E-048 - Universidad Nacional del Nordeste

Resumen: E-048
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Actividad hemorrágica sistémica inducida por el veneno de
Philodryas patagoniensis del nordeste argentino
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Peichoto, M. E. - Teibler, P. - Leiva, L. C. - Guaimás Moya, L. E. - Acosta, O.
1.Cátedra de Química Biológica I, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, UNNE.
Av. Libertad 5470, Corrientes 3400, Argentina.
2.Cátedra de Farmacología, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE.
Sargento Cabral 2139, Corrientes 3400, Argentina.
3.Cátedra de Patología Quirúrgica, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE
Sargento Cabral 2139, Corrientes 3400, Argentina.
Antecedentes
Philodryas patagoniensis es una culebra opistoglifa que habita el nordeste argentino (Alvarez et al, 2002). La secreción
de su glándula de Duvernoy posee una toxicidad suficiente como para producir daños locales severos, tales como:
edema, hemorragia, mionecrosis y dermonecrosis, también se ha comprobado que esta secreción produce un
alargamiento en el tiempo de coagulación (Acosta et al, 2003, Peichoto et al , 2004a).
Reportes de mordeduras en humanos por esta culebra son escasos (Fowler and Salomão, 1994; Nishioka and Silveira,
1994; Araujo and dos Santos, 1997). Al igual que en los casos de mordeduras por P. olfersii, los signos y síntomas
locales producidos por mordeduras de P. patagoniensis pueden ser confundidos con los producidos por mordeduras de
especies de Bothrops, lo que es necesario evitar para impedir la aplicación del antiveneno específico, que podría
desencadenar efectos perjudiciales sobre la salud del individuo (Nishioka and Silveira, 1994).
Teniendo en cuenta que se trata de una secreción cuya potencia letal - DL50 2.93 µg/g- (Acosta et al, 2003) es similar a
la de especies de Bothrops (Acosta et al, 1998), es de interés iniciar el estudio de los efectos sistémicos potenciales de
esta secreción. Para tal fin, en el presete trabajo se evaluó la actividad hemorrágica sistémica y se determinó el consumo
de fibrinógeno plasmático in vivo.
Materiales y Métodos
Veneno de Philodryas patagoniensis
Se obtuvo a partir de serpientes adultas (90 – 120 cm de longitud) mantenidas en cautiverio en el Serpentario del
Zoológico de la ciudad de Corrientes y en la Colección Herpetológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y
Agrimensura de la Universidad Nacional del Nordeste.
La extracción del veneno se realizó introduciendo una micropipeta de 100 µl en cada colmillo, siguiendo el
procedimiento de Ferlan et al. (1983). El veneno crudo fue desecado, homogeneizado y conservado a -20 ºC. Para la
realización de los ensayos, el veneno se disolvió en solución salina amortiguada con fosfato 0.1 M, pH 7.2 (PBS). La
pequeña cantidad de material insoluble que pudo formarse se separó por centrifugación, obteniéndose un sobrenadante
límpido que se destinó para los ensayos.
Estimación de la concentración de proteínas
El contenido de proteína fue estimado a partir de la medida de la absorbancia a 280 nm en una cuba de 1 cm, asumiendo
que la absorbancia de 1 mg/ml de veneno crudo es de 1.183.
Actividad Hemorrágica Sistémica
Se utilizó la técnica de Rucavado et al (2004). Ratones (18-20 g) fueron inyectados i.v. con diferentes dosis de veneno
(20, 40, 80 y 120 µg) disuelto en PBS. Una hora después de la inoculación los ratones fueron sacrificados por
sobredosis de anestesia, y sus cavidades torácicas fueron abiertas para observar la presencia de manchas hemorrágica en
los pulmones. La dosis hemorrágica pulmonar mínima (DHPM) es la mínima dosis de veneno que induce manchas
hemorrágica evidentes en los pulmones de todos los ratones inyectados. Los animales controles recibieron PBS en
idénticas condiciones. Para estudios de inhibición, se pre-incubó el veneno en una cantidad correspondiente a la DHPM
con una cantidad constante de Na2EDTA (1mM) durante 1 hora a temperatura ambiente, y con suero de ratón normal
durante 30 min a 37 ºC. Alícuotas de las mezclas de reacción fueron inyectadas i.v. como fue descripto
precedentemente. Después de una hora, los ratones fueron sacrificados y se observó la presencia de hemorragia
pulmonar. Las muestras de tejido pulmonar fueron obtenidas por disección, fijadas en solución de Bouin durante 24-48
horas, y embebida en parafina. Secciones de 10 µm de espesor fueron preparadas y teñidas con hematoxilina-eosina
(HE).
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Efecto del veneno sobre el fibrinógeno plasmático de rata
Se usó el método descripto por Assakura et al. (1994). Ratas macho adultas fueron anestesiados i.p. con hidrato de
cloral (300 mg/kg) y heparinizados con 1000 IU/kg, i.v. Cuatro ratas fueron utilizadas para cada una de las siguientes
dosis: 0.23, 0.45 and 0.9 mg de veneno disuelto en 0.3 ml de PBS. Ratas controles fueron inyectadas con 0.3 ml de
PBS. Alícuotas (1 ml) de sangre fueron retiradas 15, 30 y 60 min después de la inyección. Sangre control (1 ml) fue
retirada 15 min antes de la inyección. La inoculación del veneno y el retiro de las muestras de sangre se realizaron a
través de un catéter de polietileno introducido en la vena ilíaca. Con el fin de mantener un volumen de sangre constante,
cada muestra de sangre recolectada fue reemplazada por inyección de un volumen equivalente de NaCl 0.9 %. Veinte
microlitros de plasma de rata fueron agregados a 180 µl de NaCl 0.9 % y coagulados con 50 µl de 25 NIH unidades de
trombina. Los tiempos de coagulación fueron medidos a 37 ºC. La concentración de fibrinógeno fue determinada a
partir de una curva de calibración preparada a partir de un estándar de fibrinógeno (Clauss, 1957).
Discusión de Resultados
La administración i.v. del veneno de Philodryas patagoniensis indujo una actividad hemorrágica pulmonar dependiente
de la dosis, evidenciada macroscópicamente por la presencia de abundante petequias en la superficie de los pulmones
(Figura 1). La DHPM hallada fue de 40 µg (igual a la informada para Bothrops asper, Rucavado et al, 2004) aunque a
menores dosis, algunos de los ratones inyectados presentaron lesiones hemorrágicas. Dosis de veneno mayores a 80 µg
produjeron la muerte inmediata de los animales inoculados
Concordantemente con lo detectado por observación directa del órgano, la microscopia óptica reveló leve congestión y
pequeñas áreas de microhemorragia con la menor dosis (20 µg), daños que se incrementan con el aumento de la dosis,
intensificándose con 80 µg, donde la congestión pulmonar es moderada presentándose mayor número de áreas
hemorrágicas.
La pre-incubación del veneno (40 µg) con Na2EDTA (1 mM) inhibió la actividad hemorrágica del veneno, ya que no se
observó hemorragia pulmonar tanto en la observación macroscópica del órgano como en los correspondientes cortes
histológicos de tejido pulmonar analizados.
Sin embargo, la pre-incubación del veneno (tanto con dosis de 40 como de 80 µg) con suero de ratón normal no produjo
diferencias con respecto a lo observado con el veneno sólo, detectándose aquí también petequias en la superficie de los
pulmones. Los análisis histológicos revelaron que el tejido pulmonar de los ratones inyectados con veneno preincubado
con suero de ratón presentaron abundante congestión con áreas de microhemorragia. Por lo tanto, el suero de ratón
normal no es capaz de inhibir la acción hemorrágica sistémica que exhibe este veneno.
Por otro lado, el veneno de Philodryas patagoniensis también indujo disminución del fibrinógeno plasmático de rata.
Esta disminución fue rápida en los primeros 15 min luego de la inyección, y fue proporcional a la cantidad de veneno
inyectada (Figura 2). Luego de 60 min de la inyección de la dosis más baja de veneno ensayada, se evidencia una
tendencia al restablecimiento del nivel fisiológico de fibrinógeno plasmático. El fibrinógeno plasmático circulante luego
de inoculado el veneno, a diferencia del plasma control, produjo un coágulo laxo con trombina. Siendo esta secreción
carente de actividad coagulante (Peichoto et al, 2004b), se comprueba que este consumo es debido a la acción
hidrolítica de las proteasas constitutivas de la secreción de la glándula de Duvernoy.
Escalante et al (2004) describen la presencia de factores plasmáticos capaces de inhibir metaloproteasas de venenos de
serpientes. Si bien resultados, aquí no presentados, han demostrado que metaloproteasas con acción hemorrágica local
(en piel) presentes en el veneno de P. patagoniensis son susceptibles a la inhibición por parte de componentes séricos,
en este trabajo se constató que la acción sistémica de hemorraginas, presentes en la secreción en estudio, no es inhibida
ni aún cuando este veneno fuera pre-incubado con suero de ratón normal. Esto demuestra que más de un tipo de enzima
hemorrágica estaría presente en la secreción o más de un tipo de mecanismo órgano-dependiente estaría implicado por
la acción de tales enzimas.
Figura 1. Hemorragia pulmonar, bajo la forma
de petequias, en ratones inoculados iv con 40µg
de veneno de Philodryas patagoniensis
Resumen: E-048
Disminución de fibrinógeno plasmático
(% concentration)
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Tiempo, min
Figura 2. Disminución de fibrinógeno plasmático después de inyección i.v. de veneno de P. patagoniensis. Tres dosis
diferentes fueron usadas (▲: 0.9 mg/kg; □: 1.3 mg/kg; ♦: 3.6 mg/kg). Los animales controles (●) recibieron PBS en
idénticas condiciones. Los resultados se representan como el promedio ± SD de cuatro experimentos. Todas las ratas
mostraron una disminución significativa del fibrinógeno plasmático respecto de control (p < 0.01).
Conclusiones
En este trabajo se constató que la acción sistémica de hemorraginas, presentes en la secreción en estudio, no es inhibida
ni aún cuando este veneno fuera pre-incubado con suero de ratón normal, sin embargo estudios previos comprobaron
que la secreción es susceptible, esto es, inhibida, por componentes plasmáticos cuando se estudia su acción hemorrágica
en piel. Esto demuestra que más de un tipo de enzima hemorrágica estaría presente en la secreción o más de un tipo de
mecanismo órgano-dependiente estaría implicado por la acción de tales enzimas. Su aislamiento ha de permitir dilucidar
estos aspectos.
El consumo de fibrinógeno plasmático pone en evidencia la acción sistémica de esta secreción, contribuyendo a la
hemorragia manifiesta en pulmón.
Los resultados de este trabajo, permiten concluir que la secreción de la glándula de Duvernoy de P. patagoniensis
causa, además de daño local, toxicidad sistémica siendo esta última un probable desencadenante de la muerte del
animal.
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