Redalyc.Unión a proteínas plasmáticas de la DL-3-hidroxi-3-etil

Journal of the Mexican Chemical Society
ISSN: 1870-249X
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Sociedad Química de México
México
García, Luis J.; Medina, Liz J.; Jung, Helgi
Unión a proteínas plasmáticas de la DL-3-hidroxi-3-etil-3-fenil-propionamida (HEPP). Un nuevo
anticonvulsivante
Journal of the Mexican Chemical Society, vol. 43, núm. 2, marzo-abril, 1999, pp. 39-42
Sociedad Química de México
Distrito Federal, México
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Revista de la Sociedad Química de México, Vol. 43, Núm. 2 (1999) 39-42
Investigación
Unión a proteínas plasmáticas de la DL-3-hidroxi-3-etil-3-fenil-propionamida
(HEPP). Un nuevo anticonvulsivante
Luis J. García, Liz J. Medina* y Helgi Jung
Laboratorio de Neuropsicofarmacología. Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía “Manuel Velásco Suárez”, Insurgentes
Sur No. 3877, Col. La Fama, Tlalpan, C.P. 14269, México, D.F., Teléfono: 5606-3822 Ext. 2017, Fax: 5606-3032
Resumen. En el presente trabajo se determinó el grado de unión a
proteínas plasmáticas de un nuevo fármaco antiepiléptico, la DL -3hidroxi-3-etil-3-fenil-propionamida (HEPP), utilizando la técnica de
diálisis al equilibrio. El estudio se llevó a cabo utilizando plasma y
albúmina sérica bovina, conteniendo HEPP en el rango de concentraciones de 6.25 a 100 mg/mL, las cuales se dializaron durante 3 h a
37ºC y se cuantificaron por CLAR. Los resultados mostraron que el
HEPP se une en un 32.57 a 38.88% a proteínas totales y en un 30.88
a 37.43% a albúmina sérica bovina. Estos resultados indican que este
compuesto se une exclusivamente a la albúmina. Al determinar la
cinética de unión se encontró que el HEPP presenta un solo sitio de
unión y una constante de asociación de 3.81 × 103 M–1 a 37ºC.
Abstract. In the present work, the extent of binding to plasma proteins of a new anticonvulsant, DL -3-hydroxy-3-ethyl-3-phenyl-propionamide (HEPP) was evaluated using the equilibrium dialysis technique. The study was carried out using plasma and bovine serum
albumin, containing HEPP in the concentration range of 6.25 to 100
mg/mL, which were dialysed for 3 h to 37ºC and determined by
HPLC. Results showed that HEPP was 32.57 to 38.88% bound to
human plasma and 30.88 to 37.43% to bovine serum albumin. These
results indicate that HEPP binds exclusively to albumin. The kinetic
of binding showed that HEPP has one binding site and an association
constant of 3.81 × 103 M–1 at 37ºC.
Introducción
luado y, actualmente se encuentra en la etapa de evaluación
clínica fase I [8]. Durante ésta fase, es necesario determinar
los parámetros relacionados con la distribución del nuevo fármaco en el cuerpo. Uno de los principales factores que determina la distribución de un fármaco es su grado de unión a proteínas. La mayoría de los fármacos, principalmente ácidos o
bases, se unen a las proteínas plasmáticas, generalmente a
albúmina y algunas veces también a las globulinas. El conocer
el grado de unión de un fármaco es importante, ya que solo el
fármaco libre puede pasar a través de las membranas celulares
y alcanzar los receptores, para ejercer su actividad terapéutica.
Cuando la unión a proteínas es reversible, la cantidad de fármaco unido actúa como un depósito del cual se va liberando
lentamente el fármaco activo y reemplazando el que es eliminado [9]. Dado que la unión a proteínas plasmáticas ejerce un
efecto marcado sobre la farmacocinética, farmacodinamia e
interacciones entre fármacos, se llevó a cabo el presente trabajo cuyo objetivo fue estudiar la unión del HEPP a proteínas
En 1964 el Dr. Carbajal sintetizó una serie homóloga de fenilalquil-amidas con marcada actividad anticonvulsivante [1], de
las cuales la DL-4-hidroxi-4-etil-4-fenil-butiramida (HEPB) y
sus homólogos inferiores, la DL-3-hidroxi-3-etil-3-fenil-propionamida (HEPP, Fig. 1) y la DL-2-hidroxi-2-etil-2-fenilacetamida (HEPA), fueron evaluadas en animales. Los resultados demostraron que los tres compuestos eran efectivos para el
tratamiento de crisis de ausencia generalizadas; sin embargo,
dado que el HEPP mostró ser menos neurotóxico, fue el seleccionado para continuar con los estudios toxicológicos y neuroquímicos [2-5].
El HEPP muestra un amplio espectro de acción anticonvulsivante; ha demostrado su actividad en las crisis inducidas
por pentilentetrazol (PTZ) en ratas, encontrándose una correlación directa entre el efecto anticonvulsivante y la concentración de fármaco en cerebro [6]. De la misma manera, el
HEPP mostró efecto sobre un nuevo modelo de epileptogénesis conocido como “síndrome de abstinencia al ácido γaminobutírico (GABA)” [7]. En éste modelo, el HEPP disminuyó la frecuencia de descargas del foco epiléptico producidas
por la interrupción repentina de GABA. Al realizar los estudios farmacocinéticos y toxicológicos, el compuesto cumplió
con los requerimientos de eficacia y seguridad en animales por
lo que se consideró un buen candidato para seguir siendo eva-
Et
C
OH
Fig. 1. Estructura química del HEPP.
CH2
CONH2
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Rev. Soc. Quím. Méx. Vol. 43, Núm. 2 (1999)
plasmáticas, caracterizar la unión ligando-proteína, la constante de afinidad del fármaco a proteínas (KA) y el número
de sitios de unión (n).
Parte experimental
Reactivos. La DL-3-hidroxi-3-etil-3-fenil-propionamida
(HEPP) y el estandar interno DL-2-hidroxi-2-etil-2-fenilacetamida (HEPA) fueron donados por Laboratorios Armstrong, México. Albúmina sérica bovina (ASB), Sigma Chemical Co. El metanol R.A., metanol HPLC, diclorometano R.A.,
hidróxido de sodio R.A. y el fosfato de potasio R.A., fueron
de Mallinckrodt laboratories. El plasma utilizado en el estudio
se obtuvo del banco de sangre del Instituto Nacional de Neurología.
Equipo. Equipo de diálisis al equilibrio Spectrum y membranas Spectra/Por (cut-off, 12 000-14 000), Spectrum
Medical Industries.
Cromatógrafo de líquidos de alta resolución con automuestreador Beckman System Gold, modelo 166.
Método analítico para la cuantificación de HEPP en
plasma, ASB y solución amortiguadora de fosfatos. La cuantificación del HEPP se llevó a cabo empleando un método por
Cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR), previamente reportado [8]. Para ello, a 500 mL de plasma o ASB se
le añadieron 50 mL de metanol conteniendo el estándar interno (HEPA, 100 mg/mL), 500 mL de una solución de hidróxido de sodio 2 M, 500 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 8 y 5 mL de diclorometano. Se agitó a 80 rpm
durante 15 min y posteriormente se centrifugó a 1650 g durante 15 min. Una vez centrifugada la muestra, se separó la fase
orgánica la cual se evaporó a baño maría a 40ºC bajo corriente
de nitrógeno. La muestra se reconstituyó con 200 mL de fase
móvil acetonitrilo-agua (25:75) y se inyectaron 100 mL al cromatógrafo. Las condiciones cromatográficas fueron las siguientes: columna Spherisorb ODS C18 (5 mm; 200 × 4.6
mm), longitud de onda de 219 nm y una velocidad de flujo de
0.8 mL/min. El método fue validado de acuerdo a los requisitos que marca la FDA [10-11], mostrando ser lineal en un
rango de 0.39 a 100 mg/mL, con una reproducibilidad y
repetibilidad de 4.3 y 4.2% respectivamente y un porciento de
recobro entre 91.7 a 100.5%.
Estudio de unión del HEPP a proteínas
plasmáticas
El estudio se llevó a cabo tanto en plasma como en ASB. Para
llevar a cabo el estudio fue necesario establecer los siguientes
factores que influyen directamente en el grado de unión: tiempo de equilibrio, unión a la membrana de diálisis y volumen
desplazado [12-15]. La metodología utilizada fue la siguiente.
Tiempo de equilibrio. El tiempo de equilibrio se llevó a
cabo utilizando un equipo con cinco celdas de diálisis de dos
compartimientos de 1 mL de capacidad cada uno. Los com-
Luis J. García et al.
partimientos se encontraban separados por una membrana de
celulosa con un poro para evitar el paso de compuestos de
peso molecular entre 12,000 y 14,000. Un mililitro de plasma
conteniendo HEPP a una concentración de 50 mg/mL fue dializado contra el mismo volumen de solución amortiguadora de
fosfatos 0.064 M, pH = 7.4. El equipo fue puesto en un baño
de agua a 37ºC. Las celdas se rotaron a 30 rpm y se tomaron
muestras a los 5, 10, 20, 30, 60, 9 0, 120, 180, 240 y 360 min.
Las concentración de HEPP en la solución amortiguadora o
plasma dializados se determinaron utilizando el método por
CLAR antes descrito [8]. El tiempo para alcanzar el equilibrio
fue de 3 h, por lo que el resto de los experimentos se realizaron utilizando esta condición.
Unión del HEPP a la membrana de diálisis . Para determinar si el HEPP se unía en cierto grado a la membrana, un
mililitro de solución amortiguadora de fosfatos 0.064 M conteniendo HEPP a una concentración de 50 mg/mL fue dializado contra el mismo volumen de la misma solución libre de
fármaco, durante 3 h, 37ºC y 30 rpm. Las muestras obtenidas
de ambos lados de la membrana se cuantificaron de acuerdo al
método por CLAR descrito anteriormente [8].
Volumen desplazado. Para determinar el paso de agua
hacia el compartimiento del plasma, un mililitro de plasma fue
dializado contra el mismo volumen de solución amortiguadora
de fosfatos 0.064 M, pH = 7.4, durante 3 h. Al finalizar la
diálisis se cuantificó la cantidad de proteína del lado del plasma por el método de Biuret [16] y se comparó con la concentración de proteína encontrada en el plasma antes de la diálisis. El mismo procedimiento se llevó a cabo utilizando ASB.
Una vez establecidas las condiciones, se determinó el
grado de unión del HEPP utilizando el siguiente procedimiento.
Unión del HEPP a proteínas plasmáticas totales . El estudio se llevó a cabo dializando un mililitro de plasma añadido
de HEPP en el rango de concentraciones de 6.25 a 100 mg/mL,
contra 1 mL de solución amortiguadora de fosfatos pH = 7.4,
durante 3 h, 37ºC y 30 rpm. Al finalizar la diálisis se tomaron
alícuotas de 0.5 mL de cada uno de los compartimientos. Las
concentración de HEPP en la solución amortiguadora o plasma
dializados se determinaron utilizando el método por CLAR
antes descrito. Este procedimiento se realizó por quintuplicado
para cada una de las concentraciones.
Unión del HEPP a ASB al 4%. El estudio se llevó a cabo
en muestras de ASB añadidas de HEPP en el rango de concentraciones de 6.25 a 100 mg/mL, en el cual 1 mL de ASB se
dializó contra 1 mL de solución amortiguadora de fosfatos
pH = 7.4, durante 3 h, utilizando un baño de agua a 37ºC. Las
celdas se rotaron a 30 rpm. Al finalizar la diálisis se tomó una
alícuota de 0.5 mL de ambos compartimientos (plasma y solución amortiguadora) y se cuantificaron utilizando el método
por CLAR previamente mencionado [8]. Este procedimiento se
realizó por quintuplicado para cada una de las concentraciones.
Análisis de los datos. El porcentaje unido fue calculado
utilizando la siguiente fórmula:
CP – CF
% = ––––––––– × 100
CP
Unión a proteínas plasmáticas de la HEPP. Un nuevo anticonvulsivante
donde CP es la concentración de HEPP encontrada en el compartimiento de plasma después de la diálisis y CF es la concentración de HEPP libre encontrada en el compartimiento de
la solución amortiguadora después de la diálisis.
Para determinar el número de sitios de unión (n) y la
constante de asociación (KA), se utilizó el método de Scatchard [12-13], cuya ecuación es las siguiente:
r
——
nKA – rKA
[F] =
donde: [F]= concentración de fármaco libre y r = mol de fármaco unido/mol de proteína total.
41
Tabla 1. Unión del HEPP a proteínas plasmáticas totales y a
ASB al 4 % (n = 5) a diferentes concentraciones de HEPP.
Concentración de
HEPP en plasma
(µg/mL)
Fracción
unida (%)
± D.E.
Concentración
de HEPP en ASB
al 4%(µg/mL)
Fracción
unida (%)
± D.E.
6.25
38.88 ± 1.12
6,25
37.43 ± 1.07
12.5
37.01 ± 1.07
12,5
36.60 ± 0.69
25
35.59 ± 0.39
25
35.04 ± 0.30
50
34.49 ± 0.64
50
33.69 ± 0.91
100
32.57 ± 1.11
100
30.88 ± 1.01
Promedio ± D.E.M. 35.70 ± 2.40
Resultados y discusión
La concentración de proteínas en la muestra de plasma utilizada para el estudio fue de 7.12 g/100 mL (método de Biuret
[16]), valor que se encuentra dentro del rango reportado en
humanos.
Tiempo de equilibrio. En la Fig. 2 se puede observar que
la meseta inicia a los 180 min, lo cual indica que el tiempo al
cual el HEPP alcanzó el equilibrio, bajo las condiciones utilizadas (37ºC y 30 rpm) fue de 3.0 h.
Unión del HEPP a la membrana de diálisis. El grado de
unión del HEPP a la membrana de diálisis fue menor del
1.59%, lo cual indica que la membrana no influye en la estimación de la fracción unida y por lo tanto el error inherente es
despreciable.
Determinación del volumen desplazado. No se encontraron diferencias significativas entre la concentración, tanto
de proteínas plasmáticas totales como de albúmina bovina,
antes y después de la diálisis, lo cual indica que no hubo un
desplazamiento de volumen de agua desde la solución amortiguadora hacia la proteína, que hubiera ocasionado una dilu-
Fig. 2. Determinación del tiempo para alcanzar el equilibrio entre
plasma añadido de HEPP y solución amortiguadora de fosfatos 0.064
M pH 7.4.
Promedio ± D.E.M. 34.73 ± 2.1
DEM = Desviación estándar de la media.
ción de la misma, por lo que no hubo necesidad de realizar
corrección alguna al respecto.
Con base en los resultados anteriores, se consideró que el
método de diálisis al equilibrio era el adecuado para realizar el
estudio.
Determinación del grado de unión del HEPP a proteínas
plasmáticas totales. Las concentraciones seleccionadas (6.25 –
100 mg/mL) para el estudio representan a las concentraciones
de HEPP encontradas en humanos después de administrar una
dosis única de 250 mg [8]. En la Tabla 1 se observa que el porciento de unión del HEPP a proteínas plasmáticas totales fue
de 32.57 – 38.88% en el rango de concentración estudiado. En
ella se puede observar que la fracción unida disminuye conforme la concentración de HEPP se incrementa, lo cual podría
deberse a una unión dependiente de la concentración.
Determinación del grado de unión del HEPP a ASB al
4%. En la Tabla 1 se observa que el porciento de unión del
HEPP a ASB al 4% fue de 30.88 – 37.43% en el rango de
concentración trabajado. Los resultados anteriores son muy
semejantes a los encontrados en proteínas plasmáticas totales,
lo cual indica que el HEPP se une exclusivamente a ASB.
Este es el primer estudio realizado para determinar el
grado de unión a proteínas plasmáticas del HEPP en humano.
Gómez y cols. [4] utilizaron plasma de rata para determinar el
grado de unión; sin embargo, reportes en la literatura indican
que para algunos fármacos, los sitios de unión de algunas
especies animales no son los mismos que los encontrados en
seres humanos [17-18]. Al comparar los resultados obtenidos
por Gómez con los del presente estudio, se encontraron diferencias significativas entre ellos (19.9% [4] contra 35.7% en
promedio); sin embargo, los cálculos para determinar el grado
de unión fueron diferentes, por lo que al efectuar los cálculos
nuevamente, la diferencia entre los resultados no fue significativa (p < 0.05), lo cual indica que la fracción unida en plasma
de rata es semejante a la fracción unida en plasma humano.
En la Fig. 3 se muestra la gráfica de Scatchard derivada
de los datos de unión a proteínas a las diferentes concentraciones estudiadas. La línea recta muestra que el HEPP interac-
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Rev. Soc. Quím. Méx. Vol. 43, Núm. 2 (1999)
ciona con la proteína presentando una sola clase de sitio de
unión. La constante de asociación (KA), obtenida de la pendiente de la gráfica dió un valor de 3.81 × 1 0 3 M –1 y el
número de sitios de unión (n) fue de 0.2913.
La constante de afinidad KA es una medida de qué tan
afín es un fármaco a un sitio de unión específico y no está
relacionado directamente con el porcentaje de unión presentado por el fármaco, es decir, un fármaco que tenga un alto
grado de unión a proteínas puede presentar una baja afinidad a
éstas [19-20]. Nuestros resultados muestran que el HEPP, a
pesar de presentar un bajo grado de unión, presenta una
afinidad considerable a sus sitios de unión (KA = 3.81 × 10 3
M –1 ). Un parámetro más representativo de la habilidad de
unión del fármaco a la proteína está dado por el producto de
n*KA, que en el caso del HEPP fue en promedio de 1.1 × 10 3
M –1, lo cual concuerda con el bajo grado de unión presentado
por éste, comparado con el valor de 10 6 M –1 mostrado por fármacos que se unen en alto grado a las proteínas. Por otro lado,
a excepción de la concentración de 100 mg/mL, todas las concentraciones utilizadas para determinar el grado de unión, se
encuentran por encima del valor de KA obtenido, por lo que
se puede asumir que la fracción unida se encuentra en función
del número de sitios de unión y de la concentración del fármaco, razón por la que al observar la Tabla 1 encontramos una
disminución en el porciento de fracción unida conforme
aumenta la concentración estudiada.
Conclusiones
El HEPP se une en su totalidad a la albúmina, el grado de
unión oscila entre un 30 a 39%, presenta una sola clase de
sitios de unión y una constante de asociación de 3.81 × 10 3
M –1. Estos resultados muestran que el grado de unión a proteínas plasmáticas es bajo, por lo que la unión a proteínas del
HEPP, no es de importancia clínica.
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Fig. 3. Gráfica de Scatchard para determinar la constante de asociación fármaco-proteína y el número de sitios de unión del HEPP en
ASB al 4%. Regresión lineal: y = 3.81 × 10-3 x + 1110.50; r =
0.9635; n = 0.2913; KA = 3.81 × 10–3 M–1 .
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