Expresión de DNA recombinante in vivo CAPÍTULO 9 - U
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CAPÍTULO 9 Expresión de DNA recombinante in vivo Expresión del DNA clonado en células • • Caracterización del producto génico Análisis funcional de DNA clonado Expresión del DNA clonado en organismos Análisis funcional de genes en individuos completos Manupulación de genes/Inactivación de genes Creación de individuos transgénicos Seres vivos como biorreactores Caracterización del producto génico mediante expresión funcional en células Células utilizadas como sistema para la expresión funcional de genes “de interés” Procariotes (Ej. E. coli) USO Analítico /productivo Preferentemente genes de procariotes o aquellos de eucariotes que no requieran procesamiento post-transcripcional o posttraduccional Vectores con promotores fuertes: trp, lac, PL, tac (sintético) Operador, permite control de la expresión Eucariotes Procesamiento de transcritos Modificaciones postraduccionales 1.-Levaduras USO Analítico /productivo Expresión de proteínas secretadas Sistema del doble híbrido (interacción de proteínas o dominios de proteínas solubles) Gal 4 presa carnada Sistema del doble híbrido Promotor-reportero Incorporación en levaduras Selección Actividad del reportero La “carnada”, mediante el sistema de doble-híbrido, permite encontrar la proteína “presa” con la se une directamente 2.- Ovocitos de sapo USO Analítico Expresión de proteínas de membrana Gran superficie (esferas de 1-2 mm ø) Expresión en células individuales Inyección de DNA en el núcleo Inyección de mRNA en el citoplasma 3.- Líneas celulares de insecto USO ”Productivo”/analítico Expresión de grandes cantidades de proteínas secretadas con propósitos esencialmente analíticos 4.-Líneas celulares de mamífero USO Principalmente analítico Análisis funcional de proteínas nativas o modificadas Sobrexpresión transitoria o permanente de gen “de interés” Análisis funcional de promotores y secuencias reguladoras Vectores derivados de genomas virales: SV-40 (simian virus) CMP(citomegalovirus) BMP(papiloma bovino) Adenovirus Retrovirus Lentivirus ANALISIS FUNCIONAL IN VIVO Expresión funcional del gen clonado Gen de interés promotor Análisis Análisis de secuencias reguladoras de la expresión génica (Promotores) CAT Secuencia de interés Sustratos: cloramfenicol gen reportero: extracto celular luciferasa GFP β galactosidasa CAT cloramfenicol acetil transferasa + *Acetil-CoA cromatografía Cloramfenicol acetilado Reporteros: Reacción catalizada por la luciferasa luciferin oxiluciferin luciferase Emisión de luz Proteína Fluorescente Verde (GFP) Proteína Fluorescente Roja (RFP) Identificación de promotores y elementos regulatorios cis gen reportero región reguladora de la expresión génica GGGCAGAGCATATAAGGTGAGGT Actividad normalizada 1 0 n1 n2 n3 n4………………………………………………………………………………………………nn a c t i v i d a d Nucleot. Actividad del gen reportero vs posición modificada en la secuencia Expresión de proteínas fusionadas Estudios de la función de dominios determinados en una proteína marcador Adición de señales de destinación subcelular a una proteína reportera Expresión funcional de “quimeras” cDNA 1 cDNA 2 Isoformas de proteína cDNA 1 /cDNA 2 cDNA 2 /cDNA 1 * Actividad relativa 1.0 0.5 0 1 1/2 2/1 “quimeras” 2 Evaluación del efecto de mutación puntual Análisis funcional (requisito: disponer de ensayo apropiado) Actividad (%) Actividad relativa de mutantes Efecto de la supresión de la expresión de genes DNA o RNA antisentido RNA antisentido Formación de molécula de hebra doble entre el mRNA y ácido nucleico complementario, que impide su traducción gen x transcripción traducción in vivo Producto génico Función gen x P transcripción traducción Supresión de la función o in vitro transcripción in vivo in vivo Silenciamiento de genes RNA de interferencia o RNA interferente (RNAi) •Silenciamiento génico post transcripcional (PTGS) •Mecanismo natural (micro RNAs o miRNAs) verificado en toda la escala evolutiva: protozoos, nemátodos, insectos, plantas y animales superiores Opera en distintos procesos celulares : regulación endógena de expresión de genes específicos y defensa contra ácidos nucleicos invasores (virus) Herramienta para la supresión de la expresión de genes específicos Núcleo miRNA “artificial” shRNA mRNA traducción Supresión de la función siRNA RNA interferente pequeño (corto) Mediador fundamental del silenciamiento génico • ds RNA (hebra doble) • Longitud 21 a 25 nucleótidos • Complementario a secuencia génica sujeta a silenciamiento (especificidad) Mecanismo de silenciamiento génico mediante siRNA Vía del RNA interferente (RNAi) 2. El dsRNA largo es procesado por la enzima DICER (actividad ribonucleasa) para generar fragmentos de 20-25 nucleótidos de longitud (siRNA) 3. El siRNA se incorpora a un complejo multiproteico que se denomina “Complejo Silenciador Inducido por RNA” (RISC) 4. RISC genera cortes en el RNA codificante (mRNA). 5. Los fragmentos son degradados por exonucleasas especializadas Especificidad dsRNA DICER siRNA Al constituirse el RISC, las hebras complementarias (sentido y antisentido) del siRNA son desapareadas El siRNA desapareado (hebra antisentido) guía al complejo RISC hacia su blanco (mRNA, hebra complementaria) El siRNA desapareado antisentido se asocia (pareamiento de las bases complementarias) con el RNA “blanco” Actividad de endorribonucleasa corta el RNA blanco en la porción media de la región pareada. Exonucleasas completan la degradación siRNA como herramienta para silenciamiento de genes específicos en células de mamífero •Diseño de los siRNAs – Selección de la secuencia blanco en el gen de interés – Es requisito que no tenga homología con otros genes – Es requisito que no tenga tendencia a formar estructura secundaria – Debe tener un contenido GC menor a 55% (40-55) •Sintesis química de las hebras complementarias Aplicación en terapia Ensayos clínicos Nature Reviews-Genetics 12: 329-340, 2011 Incorporación del siRNA a las células •Inyección de dsRNA (sintetizado químicamente o transcrito in vitro) •Bombardeo con partículas recubiertas del siRNA •Nanopartículas •Bacterias •Virus Nature Reviews-Genetics 12: 329-340, 2011 Vectores para expresión de short hairpin RNA (sh RNA) in vivo (generación persistente de siRNA) Secuencia que codifica shRNA de interés está bajo el control transcripcional del promotor para la RNA pol III Estructura del transcrito típico Tallo: Asa o “loop” Extemo 3´ 25-29 nucleótidos de longitud 4-23 nucleótidos de longitud con 2 nucleótidos desapareados Oligonucleótido F Sentido 5’ GATCCCC secuencia ttcaagaga anti sentido secuencia TTTTTGGAAA Oligonucleótido R Sentido secuencia anti sentido tctcttgaa secuencia P 5’ AGCTTTTCCAAAAA transcrito Evaluación GGG P P P shRNA-ERK1 shRNA-ERK2 1,6 ERK1 1,4 ERK2 1,2 1,0 0 ,8 0 ,6 0 ,4 0 ,2 0 ,0 ER K1 ER K2 sh R N A SC R Recombinación Homóloga Mecanismo biológico: intercambio de información genética entre secuencias homólogas Como herramienta para manipulación genética: Inactivación o ablación (knock out) de genes Inserción de genes “GENE TARGETING” Recombinación homóloga DNA genómico gen “X” funcional gen “X” con inserción (no funcional) recombinación gen “X” no funcional Secuencia que “interrumpe” Marcador de selección (Ej. gen de resistencia a antibiótico)bajo control transcripcional del promotor del gen X Sustitución de un gen (o parte de él) recombinación gen “X” funcional gen “X” funcional gen “X” funcional Inserción de DNA en el gen blanco (diana) vector gen marcador y gen “X” Α Β recombinación ∗ ∗ ∗ Incorporación del gen “x” dentro del gen y (inactivación del gen y) Interrupción del gen x con otras secuencias (Inactivación del gen x endógeno) Incorporación del transgen en las células germinales Huevo fertilizado transgen Microinyección en pronúcleo Implantación en hembra seudopreñada Incorporación del transgen al genoma mediante recombinación homóloga ¿Cuáles crías incorporaron el transgen en su genoma? Análisis de Southern para la identificación de los animales que portan el transgen +/- +/+ -/- +/- homocigotos Línea de animales transgénicos homocigotos +/- +/- -/- -/- Sistema Cre loxP: (Procariote a Eucariote) Ablación (Knock out) dirigida de un gen determinado Creación de ratón transgénico A loxP A loxP Se incorpora el “gen de interés” acotado por sitios lox P (34 pb) en el genoma de los ratones A Creación de ratón transgénico B B Se incorpora el “gen Cre” unido al promotor específico para un tipo celular determinado en el genoma de los ratones B P gen Cre Promotor para expresión tejido-específica Cre es recombinasa (de bacteriófago) específica para sitios lox P. Su expresión queda circunscrita a un tejido específico (según el promotor escogido) Cruza de ratones A y B genera los ratones C A B C En el tejido de los ratones C, donde el promotor P es funcional… se expresará la enzima Cre, que cataliza la recombinación de los sitios loxP Eliminación de gen de interés sólo en el tejido donde se expresa la recombinasa Cre Análisis de la(s) consecuencias de la ablación de genes (Knock out) Morfogénesis en el curso del desarrollo embrionario Mutante Bithorax de Drosophila Epecimen nativo de Drosophila Mutante Antenapedia de Drosophila Drosophila nativa Incorporación de tranagen en el genoma de células somáticas Ex vivo Selección Descendencia normal Incorporación de transgen en células troncales embrionrias . . .. . . blastocisto. .. .. .. . ... ... .... Células de la masa interna Ex vivo Selección ... .. ... . .. . . . .. .. .. .. Implantación en el útero madre Desarrollo embrionario descendencia Expansión ex vivo Células troncales adultas Terapia celular Diferenciación in vitro Terapia génica modificación Transferencia génica ex vivo Transferencia in vivo del transgen Transferencia génica …..A considerar: •Vector •Transgen de interés •Tejido o célula de destino Desafíos: Destinación específica Expresión prolongada de transgen (persistencia del vector) Nivel de expresión adecuado a los propósitos perseguidos Vectores para transferencia génica en humanos •Retrovirales •Lentiviraless •Adenovirales Ensayos clínicos de transferencia de trangenes usando adenovirus en seres humanos Enfermedad Hereditaria Transgen α1 antitrypsin deficiency α1 antitrypsin Intramuscular Batten’s disease CLN2 Direct intracranial administration Canavan’s disease Aspartoacylase Direct intracranial administration Cystic fibrosis CFTR Haemophilia B Factor IX Direct instillation to maxillary sinus, bronchoscopy to right lower lobe, aerosol to whole lung Intramuscular Hepatic Intravenous LPL deficiency LPL Intramuscular Pompe’s disease GAA Series of intradiaphragmatic injections Muscular dystrophy: Duchenne Microdystrophin Intramuscular Muscular dystrophy: limb girdle α-sarcoglycan Injections into the selected muscle Enfernmedad adquirida Severe heart failure SERCA2a Antegrade epicardial coronary artery infusion Parkinson’s disease AADC GAD Neutrophin Intracranial Macular degeneration sFLT01 No publicado Rheumatoid arthritis TNFR-Fc Intra-articular Vía de administración Nature Reviews - Genetics 12: 341-353, 2011 Problemas enfrentados Silenciamiento del transgen (Ej metilación) Mutagénesis indeseada por inserción del transgen en sitios que codifican funciones importantes Toxicidad resultante de la sobre-expresión del transgen Gatillamiento de respuesta inmune contra la proteína codificada por el transgen Transmisión indeseada del transgen entre humanos vía fluidos corporales (suero, orina, semen)
