Química Biológica TP 1: ESPECTROFOTOMETRIA . Introducción

Universidad Nacional de la Patagonia S. J. B
Facultad de Ciencias Naturales
Química Biológica
Química Biológica
TP 1: ESPECTROFOTOMETRIA
.
Introducción
Al observar una solución acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloración, la cual se
debe a la interacción entre las moléculas del colorante y la luz que atraviesa la disolución. Además en
caso de tener varias soluciones de distintas concentraciones es posible determinar un gradiente de
concentración a partir de la intensidad de la coloración. Estas observaciones dan origen a una serie de
prácticas analíticas llamada Espectrofotometría, basada
en la interacción de las moléculas y las
radiaciones electromagnéticas.
Una radiación electromagnética se puede describir como un flujo de partículas llamadas fotones, o bien
como una onda propagándose en el espacio. De esta última descripción se toma el concepto de longitud
de onda, definiéndolo como la distancia entre dos máximos consecutivos de la onda. La longitud de onda
es inversamente proporcional a la energía de la misma, de tal manera que el espectro de radiaciones
electromagnéticas abarca un amplio rango de energías, las de menor energía son las ondas de radio y las
de mayor energía son las llamadas radiación gamma.
El estado energético de una molécula se puede alterar por la absorción de radiación electromagnética a
determinada longitud de onda, lo que se puede medir para realizar un estudio cuali o cuantitativo, este
fenómeno es el fundamento de la espectrofotometría. Cuando un haz de luz incide sobre un medio
homogéneo parte de la radiación es absorbida y parte transmitida, la fracción de luz que se absorbe y se
transmite dependerá de la cantidad de moléculas presentes en el medio (de la concentración) los que nos
permite cuantificar una sustancia
Las principales ventajas de la espectrofotometría son:
• Sensibilidad relativa elevada.
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• Facilidad para realizar mediciones rápidas.
• Grado de especificidad relativamente elevado.
Para obtener la máxima sensibilidad en una determinación debe conocerse la longitud de onda de mayor
absorción de la sustancia analizada, que no deberá coincidir con una alta absorción de otras sustancias
presentes en la reacción.
Sea I la intensidad de una radiación que atraviesa un medio homogéneo, parte de la radiación es
absorbida por la muestra y otra parte es transmitida, ambas con una intensidad, i, de tal manera que se
define transmitancia de una muestra como la relación entre la radiación transmitida i versus la intensidad
luminosa incidente I, multiplicado x 100:
% T = ( i / I) x 100
La absorbancia es una medida de la cantidad de Energía luminosa incidente absorbida por una sustancia
en solución. Está relacionada con Transmitancia por medio de :
A= - Log T
A= log ( 100 / %T)
La Ley de Lambert y Beer expresa que la absorbancia de una solución es directamente proporcional al
camino recorrido por la radiación electromagnética y a la concentración de la solución.
A= abc
A: absorbancia
a: absortividad específica de cada soluto
b: distancia recorrida por el haz de luz en cm
c: concentración de la solución
La absortividad es la constante de proporcionalidad que nos permite igualar la ecuación, sus unidades
dependerán de b y c, ya que la absorbancia no tiene unidades; si b está en centímetros y c en moles por
litro, la absortividad estará en litros / mol centímetro y se denomina coeficiente de absorción molar (E).
Requerimientos para poder aplicar la Ley:
- La medición del % de T es realizada con luz monocromática
- La medición del % de T es realizada a una región de absorción del componente a estudiar.
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- La referencia es elegida de tal manera que C=0 cuando T= 100% o A= 0%
- La naturaleza de la solución debe ser tal que su transmisión responda a variaciones de C.
Espectrofotómetro
Los aparatos de medida de la absorción de la radiación electromagnética se denominan
espectrofotómetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:
La luz procedente de la fuente se hace pasar a través del monocromador, que la desdobla en haces
monocromáticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y según su abertura se obtiene luz de
una determinada longitud de onda.La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la
posición del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide
sobre el fototubo, donde se detecta. La señal se envía a un registrador, el cual puede ser la escala de un
galvanómetro calibrado.
Calibración del espectrofotómetro
Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen
temperatura.
Elegir la longitud de onda deseada con el selector.
Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en reemplazo del tubo
Espectro de absorción
Consiste en un gráfico que representa el % T o la Absorbancia en función de la Longitud de onda a la cual
se realiza la medición, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma concentración c de
la muestra.
Permite determinar las longitudes de onda óptimas de absorción y las concentraciones adecuadas de
trabajo. La longitud de onda optima será aquella en el que el valor de absorbancia sea máximo
Los pasos para realizar un espectro de absorción son:
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Seleccionar la longitud de onda.
Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.
Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.
Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.
Graficar Absorbancia vs longitud de onda y seleccionar aquella donde la A sea máxima.
Curva de calibración
Permite determinar la concentración de una muestra incógnita. Consiste en medir una serie de soluciones
concentración conocida de la sustancia de la muestra incógnita. Se grafican esos puntos y se emplea dicho
grafico para calcular la muestra problema.
Los pasos para realizar una curva de calibración son:
Medir la A de las soluciones de concentración conocida.
Medir la A de la muestra problema.
Graficar Absorbancia vs. concentración.
Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el gráfico será una recta y será posible sacar un
factor ya que la pendiente de la recta será la misma en todos los puntos. Así se podrá calcular la
concentración de la muestra problema.
Si la sustancia no cumple la Ley, el gráfico será una curva y se extrapolará dentro de un rango apropiado
para calcular el valor de la muestra problema.
Parte experimental
Objetivos
- Aprender el uso del espectrofotómetro.
- Realizar espectro de absorción de sustancias puras: soluciones de azul de metileno.
- Realizar una curva de calibración para determinar la concentración de una muestra problema de azul
de metileno.
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Actividades:
1- Espectro de absorción de solución de azul de metileno
Utilizar la solución de azul de metileno de 5mg/l.Llevar a cero de absorbancia con agua destilada antes
de realizar cada lectura en el espectrofotómetro. Medir las absorbancias a distintas longitudes de onda,
con intervalos de 20 nm, desde 500 nm hasta 700 nm y cada 10 nm entre 600 y 700 nm.
Graficar curva de absorbancia versus longitud de onda.
Observar cuál es la longitud de onda de mayor absorción que se utilizará para realizar la curva de
calibración y determinar la concentración de una muestra problema.
2- Curva de calibración
A partir de la solución patrón de 5 mg/l realizar cinco diluciones: 1/2; 1/4; 1/5; 1/6; 1/8; 1/10; 1/15.
Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar absorbancia versus
concentración.
Determinar con la gráfica anterior la concentración de la muestra problema.
Problemas
1- El coeficiente de absorción específico de una proteína es de 6 dl/g.cm. Calcúlese la concentración
en mg/ml si una solución de ésta presenta una absorbancia de 0,82 en una cubeta de 1 cm .
2- Un barbitúrico presenta un máximo de absorbancia a 245 nm en un medio fuertemente alcalino.
Trabajando con una celda de 1 cm de espesor se obtienen los siguientes datos:
concentración (M)
Absorbancia
-5
0,179
4,10 x 10-5
0,356
8,20 x 10-5
0,718
-5
1,430
2,05 x 10
16,40 x 10
Determinar si cumple la ley de Lambert y Beer.
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3- Una solución que contiene 2 gr/l de una sustancia, transmite el 75% de la luz incidente en una
cubeta de 1 cm a una determinada longitud de onda. Calcular la transmitancia de una solución que
contenga 4 gr/l y la absorbancia de una solución que contenga 6 gr/l.
4- Al realizar un espectro de absorción de proteínas, se encontraron las siguientes absorbancias:
Longitud de onda (nm)
Abs
240
0,100
250
0,099
260
0,170
270
0,245
280
0,290
290
0,198
300
0,171
310
0,115
Graficar y determinar la longitud de onda que utilizaría para medir proteínas.
5- Calcular la concentración de una muestra problema de hemoglobina sabiendo que presenta a 540
nm una absorbancia de 0,45. En la curva de calibración se obtuvieron los siguientes datos:
Absorbancia
Concentración ( g/ dl)
0,37
11
0,404
12
0,438
13
0,472
14
0,505
15
Determinar si el compuesto cumple con la Ley de Lambert y Beer a esa longitud de onda.
6- En una muestra de suelo se determinó nitritos por un método colorimétrico. La absorbancia de la
muestra a 540 nm fue de 0,52. En la curva de calibración se encontraron los siguientes valores:
Absorbancia
Concentración ( ug/ ml)
0,23
0,20
0,47
0,40
0,65
0,60
0,90
0,80
Determinar la concentración de nitritos en la muestra.
Es posible sacar un factor para determinar nitritos en próximas muestras? Justificar.
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