Diagnóstico Virológico PCR y pruebas rápidas: Gripe A.

Diagnóstico Virológico PCR y
pruebas rápidas: Gripe A.
Carlos Artaza Alvarez
MIR 4 Hospital Universitario
Fundación Alcorcón
Reacción en Cadena de la
Polimerasa
(RCP)
INTRODUCCION:
 Década de los 70: Grandes avances en
Biología Molecular:
•
•
•
•
Enzimas de restricción
Clonación de genes en plásmidos y fagos
Técnicas de hibridación en filtro para ADN y ARN
Técnicas de secuenciación química y enzimática
ADN
INTRODUCCION
 1983: Kary Mullis desarrollo una nueva
técnica que hizo posible la síntesis de
grandes cantidades de un fragmento de
ADN sin necesidad de clonarlo: PCR
(polymerase chain reaction).
 Consiguió copiar millones de veces, en un
par de horas, una secuencia predeterminada
dentro de una mezcla de ADN.
PCR: Definición


Síntesis "in vitro" de secuencias específicas de
ADN.
La técnica se basa en la repetición de ciclos de
síntesis de DNA dirigida por oligonucleótidos
para realizar la replicación en forma
exponencial de secuencias diana de ácidos
nucleicos (Amplificación del DNA).
AMPLIFICACION EXPONENCIAL DNA
PCR: Definición
 Es una técnica:



Altamente especifica
Muy sensible: en principio, para practicarla
bastaría una sola molécula (genoma humano)
 ~6 picogramos.
Robusta, utiliza como sustrato al ADN de
muestras sin necesidad de ser purificada de su
fuente natural (tejidos embebidos en parafina,
lavados bronquiales, exudados de mucosas, etc)
PCR: Componentes de la
Reacción
1.
-
-
-
-
Enzima (DNA polimerasa):
Capaces de sintetizar DNA o RNA “in
Vitro”.
Requieren un molde y sintetizan una molécula
complementaria al molde.
Capaces de actuar a altas temperaturas
empleadas en la reacción.
Inicialmente: DNA polimerasa de E. Coli 
inestabilidad térmica (necesario agregar en
cada ciclo)
PCR: Componentes de la
Reacción


Actualmente Enzimas termoestables: Taq
(Thermus acuaticus) y la Vent (Thermococcus
litoralis)  °T optimas: 72°C.
Taq:
• Proteína de una sola cadena polipeptídica.
• Peso molecular de 95 kDa.
• Fidelidad de replicación depende de la [Mg+2] y de
los dNTPs y del balance de estos.
• Tasa de incorporación de nucleótidos: 150
nucleótidos /seg.
PCR: Componentes de la
Reacción
2. DNA molde:
- La concentración de DNA molde depende de la
fuente utilizada.
- Idealmente: 20 nanogramos a 1 microgramo de
DNA genómico de células eucariotas.
- No es necesario purificar el DNA molde.
- Eliminar los inhibidores de la polimerasa.
- Para muestras clínicas: extracción con fenolcloroformo y posterior precipitación de Ácidos
nucleicos con etanol o isopropanol.
PCR: Componentes de la
Reacción
3. Cebadores o iniciadores (Primers):
-Oligonucleótidos sintéticos
-Componente mas sensible que determina el éxito de
la PCR.
-Se deben seleccionar dos iniciadores que estén
localizados en los extremos de la región de interés.
- Longitud: 18 a 30 nucleótidos (↓  < especificidad).
- Contenido: G+C entre 40-75%.
- Concentración: 0.1 a 0,5 uM.
- Deben carecer de estructura secundaria.
PCR: Componentes de la
Reacción
- No deben ser complementarios entre si.
- Existen programas informáticos para el diseño de
cebadores.
- El extremo 3’ del nucleótido iniciador se fija a un
soporte sólido (gel de sílice) y un sintetizador de
DNA añade paso a paso cada nucleótido en una
serie de etapas.
“Maquina de genes”: Construye cadenas de
oligonucleótidos utilizados durante la PCR.
(Oligo 1000M DNA Synthesizer)
PCR: Componentes de la
Reacción
4. Dexosirribonucleósidos trifosfatados
(dNTPs):
- Son los ladrillos con los que se construye las nuevas
cadenas de DNA.
- Cuatro: dATP, dTTP, dCTP y dGTP.
- Concentración equimolar de los 4 dNTPs
- Concentración óptima: 20 y 200 uM.
- Bajas concentraciones: < índice de incorporación.
- Altas concentraciónes: < especificidad
PCR: Componentes de la
Reacción
5. Otros componentes:
- Solución amortiguadora:
• Incluye: HCl, KCl, gelatina y MgCl2.
• Mantiene el pH óptimo para que la enzima actúe.
- Agua:
•
•
•
•
Solvente del resto de componentes
Al menos destilada, purificada por UV y ozono
Libre de DNAsas y RNAsas
Desionizada
- Magnesio: Función critica:
 Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq
Polimerasa para que
incorpore los dNTPs.
• Bajas concentraciones:
Bajo rendimiento
• Exceso Mg:
amplificaciones
inespecificas
RCP: Etapas.
1. Desnaturalización DNA
–
–
–
–
Incubación DNA molde (92-98ºC, de 30-90 seg)
Separación de cadenas complementarias por
ruptura de los puentes de hidrógeno.
Cadenas DNA blanco accesibles al apareamiento.
Etapa crítica, importante DNA molde se
desnaturalice completamente
Desnaturalización del DNA
°T: 92-98°C
30-90 seg
RCP: Etapas.
2. Alineamiento
–
–
–
Enfriamiento de la reacción
Hibridación de cadenas desnaturalizadas con
cebadores o iniciadores (Primer: DNA sintético de
hebras sencilla)
Temperatura optima (°T de fusión) depende de
los cebadores (generalmente 50 a 60 °C)
Alineamiento
ºT: 50-60ºC
RCP: Etapas.
3. Reacción de extensión:
–
–
–
Se efectúa a una temperatura intermedia: 72°C
Actúa la DNA polimerasa extendiendo la longitud
de los cebadores.
Incorpora los nucleótidos libres en dirección 5’ 
3’ complementando la cadena que actúa como
molde.
Reacción de extensión
°T: 72 °C
RCP: Etapas.

Estas tres etapas constituyen un ciclo térmico y se
realizan en forma automatizada en un
TERMOCICLADOR
RCP: Etapas.




Protocolo típico  30 a 50 ciclos
Al completar ciclo  Fragmentos recientes
sirven de molde.
En pocos ciclos  Fragmento sintetizado
producto predominante (amplificación).
Longitud del fragmento DNA distancia entre
los cebadores.
RCP: Etapas.



Evitar un número alto de ciclos : dan lugar a la
amplificación de productos originados por
hibridaciones inespecíficas.
La enzima sufre el efecto meseta: exponencial
 Aritmética  estacionaria.
Cuando el efecto meseta se presenta la cantidad
de DNA sintetizada es suficiente para su
utilización.
Tasa de producción de DNA por PCR
Contaminación en PCR:


La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una
técnica muy sensible, por lo que es de gran
importancia evitar contaminaciones
Existen una serie de normas que ayudan a evitar
las contaminaciones:
•
•
•
•
•
Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
Uso de instrumental exclusivo para la PCR
Utilización de reactivos y tubos estériles
Uso de guantes
Controles blanco
Análisis del producto de una
RCP:

Después de la amplificación:
• DNA puede colocarse en gel de agarosa
• Realizar el corrimiento electroforético,
• Teñirlo y observar en luz ultravioleta el producto de
la RCP.
Análisis del producto de una
RCP:

El análisis mas fino y la caracterización 
metodologías adecuadas:
• Análisis electroforético en geles poliacrilamida.
• Digestiones con enzimas de restricciones
• Hibridación con detectores específicos (genes
clonados)
• Secuenciación nucleotídica.
PCR:DESVENTAJAS
 La PCR supuso un gran avance y permitió
introducir la biología molecular de forma
generalizada en los laboratorios asistenciales.
 El hecho que complica y alarga
extraordinariamente el proceso es la visualización
del producto una vez amplificado, que debe
hacerse por hibridación en solución o en fase
sólida (southern blot).
PCR:DESVENTAJAS
 De esta manera se tarda entre 2 a 4 días en
poder informar un resultado.
 Se necesita disponer de personal altamente
especializado.
 Espacio suficiente para poder separar varias
áreas de trabajo con la finalidad de evitar la
temible contaminación por ADN sintetizado
con anterioridad.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 La mayoría de los inconvenientes se han
solucionado con la introducción de la PCR
realizada en tiempo real (PCR-RT).
 Elimina cualquier proceso post-PCR puesto
que monitoriza la progresión de la
amplificación en el momento en que ocurre.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 A diferencia de la PCR convencional que
mide la acumulación ADN al final de un
número predeterminado de ciclos, con PCRRT esto se hace durante el proceso de
amplificación usando fluorescencia.
 El aumento de la fluorescencia es
proporcional a la cantidad de ADN
formada.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 El proceso se puede automatizar fácilmente
usando un sistema que realice la
amplificación (termociclador) y que a su
vez sea capaz de leer fluorescencia.
 Dado que la amplificación y la detección
ocurren al mismo tiempo, el análisis es más
rápido que en la PCR en punto final.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 La incorporación de fluorescencia al
proceso de PCR se puede hacer de muy
diversas maneras, pero las más utilizadas
son:


Colorantes intercalados
Sondas marcadas.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 Las sondas marcadas: son secuencias de
oligonucleótidos que reaccionan por
complementariedad de bases con un
pequeño fragmento de la secuencia a
amplificar.
 Estas sondas están marcadas con moléculas
que emiten fluorescencia (fluoróforos)
cuando se produce la amplificación
específica.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 Las sondas se colocan en la reacción de
PCR junto con los otros reactivos y
solamente se detecta fluorescencia, si la
secuencia de interés está presente en la
muestra y hay amplificación.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 Las sondas fluorescentes más usadas son de
tres tipos:



sondas con actividad 5’ nucleasa (TaqMan)
molecular beacons y
Sondas FRET.
 Las tres se pueden aplicar en microbiología
clínica, aunque las sondas FRET son las
más complejas.
Sondas Taqman
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)
 Agentes intercalantes de ADN: otro
formato ampliamente utilizado.
 El mas empleado es el SYBR Green.


El SYBR Green no emite fluorescencia cuando
se encuentra en solución.
En presencia de ADN doble cadena, el SYBR
Green se intercala entre las cadenas de ADN
emitiendo así una señal fluorescente.
PCR A TIEMPO REAL
(PCR-RT)


Este fluorocromo se agrega a la reacción de
PCR junto con los otros reactivos.
Si en la reacción de PCR hay amplificación, el
SYBR Green se une al ADN de doble cadena
recién sintetizado en cada ciclo y va generando
un aumento en la señal de fluorescencia que es
proporcional a la cantidad de producto
generado durante la amplificación.
Aplicaciones de la PCR a tiempo real
en la microbiología clínica
 No difieren de las de la PCR convencional.
1 . Diagnóstico etiológico.
2 . Control del tratamiento con antimicrobianos.
3 . Caracterización genética de agentes
infecciosos. Genotipificación; identificación de
mutaciones determinantes de resistencias a
fármacos o de virulencia; epidemiología
molecular
Aplicaciones de la PCR a tiempo real
en la microbiología clínica
 No obstante, gracias a sus indudables
ventajas y a la sencillez de su empleo, la
PCR a tiempo real ha ido reemplazando la
PCR clásica
 Su aplicación se extiende a un número cada
vez mayor de agentes infecciosos,
implementándose progresivamente en la
rutina asistencial.
PCR:DIAGNOSTICO DE LA
GRIPE A
 El virus de la gripe A(H1N1) deriva de
diferentes linajes que han circulado en
cerdos en el último tercio del siglo XX.
 Se trataría de un ejemplo más del papel que
se sabe que desempeña este mamífero como
mediador en el reagrupamiento genético del
virus de la gripe A que posteriormente
acaba afectando a humanos.
PCR:DIAGNOSTICO DE LA
GRIPE A
 El análisis filogenético de los diferentes
fragmentos genómicos del virus A(H1N1)
muestra un cuádruple origen.
 En una fase final parece haberse producido
una modificación del virus porcino AH1N1
(linaje clásico porcino norteamericano,
linaje aviar norteamericano y linaje
humanoH3N2).
Obtención, conservación y
transporte de las muestras
 1. Tipos de muestras:

Con mejor rendimiento diagnóstico:
• frotis de nasofaringe
• lavado o aspirado nasofaríngeo

Menor rendimiento diagnóstico
• frotis nasal
• frotis faríngeo

Muestras inadecuadas
• moco
• saliva
Obtención, conservación y
transporte de las muestras
 2. Conservación y transporte


Períodos no superiores a 48-72 horas:
refrigeradas a 4º C. El transporte también será
refrigerado (acumuladores de frío).
Períodos superiores: congeladas,
preferiblemente a -70º C. Se recomienda
mantener la congelación durante el transporte.
Obtención, conservación y
transporte de las muestras
 3. Condiciones de bioseguridad

Para el transporte y la manipulación de las
muestras, se deben seguir las recomendaciones
específicas de un nivel de bioseguridad 2.
PCR-TR : GRIPE A
 Componente del virus que detecta:

Ácidos nucleicos, utiliza cebadores y sondas
específicos para detectar un fragmento del gen de la
hemaglutinina y de la proteína M2 de A(H1N1)v.
 Tipo de ensayo:

PCR a tiempo real.
 Tiempo de realización:

3-4 horas.
Amplificación de un RNA mediante transcripción inversa del RNA a
cDNA y posterior PCR con la DNA polimerasa de Thermus
thermophilus.
PCR-TR : GRIPE A
 Sensibilidad de la prueba:

No está suficientemente evaluada, y depende de
varios factores:
a) Del sistema de extracción del material genético del
virus a partir de la muestra
b) de la propia técnica: no todas las técnicas de PCR son
equivalentes
c) de la experiencia de cada laboratorio.
d) de la muestra a evaluar: tipo de paciente, situación
epidémica, etc.
PCR-TR : GRIPE A
 Especificidad de la prueba:



Igualmente, no está evaluada adecuadamente.
Depende del tipo de muestra y de la experiencia
de cada laboratorio.
En la actual situación epidémica, y en un
laboratorio de Microbiología experimentado,
puede asumirse que supera el 98%.
PCR-TR : GRIPE A
 Ventajas:
a)
b)
Sensible y específica.
Rápida, aunque esta dependerá:
a)Disponibilidad de equipos humanos organizados y
bien entrenados, y
b)Volumen de muestras a procesar.
c)
Algunas variantes técnicas permitirían la
cuantificación de la carga vírica.
PCR-TR : GRIPE A
 Inconvenientes:
a)
b)
c)
Requiere equipamiento específico.
Requiere de la existencia y disponibilidad de
microbiólogos bien entrenados.
Detecta genoma viral, pero no informa si
exista viabilidad del virus, por lo que no se
recomienda para monitorizar tratamientos, ni
evaluar la respuesta clínica.
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
 Detección de antígenos virales:




Permite una rápida obtención de resultados,
generalmente en unas pocas horas después de la
recepción de la muestra.
Resultados a menudo son difíciles de
interpretar.
La especificidad dependerá de la experiencia
del personal que los realice.
La sensibilidad suele ser baja.
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS

Métodos utilizados para la detección de los
antígenos virales directamente en la muestra
clínica:
• Inmunofluorescencia
• enzimoinmunoanálisis (EIA)

Antígenos virales utilizados: moléculas que se
sitúan en la superficie del virus,
• la hemaglutinina y
• la neuraminidasa,
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS


También pueden encontrarse en la superficie de
las células infectadas.
Es posible emplear otras proteínas menos
accesibles del virus como las nucleoproteínas,
que son menos variables.
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
 Se han comercializado técnicas:


Inmuno-cromatografía capilar y
Enzimoinmunoanálisis de membrana
 Posibilitan detectar virus gripales o sus
antígenos en pocos minutos y su lectura es
visual.
PRUEBAS RAPIDAS:DETECCION
VIRUS RESPIRATORIOS
 Amplia implantación en la asistencia
urgente y en el ámbito pediátrico
 No obstante, su utilidad se ve limitada
debido a su coste y bajas sensibilidad y
especificidad.
Diferentes Pruebas de detección rápida de
antígenos disponibles para virus gripales
GRACIAS