agitó, se mantuvo durante 10 minutos a temperatura de 50 °C, luego se enfrió a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 650 nm en un espectrofotómetro Hitachi 100-60 frente a un blanco exento de proteína. Se determinó la concentración de proteína comparando con una curva de calibrado construida empleando albúmina de suero bovino como proteína patrón. Disolución A: 2 g de tartrato sódico potásico y 100 g de carbonato sódico disueltos en 500 mi de NaOH 1 M y llevados a 1 litro con agua bidestilada.Disolución B: 2 g de tartrato sódico potásico y 1 g de sulfato de cobre disuelto en 90 mi de agua bidestilada y 10 mi de NaOH 0,1 M.Disolución C: Un volumen de reactivo de Folin-Ciocalteu por cada 15 volúmenes de agua bidestilada; se prepara inmediatamente antes de usarla. La cantidad de proteína unida en cada uno de los derivados inmovilizados obtenidos, se determinó por diferencia entre la cantidad de proteína en las disoluciones antes y después de la reacción de acoplamiento. 12.5. DETERMINACIÓN DE ASCORBATO. Muchas de las experiencias que se realizaron ocurrían con un consumo de ascorbato a lo largo del tiempo de reacción. La variación de la concentración de ascorbato con el tiempo se estudió, de forma directa midiendo la absorbancia a 265 nm, longitud de onda a la que el ascorbato pre- Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -181- senta un máximo de absorción y a la que no interfiere el cambio espectral provocado por la conversión de L-tirosina a L-dopa en las reacciones enzimáticas de la tirosinasa. Se calibró el método con patrones que contenían L-tirosina 2 mM en tampón fosfato 0,1 M pH 7,0 y añadiendo ascorbato inmediatamente antes de medirse, a partir de una disolución concentrada (1 mM), prepar rada dentro del mismo di'a. En estas condiciones la curva de calibrado dio: Ascorbato(mM)=0,116-Ab 2 65 — 0,001 , siendo lineal hasta valores de 1,5 unidades de absorbancia. 12.6. DETERMINACIÓN DE OXIGENO DISUELTO. La determinación del oxígeno consumido en las reacciones catalizadas por tirosinasa soluble e inmovilizada, se llevóa cabo polaro- gráficamente mediante un oxígrafo de la firma Yellow Sprig modelo YSI-53, con electrodo de Clark y dotado de células termostatizadas con baño de precisión de 0,01°C. Para el ensayo estándar, 5 mi de disolución de tirosina o dopa, de concentración especificada en cada experimento, se adicionaron a una de las células del oxígrafo, provistas de un agitador magnético. Se burbujeó aire en la disolución para alcanzar la saturación, lo que correspondió a una concentración de oxígeno de 0,26 mM (Yamaguchi et al., 1969) en tampón fosfato 0,1 M pH=7,0. A continuación se añadieron 0,2 mi de disolución de enzima ó 4 mg de derivado inmovilizado. Inmediatamente se introdujo el electrodo y se registró la desaparición de oxígeno con el tiempo de reacción. 12.7 DETERMINACIÓN DE L-DOPA. Se enSpleó el método descrito por Arnow(1937) modificado por nosotros. Se basó en la formación de un derivado diazotado de la L-dopa, que en medio ácido da un color amarillo estable que puede medirse colorimétricamente a 460 nm. En el método original de Arnow, el complejo formado tomaba una coloración roja por adición de NaOH, midiéndose la absorbancia a 495 nm. Pero aunque de esta forma la sensibilidad era mayor, el color fué Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -182- muy inestable, lo que ocasionaba una gran imprecisión en el método. El procedimiento aplicado fué el siguiente:A 1 mi de disoluque contenía L-dopa (0,005—1,5 mM) se le añadió 1 mi de CIH 0,5 M. A continuación se trató con 1 mi de una disolución formada por N 0 2 N a al 15% y Mo0 4 Na al 15 % ; se agitó intensamente con un agitador de tubos Mixotub- Gricel, dejándose en reposo durante 5-15 minutos. La agitación intensa fué necesaria cuando las medidas se realizaban en presencia de ascorbato (Letts y Chance, 1974). Si en el medio existía material insoluble, como partículas de gel-IME, la disolución resultante se filtró a través de un filtro tipo jeringuilla con papel Wattman n°3. Se leyó la absorbancia de la disolución frente a un blanco, exento de L-dopa, a 460 nm. El método dio una linealidad de absorbancia para una concentración de L-dopa en el rango de 0,002—0,8 mM ( E = l,22-10" 3 mor l cm" 1 ); para concentraciones de 0,8—1,5 mM la curva de calibrado se ajustó a una ecuación de segundo grado.Midiendo a 420 nm el método fué algo más sensible (E=l,85-10" 3 mol"'''cm" 1 ), pero disminuyó el intervalo de concentraciones en que la respuesta fué lineal ( 0,002-0,4 mM). Dado que en nuestro caso se manejaron normalmente concentraciones elevadas de L-dopa (0,1— 1,0 mM), se prefirió la medida a 460 nm, tal como se ha descrito. 12.8 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. 12.8.1. A C T I V I D A D TIROSINA HIDROXILASA DE LA PROTEINA SOLUBLE La determinación de actividad se basó en la medida de la L-dopa formada en un tiempo determinado de reacción, utilizando L-tirosina como sustrato. Para evitar la oxidación de la L-dopa a la forma de quinona por efecto de la actividad d opa oxida sa de la misma enzima,'se adicionó al medio de reacción ascorbato sódico. El procedimiento fué el siguiente: Se colocó en un tubo de ensayo, 0,2 mi de disolución de enzima, previamente activada con tripsina según el método descrito en 12.1.3. Se añadió 1 mi de disolución de sustrato ( L-tirosina 2,5 m M ; ascorbato 2,5 mM; en tampón fosfato 0,1 M a pH=7,0) y se dejó reaccionar durante 10 minutos a 25 °C, después de lo cual se detuvo la reacción por adición de 1 mi de CIH 0,5 M y se midió la Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -183- L-dopa formada por el método colorimétrico descrito en 12.7. Se comprobó que en las condiciones descritas, la velocidad de reacción se mantuvo constante, en el intervalo de tiempo empleado y que no existió el periodo de retardo carasten'stico de la actividad tirosina hidroxilasa (Pomerantz, 1966; García Carmona, 1980). 12.8.2. A C T I V I D A D TIROSINA HIDROXILASA DE TIROSINASA INMOVILI- ZADA. Para medir la actividad de la enzima inmovilizada en geles, a 10 mg de gel-IME liofilizado, o su equivalente húmedo, se adicionaron 5 mi de disolución sustrato (L-tirosina 2,5 mM y ascorbato2,5 mM en tampón fosfato 0,1 M pH=7,0). Se mantuvo agitando en un agitador mecánico de vaivén durante 30 minutos. A los 15 y 30 minutos respectivamente, se tomaron alícuotas de 1 mi y se añadieron en tubos de ensayo que contenían 1 mi de CIH 0,5 M y se determinó la concentración de L-dopa por el método descrito en 12.7. Si la enzima estaba inmovilizada en membranas, el ensayo de actividad consistía en adicionar 1 cm 2 de membrana-1 ME a cada uno de des tubos, conteniendo 1 mi de disolución sustrato. A los 15 minutos en el primer tubo y a los 30 en el segundo, se adicionó 1 mi de CIH 0,5 M y a continuación se determinó la concentración de L-dopa formada. En el caso de enzima inmovilizada en la superficie interna de tubo de nylon, se recicló 1 mi de disolución sustrato, a una velocidad de flujo de 1 ml/min, a través de 2 cm de tubo-IME, durante 15 minutos. A continuación se añadió 1 mi de CIH 0,5 M y se midió la concentración de L-dopa formada. Con otros 2 cm de tubo-IME se repitió el ensayo para 30 minutos de tiempo de reacción. Los métodos anteriormente descritos se consideraron como métodos estándar de medida de la actividad de enzima inmovilizada (Act|(yj^). Para el estudio de la actividad manifestada por I ME en reactores funcionando durante largo tiempo (Actp), se empleó siempre como criterio la determinación de L-dopa formada en la disolución producto de reacción. Así, en reactores de Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -184- baño discontinuo, se tomaron alícuotas de 1 mi a distintos tiempos a lo largo de la vida de uso del reactor y se determinó la concentración de L-dopa en las alícuotas. En el caso de reactores de flujo continuo, el producto de reacción se recogió en una serie de fracciones tomadas a un tiempo definido y durante 1 hora por fracción, determinándose posferiormente la concentración de L-dopa en cada una de ellas. En todos los casos, se definió la unidad de actividad (U), como se ha realizado para la enzima soluble. La actividad de los derivados inmovilizados se expresó en mU/mg de gel para los geles-IME, en mU/cm 2 para las membranas-IME y en mU/cm lineal de tubo para los tubos-IME. 12.8.3. A C T I V I D A D DOPA OXIDASA DE TIROSINASA La determinación de la actividad dopa oxidasa de tirosinasa se basó en la medida espectrofotométrica directa, a 475 nm, del dopacromo formado como producto de la oxidación de la L-dopa. Para ello a 0,1 mi de disolución de tirosin'asa, previamente activada (método 12.1.3), se añadieron 2,9 mi de disolución saturada de L-dopa (2 mg/ml) en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0, y se siguió la formación de dopacromo a 475 nm.(E=3,7-10 3 mor , cm" l > Waite, 1976). La unidad de actividad dopa oxidasa se definió como la cantidad de enzima que catalizó la formación de 1 micromol de dopacromo por minuto a 25 °C y pH 7,0 (Fling et al. 1963) y en términos de velocidad inicial. 12.8.4. DETERMINACIONES CON EL ELECTRODO DE TIROSINASA INMOVILIZADA Para la preparación del electrodo de enzima, se inmovilizaron 50 m i l de tirosinasa purificada por cm 2 de membrana modificada como NB-glut-IME, según método descrito en 12.2..6 y 12.3.2. y se conservó en frigorífico (5 o ) suspendida en tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0. Mediante una arandela de goma, la membrana-IME junte con una membrana de teflón^ se fijaron a un electrodo de oxígeno tipo Clark. Para realizar un ensayo de respuesta del electrodo frente a Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert Volver al índice/Tornar a l'índex -185- una disolución de un sustrato de la enzima se siguió el procedimiento siguiente: 2 mi de tampón fosfato 0,1 M a pH 7,0, saturados de aire por burbujeo, se colocaron en la cubeta de ensayos del oxigrafo, se introdujo en electrodo de enzima y se ajustó el 100 % del aparato manteniendo la disolución agitada con agitador magnético. A continuación, se sustituyó la disolución de tampón por 2 mi de la disolución conteniendo sustrato en una determinada concentración e igualmente saturada de aire, se introdujo de nuevo el electrodo de enzima y se registró el porcentaje de oxi'geno consumido, en función del tiempo. Finalizado el ensayo, el electrodo se lavó con agua destilada y se equilibró de nuevo con tampón saturado de aire durante 5 minutos. Todos los ensayos se realizaron a 25°C. Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert 13. BIBLIOGRAFÍA Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1980 Actividad tirosina hidroxilasa de tirosinasa inmovilizada. Propiedades y aplicaciones. Eugenio Vilanova Gisbert -187- 13. BIBLIOGRAFÍA. ABELES; R.H. y MAYCOCK, A . L . (1976). Suicide Enzymes Inactivators. Acc. Chem. Res. 9, 313-319. ABRAMOWITZ, J. y C H A V I N , W. (1978). Comparison of Tyrosinase Activity in the Integument of Xanthic and Albino Goldsfish, Carássius auratus. Comp. Biochem. Physiol. 60 B, 81-85. ARNOW, L.E. (1937a). Colorimetric Determination of the Components Of 3,4-D¡hidroxyphenylalanine-Tyrosine Mixture. / . Biol. Chem. 118, 531-533. ARNOW, L.E. (1937b). The Formation of Dopa by the Exposure of Tyrosine Solutions to Ultraviolete Radiation. J. Biol. Chem. 120, 151-153. 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