Técnica Histológica de Rutina

Técnica Histológica de Rutina
Prof. Iván Rebolledo
Esquema General
Microscopía
Microscopía Optica
Optica
Inmersión, perfusión
Formaldehido
Lavado en agua
Deshidratación :
alcoholes crecientes
xiloles
parafina. Congelación
Parafina :
8 - 12 µm
Desparafinación :
xiloles crecientes
Hidratación :
alcoholes decrecientes
Hematoxilina (H) y
Eosina (E)
Deshidratación :
alcoholes crecientes
xiloles
Permount.
Microscopía
Microscopía Electrónica
Electrónica
FIJACION
INCLUSION
Inmersión, perfusión
Glutaraldehido
Lavado en buffer PO4
Deshidratación :
acetonas crecientes
óxido propileno
Epon
MICROTOMIA
Grueso : 0.5-1.0 µm
Fino : 60 nm
COLORACION
Grueso : azul de
toluidina.
Fino : acetato de
uranilo y citrato de Pb
MONTAJE
Grueso : Permount.
Técnica histológica
Técnica histológica
Las células deben prepararse
adecuadamente
para
ser
analizadas
estructural
y
químicamente con instrumentos
ópticos o electrónicos. La serie de
procesos que incluyen la técnica
histológica corriente son : fijación,
inclusión, corte, tinción y montaje.
1. Fijación
1. 1. Propósito de la fijación :
Es el procedimiento destinado
a preservar la estructura y
composición química de la célula,
lo más cercano a su estado vivo; en
otras palabras, se trata de utilizar
soluciones químicas que minimicen
las alteraciones estructurales y
químicas que normalmente se
producen como consecuencia de la
muerte celular. Además, la fijación
tiene como finalidad proteger las
estructuras celulares contra daños
en los procedimientos posteriores
(inclusión, corte y tinción).
1. 2. Mecanismo de acción de la
fijación :
La mayoría de los fijadores son
soluciones que actúan sobre las
porciones proteicas de la célula. El
buen fijador debe ser aquel que
precipite las proteínas lo más fino
posible, para que el aspecto celular
no se modifique. Por ejemplo, el
fijador más comúnmente usado en
MO es el formol o formalina.
La formalina tiene como fórmula
H-CHO, la cual es capaz de
reaccionar con los grupos amino y
carboxilo
de
las
proteínas,
produciendo uniones metilénicos
con otras moléculas proteicas, así,
las proteínas precipitan formando
mallas.
La desventaja de este mecanismo
de acción molecular es que puede
extraer sustancias químicas vitales
para estudios histoquímicos, por
ejemplo, el glucógeno de las células
hepáticas; esto se obvia eligiendo
otra solución fijadora.
En conclusión, la elección del
fijador debe estar de acuerdo con el
propósito de la experimentación.
1.3. Características de un fijador :
1.3.1. El fijador penetra en el trozo
del tejido por difusión, de manera
que se produce una gradiente de
concentración del fijador, que
depende de varios factores :
h capacidad de penetración del
fijador (tamaño molecular)
h grosor del tejido (óptimo para
MO es de 0.5 cm; para ME es de
0.5 mm).
h proporción volumétrica fijador
versus tejido (óptimo es 20:1)
1.3.2. El pH del fijador es una de
las constantes que la célula debe
mantener dentro de un rango muy
estrecho, ya que de él depende que
Técnica histológica
Se efectúen las funciones vitales
(respiración, metabolismo, etc.) en
forma normal. Para obtener una
solución fijadora con un pH
deseado, se utiliza una solución
llamada Buffer o tampón, que tiene
la propiedad de mantener un pH
determinado. Un buffer puede ser
orgánico (acetato o cacodilato de
sodio) o inorgánico (fosfato de
sodio) En la práctica se utiliza un
instrumento llamado pHímetro
para medir el pH de la solución
buffer.
1.3.3. La solución fijadora debe
tener una osmolaridad adecuada al
tejido que se estudiará, es decir, la
solución fijadora debe tener una
concentración muy similar a los
líquidos que bañan las células o
tejidos. Esto es muy importante
puesto
que
así
se
evitan
desplazamientos de líquidos de
mayor a menor concentración, que
puedan provocar deformaciones de
la célula. En la práctica se utiliza
un
instrumento
llamado
osmómetro, para medir esta
variable. Si una solución fijadora
está muy concentrada puede
agregarse agua destilada o si está
muy diluida puede agregarse
sacarosa o glucosa.
1.3.4. Al elegir un fijador se debe
tener en cuenta el costo, la
estabilidad en el tiempo y la
facilidad de manejo.
1.4. Forma de aplicar un fijador :
en la práctica se utilizan dos
métodos para aplicar un fijador a
un tejido : inmersión o perfusión.
1.4.1. Inmersión : es la forma más
común de fijar un tejido, consiste
en extraer el tejido, cortarlo en
trozos pequeños y sumergirlo en la
solución fijadora, por un tiempo
determinado, de acuerdo a las
características del fijador y del
tejido.
1.4.2. Perfusión : consiste en hacer
circular la solución fijadora por los
vasos sanguíneos de un animal
anestesiado,
con
los
medios
operatorios adecuados. De esta
manera, el fijador puede llegar en
corto tiempo a la intimidad del
tejido elegido. Es un procedimiento
que fija in situ. Se utiliza con
frecuencia en la fijación del
encéfalo, cuando aún se encuentra
dentro del cráneo.
1.5. Algunos fijadores utilizados:
1.5.1. En MO :
Ú formaldehido
Ú alcohol etílico
Ú ácido acético
Ú ácido pícrico
Ú cloruro de mercurio
1.5.2. En ME :
ª glutaraldehido
ª tetróxido de osmio
ª paraformaldehido
ª permanganato de potasio
Técnica histológica
2.2. Medios de inclusión :
2. Inclusión
Los tejidos biológicos requieren
técnicas
especiales
para
ser
seccionados en cortes finos, previo
a su observación con el MO (± 10
µm de grosor) o con el ME (± 60 nm
de grosor). Para esto, los tejidos
deben adquirir una consistencia
adecuada, que se logra congelando
los tejidos o incluirlos en una
sustancia que reemplace el agua
que contiene.
Así, la inclusión es el procedimiento mediante el cual se
introducen tejidos previamente
fijados y deshidratados en medios
líquidos o semifluídos que, al
solidificarse, proporcionan al tejido
una consistencia tal que permita
ser cortado en láminas finas.
Además, la inclusión permite que
los tejidos puedan ser manipulados
con facilidad y almacenarse por
tiempo indeterminado.
2.1. Deshidratación :
Previo a la inclusión en un medio
determinado, que generalmente es
insoluble en agua, los tejidos deben
ser deshidratados. Para esto se
introducen en una serie (batería)
de alcoholes (MO) o acetonas (ME)
crecientes, como lo siguiente :
H2O
50
70
80
Para MO se utiliza con frecuencia
la parafina, que es una mezcla de
hidrocarburos sólidos extraídos de
la destilación del petróleo. Se
caracteriza por tener un punto de
fusión entre 35 y 65 ºC. Es
insoluble en agua y alcohol, de
aquí la necesidad que los tejidos
sean tratados previamente con
xiloles.
Terminado este proceso, se hacen
los bloques que serán llevados al
micrótomo,
utilizando
moldes
especiales y orientando el tejido de
acuerdo a la forma conveniente
para su observación. Se deja
enfriar la parafina para que se
forme el bloque, se recortan los
excesos y se monta en una platina
especial o en un taco de madera,
para instalarlo en el micrótomo.
Para ME se utiliza con frecuencia
la inclusión a EPON. El medio de
inclusión está compuesto por una
resina, un endurecedor y un
acelerador. La dureza del bloque de
Epon se logra variando las
cantidades de los endurecedores, a
fin de obtener una dureza que esté
de acuerdo con el propósito de la
investigación.
95
100
X
P
Técnica histológica
Los tejidos ya deshidratados con
la batería de acetonas crecientes,
se pasan a mezclas crecientes de
Epon acetona y se introducen en
unos
pequeños
recipientes
cilíndricos de plástico llamados
cápsulas de BEEM, llenos de
resina. Se dejan en una estufa a 60
ºC por 1-3 días. Se extrae el bloque
de la cápsula para tallarlo y
obtener los cortes gruesos y finos.
Cuchilla de vidrio
Baño de plástico
Pegamento
Baño de metal
Diamante
2.3. Método de congelación :
Se utiliza en histoquímica, en la
cual deben conservarse las enzimas
celulares sin ser alteradas o
extraídas por los líquidos fijadores
o deshidratadores. Consiste en
enfriar los tejidos frescos hasta su
congelación, sumergiéndolos en
una sustancia refrigerante, como el
nitrógeno líquido. Es muy útil en
los diagnósticos urgentes durante
una intervención quirúrgica.
3. Microtomía
Los tejidos fijados e incluídos (y
los congelados) deben someterse al
proceso de corte, con el fin de
obtener láminas delgadas que
puedan
ser
observadas
por
transparencia con el MO ó el ME.
3.1. Cuchillas :
Para MO se utilizan cuchillas de
acero y para ME las de vidrio y
diamante.
Cuchilla de diamante
3.2. Micrótomos :
Este es el nombre que reciben
los instrumentos destinados a
obtener cortes delgados del tejido.
En MO es frecuente el uso del
micrótomo rotatorio, el cual
mediante una rueda con acción
manual o automática, puede
moverse el bloque contra la
cuchilla o a la inversa. Otro
micrótomo usado en MO es el
micrótomo de deslizamiento, en el
cual se desliza la cuchilla sobre
unos rieles rebanando finamente
un bloque fijo en el centro del
instrumento.
Los
cortes
de
congelación se obtienen en un
micrótomo que mantiene temperaturas bajas : es el crióstato.
Técnica histológica
En ME es frecuente el uso del
ultramicrótomo, cuyo avance puede
ser mecánico o térmico. Los cortes
se reciben sobre un baño de agua.
4. Tinción
La finalidad de la tinción o
coloración es aumentar el contraste
de
las
estructuras
celulares
mediante la adición de compuestos
coloreados que tiene propiedades
selectivas por determinadas zonas
del tejido. Generalmente son
compuestos orgánicos (azul de
toluidina)
o
inorgánicos
(ferrocianuro de potasio) y en
cuanto al origen pueden ser
naturales
(hematoxilina)
o
sintéticos (eosina).
4.1. Mecanismo de acción de los
colorantes :
Cuando las propiedades de
tinción de un colorante se localizan
en un radical básico de su
molécula, se dice que el colorante
es básico y las estructuras que lo
captan se llaman basófilas, en este
caso, dichas estructuras poseen
radicales ácidos.
Ejemplo :
El núcleo de una célula contiene
ADN cuya naturaleza química es
ácida.
Los
ribosomas
del
citoplasma contienen ARN cuya
naturaleza química es ácida. El
colorante utilizado para teñir el
núcleo y los ribosomas posee el
color en su radical básico. Al
añadir el colorante al tejido, el
radical básico del colorante se une
al radical ácido del ADN y ARN.
Así el radical ácido del ADN y ARN
atraen el radical básico del
colorante, por esto se dice que
estas estructuras son basófilas
Cuando las propiedades de tinción
de un colorante se localizan en un
radical ácido de su molécula, se
dice que el colorante es ácido y las
estructuras que lo captan se
llaman acidófilas, en este caso,
dichas
estructuras
poseen
radicales básicos.
Colorante
Estructura
Colorante
Estructura
Color en su
radical básico
Estructura con
radicales ácidos
Color en su
radical ácido
Estructura con
radicales básicos
Colorante
básico
Estructura
basófila
Colorante
ácido
Estructura
acidófila
Técnica histológica
Ejemplo :
Ejemplo :
El citoplasma de une célula del
estómago llamada parietal se tiñe
de rojo con colorantes ácidos. La
baturaleza química del citoplasma
es básica. El colorante utilizado
para teñirlo es la eosina que posee
el color en su radical ácido. Así, los
radicales básicos del citoplasma
atraen los radicales ácidos del
colorante, se dice que la estructura
es acidófila.
El azul de toluidina se tiñe de
púrpura en contacto con gránulos
azurófilos de los macrófagos, lo que
indica
que
poseen
grandes
cantidades
de
heparina
(un
mucopolisacárido sulfatado).
Los
colorantes
aparecen
coloreados debido a que pueden
absorber un cierto rango de
longitud de onda del espectro de la
luz visible (400-650 nm). Por
ejemplo, el ácido pícrico que tiñe
estructuras de color amarillo, es
capaz de absorber todos los colores
excepto el amarillo, que se
transmite por el tubo ocular del
microscopio hasta llegar a la retina
del observador.
Hay ocasiones en que un
colorante puro puede absorber una
longitud
de
onda
diferente
dependiendo de su concentración.
Es el caso del azul de toluidina
que transmite en el color azul a
bajas concentraciones y transmite
en color púrpura al encontrarse en
altas
concentraciones.
Este
fenómeno se llama metacromasia.
Cuando el colorante se concentra
es que hay un exceso de materiales
químicos en un lugar determinado.
4.2. Hematoxilina :
Es el colorante más utilizado en
las técnicas histológicas de rutina.
Su popularidad viene de su
capacidad de teñir diferentes
estructuras tisulares, su amplia
aplicabilidad a diferentes tejidos y
la facilidad de preparación. Es
extraída de la corteza de un árbol
llamado
Palo
de
Campeche,
originario del estado Campeche en
México.
La hematoxilina per se no tiñe,
sino que es su producto de
oxidación llamado hemateína la
que
tiñe.
La
oxidación
o
maduración puede producirse en
forma natural exponiéndola al aire
y luz, o en forma química usando
yodato sódico La oxidación natural
puede requerir días o meses, en
cambio, la química es instantánea.
Para que la hemateína pueda
teñir fuertemente, se requiere de
un mordiente, una sustancia
química que facilite la fijación del
colorante sobre las estructuras
celulares.
Técnica histológica
4.3. Eosina :
Es el colorante ácido más
ampliamente usado, debido a que
con una diferenciación adecuada,
puede
teñir
citoplasmas
de
diferentes tipos de células y teñir
diferentes tipos de fibras del tejido
conectivo. Hay varios tipos de
eosinas, todas ellas son xantenos y
de ellas la más común es la Eosina
Y ó simplemente eosina, que es
soluble en agua y alcohol. Se usa
en bajas concentraciones : 0.5 a 1.0
% en agua destilada. La tinción con
Eosina ocurre en el frasco
respectivo y en los siguientes
frascos con alcohol ocurre una leve
diferenciación
(extracción
del
exceso de colorante).
4.4. Método de coloración en MO :
La mayoría de los colorantes se
disuelven en agua, de aquí que los
cortes de parafina deben someterse
previamente a una desparafinación
pasándolos por varios xiloles y
luego deshidratándolos, pasándolos
por varios alcoholes decrecientes
(100º, 95º, 80º, 70º, y 50º) y luego
agua.
X
X
100
95
Luego,
se
introducen
los
portaobjetos que contienen los
cortes adheridos, al frasco que
contiene
la
Hematoxilina,
posterior-mente se lavan para
extraer el exceso de colorante y a
continuación se introducen en el
frasco que contiene la Eosina.
4.5. Método de coloración en ME :
Para ME los cortes gruesos (0.5 a
1.0 µm) de Epon pueden ser
teñidos directamente con Azul de
Toluidina (colorante básico) para
obtener una orientación general
del tejido objetivo de estudio. El
mismo bloque debe ser retallado
para dejar el mínimo de sector de
tejido que se estudiará al ME. Los
cortes finos (±60nm) se recogen
sobre grillas de cobre (3 mm Ø) y
se tiñen con acetato de uranilo y
citrato de plomo. El propósito de
añadir estos metales pesados es
que puedan depositarse sobre las
estructuras y desvíen los rayos
electrónicos,
dando
así
un
contraste al tejido.
80
70
50
H2O
Técnica histológica
Grilla o
rejilla
5. Montaje
Los cortes de parafina ya se
encuentran montados sobre una
lámina de vidrio (portaobjetos).
Para un examen al MO debe
cubrirse con otra lámina de vidrio
más delgada que la anterior
(cubreobjetos). Se utiliza una
sustancia llamada Permount que
permite
pegar
en
forma
permanente ambas láminas de
vidrio. Como esta sustancia es
insoluble en agua, los tejidos deben
ser deshidratados, pasando por
una batería de alcoholes crecientes
(50º, 70º, 80º, 95º y 100º). Por
último, se pasan por xiloles y
depositando una gota de Permount
sobre el tejido,se coloca un
cubreobjetos
aplastándola
suavemente.
H2O
50
70
80
95
100
X
X