Genotipos con LA

El Linear Array HPV test (Roche) permite la detección de
múltiples genotipos en la misma muestra
A.Cecilia Maldonado(1), Ariel Sanchez(2), Carolina Rodriguez(1), Teresita Alvarellos(2), Marina Gutiérrez (1)
Stamboulian Laboratorio, Buenos Aires; Hospital Privado, Córdoba, Argentina
(1)
(2)
Genotipos con LA: mostraron una gran variedad (20)
distribuídos con las siguientes frecuencias:
Introducción
El cáncer cervical es la segunda causa de muerte en mujeres. El
virus del papiloma humano (HPV) participa en el desarrollo de
lesiones pre-cancerosas y en cancer de cuello uterino.
Existen más de 100 genotipos de HPV. Aproximadamente 40
infectan mucosa ano-genital en humanos y se clasifican en alto
o bajo riesgo de acuerdo a su rol en la carcinogénesis.
Los métodos moleculares se han convertido en herramientas
útiles para el screening, diagnóstico y seguimiento de la
infección por HPV.
El Linear Array HPV test, Roche (LA) permite la genotipificación
del virus más completa (13 genotipos de alto riesgo, 24
genotipos de bajo riesgo).
Objetivos
Evaluar el sistema de extracción de ADN con el sistema
MagnaPure (MP, Roche).
Evaluar el Linear Array Genotyping Assay (LA, Roche) para la
detección y genotipificación de HPV, comparándolo con PCR
convencional y Amplicor (Roche).
Muestra PCR
1
P
2
P
3
P
4
P
5
P
6
P
7
P
8
P
9
P
10
P
11
P
12
P
13
P
14
P
15
P
16
P
17
P
18
P
19
P
20
P
21
P
22
P
Amplicor
AR
AR
N
AR
AR
AR
AR
AR
N
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
AR
N
AR
AR
AR
N
Genotipo LA
53 / 56/ 62
6,51
62/81/83
51/33
18/61
16/51/52
45/52
31
55
45
59
52
16/18//58/62
53,58
16
31-68-52
16
53
31
16/51/52
53 /66
6
GEN 6
GEN 16
GEN 18
GEN 31
GEN 33
GEN 45
GEN 51
GEN 52
GEN 53
GEN 55
GEN 56
GEN 58
GEN 59
GEN 61
GEN 62
GEN 66
GEN 68


GEN 81
GEN 83
0
1
2
N
3
Alto riesgo
Bajo riesgo
4
5
LA permitió detectar la coexistencia de 2 o más genotipos en
una misma muestra. Se observaron:
• 1 genotipo en 10 muestras (45%)
• 2 genotipos en 6 (27%)
• ≥ 3 en 6 (27%).
Materiales y Métodos
Se analizaron 55 muestras (54 cepillados endocervicales y 1
hisopado anal) provenientes del Hospital Privado de Córdoba y
de Stamboulian Laboratorio.
Conclusiones
La extracción de ADN se realizó con el sistema automatizado
MagnaPure. Para validación también se analizaron ADN
extraídos con Amplilute Media Extraction Kit (Roche).
• Las muestras clínicas endocervicales se pudieron procesar con
el sistema de extracción MP obteniendo ADN amplificable para
su posterior análisis por PCR convencional o LA.
Todas las muestras fueron previamente analizadas utilizando el
kit Amplicor HPV test, Roche y PCR convencional con primers
consenso My9/11 y Gp5/6 que amplifican una region de 450 y
156 pb, respectivamente del gen L1 del virus. El estudio se hizo
a ciegas, sin saber el resultado del Amplicor.
• La extracción automatizada permite mayor estandarización y
rapidez.
• El estudio del HPV por LA produjo resultados comparables a
otras metodologías. Sin embargo, presenta la ventaja de
identificar una gran variedad de genotipos (37).
La genotipificación se realizó con LA basado en hibridización del
producto de amplificación con sondas genotipo específicas y
detección colorimétrica con la capacidad de detectar 37
genotipos diferentes.
• El LA detectó la presencia de co-infecciones en 54%
muestras, sugiriendo una sensibilidad mayor que RFLP o
secuenciación.
Algunas muestras negativas (18%) fueron también analizadas
con LA.
• La distribución y frecuencia de genotipos de HPV en este
estudios fue inesperada.
El análisis estadístico para comparación de métodos cualitativos
se realizó con el porcentaje de acuerdo (kappa>70%).
• Poco se conoce sobre la epidemiología de este virus en
Argentina. Es necesario confirmar los datos obtenidos en un
mayor número de pacientes, ya que esto podría impactar en los
programas de vacunación.
Resultados
El screening a ciegas por PCR convencional detectó 22 (40%)
muestras positivas y 33 (60%) muestras negativas. Con LA se
analizaron todas la muestras positivas y 6 negativas.
Los resultados de LA fueron concordantes con los obtenidos con
PCR y Amplicor, excepto una muestra que fue positiva por PCR,
LA y negativa por Amplicor.
Qualitative Method Comparison
Qualitative Method Comparison
Ref. Method: PCR Convencional
Test Method: LA
Ref. Method: Amplicor
Statistical Analysis
(Comparison of two Laboratory Methods)
(Comparison of two Laboratory Methods)
Agreement
Positive Agreement
Negative Agreement
Agreement
Positive Agreement
Negative Agreement
100.0% (87.9 to 100.0%)
100.0%
100.0%
95% confidence intervals calculated by the "Score" method.
McNemar Test for Symmetry:
Test < Reference
0 (0.0%)
Test > Reference
0 (0.0%)
Symmetry test PASSES
1
neg <-- Test --> pos
neg <-- Test --> pos
Statistical Analysis
2
Test Method: LA
2
96.4% (82.3 to 99.4%)
100.0%
85.7%
95% confidence intervals calculated by the "Score" method.
McNemar Test for Symmetry:
Test < Reference
0 (0.0%)
Test > Reference
1 (3.6%)
Symmetry test PASSES p > 0.999 (Exact Test)
1
A value of p<0.05 suggests that one method is consistently "larger".
Cohen's Kappa
100.0% (100.0 to 100.0%)
Cohen's Kappa
Kappa is the proportion of agreement above what's expected by
chance. Rule of thumb is Kappa>75% indicates "high" agreement.
We would like to see VERY high (close to 100%) agreement.
1
2
neg <-- Reference -->pos
90.0% (70.8 to 109.2%)
Kappa is the proportion of agreement above what's expected by
chance. Rule of thumb is Kappa>75% indicates "high" agreement.
We would like to see VERY high (close to 100%) agreement.
1
2
neg <-- Reference -->pos
Agradecimientos
Al Departamento de calidad de Stamboulian Laboratorio, Dras.
Cecilia Ghisolfi y Silvina Sebastian por el análisis estadistico.