syphagen TPHA

READ HIGHLIGHTED CHANGES
syphagen TPHA
Indirect hemagglutination test for the detection of specific
antibodies to Treponema pallidum in human serum or
plasma.
Principle
Stabilized chicken erythrocytes are sensitized with an antigenic extract of Treponema
pallidum (Nichols strain). These cells will agglutinate with specific antibodies present in
either the serum or plasma of syphilitic patients.
Non-specific reactions are detected by the unsensitized control reagent.
Non-pathogenic treponemal antibodies are absorbed by an extract of Reiter’s treponemes
included in the diluent solution.
Components
REF 300615700.
a)
b)
c)
d)
e)
Antigen reagent: 1 x 15 ml.
Suspension of sensitized chicken erythrocytes. Ready to use. Contains < 0.1% sodium
azide.
Control reagent: 1 x 15 ml.
Suspension of unsensitized chicken erythrocytes. Ready to use. Contains < 0.1%
sodium azide.
Diluent solution: 1 x 50 ml.
Phosphate buffered saline solution containing soluble components of T. Reiter and
stabilizing agents. Contains < 0.1% sodium azide.
Positive control: 1 x 2.5 ml.
Immune rabbit serum. Prediluted to 1:20. Refer to the vial label for titer and acceptable
range. Contains < 0.1% sodium azide.
Negative control: 1 x 2.5 ml.
Normal rabbit serum. Prediluted to 1:20. Contains < 0.1% sodium azide.
Precautions
syphagen TPHA is intended for IN VITRO diagnostic use.
The reagents contain sodium azide as a preservative. Azides may react with metal plumbing
forming explosive components. Upon disposal, please flush abundantly with water.
Dispose all used materials in a suitable biohazardous waste container.
Hazard class
Not classified.
Hazard statements
None.
Precautionary statements
P280: Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
P305+351+338: IF IN EYES rinse cautiously with water for several minutes. Remove contact
lenses, if present and easy to do. Continue rinsing.
Storage
The reagents will remain stable until the expiration date shown on the label if stored at
2-8°C. Do not freeze.
Material required not provided
BIOKIT, S.A. - www.biokit.com
Can Malé s/n - 08186 Lliçà d'Amunt - Barcelona - Spain
Round-bottom microtiter plates (U-shapped), automatic pipettes.
Sample collection
Serum:
3800-1645
R01 04/15
28
Use fresh serum. Serum may be stored at 2-8°C for 5 days. For longer periods serum
samples should be frozen (-20°C).
1
Plasma:
Although serum is the specimen of choice for all tests for syphilis, for screening purposes in
blood banks, EDTA plasma samples may be used. Other anticoagulants should be
evaluated before use. Plasma can be stored at 2-8°C and tested within 72 hours of blood
collection.
PROCEDURE
Quality control: Before performing a set of determinations it is advisable to test the
reagents with each of the controls included in the kit, following the steps outlined
in the corresponding section. If expected results are not obtained, do not use
the kit.
QUALITATIVE TEST
Allow the reagents to reach room temperature.
Ensure that antigen and control reagents are throughly resuspended.
Each test requires 4 wells, 2 of which will be used for sample dilution. See Table 1.
1.
Add 25 µl of diluent to well 1, 100 µl to well 2 and 25 µl to each of wells 3 and 4.
2.
Add 25 µl of sample to well 1. Mix the contents of well 1 and transfer 25 µl to
well 2.
Mix and transfer 25 µl from well 2 to well 3, mix and discard 25 µl from well 3.
Transfer a further 25 µl from well 2 to well 4, mix and discard 25 µl from well 4.
3.
Add 75 µl of control reagent to well 3 and 75 µl of antigen reagent to well 4.
4.
Mix the contents of the wells by tapping the sides of the plate or by using a plate shaker
for at least 30 seconds.
5.
Cover the plate and incubate for 45-60 minutes at room temperature. Avoid any source of
vibration and keep away from heat.
6.
Read results.
Use of controls:
Include the positive and negative controls in each series of samples taking into account that
the controls are prediluted to 1:20. Add 25 µl of each control directly into wells 3 and 4. Do
not add any diluent solution.
Well no.
1
2
3
Control
4
Test
Diluent solution µl
25
100
25
25
Sample µl
25
25
Mix and
Transfer µl
Sample dilution
25 
25 
25
25
1:2
1:10
1:20
1:20
Control reagent µl
-
-
75
-
Antigen reagent µl
-
-
-
75
1:80
1:80
Final dilution
INCUBATE FOR 45-60 MINUTES AT ROOM TEMPERATURE
Table 1
2
27
QUANTITATIVE TEST
Qualitative test
Wells 1-4 standard procedure
Each test requires 8 wells. Use the 1:10 sample dilution prepared for the initial qualitative
test (well 2). See Table 2.
Wells 1-3 optional procedure
Well no.
1
2
3
4
Well no.
Diluent solution µl
25
100
25
25
Diluent solution µl
190
Sample µl
25
Sample µl
10
Mix and transfer 25 µl
1
2
3
1:20
1:20
75
Mix and transfer 25 µl
Sample dilution
1:2
1:10
1:20
Control reagent µl
1:20
Sample dilution
75
Control reagent µl
Antigen reagent µl
75
Final dilution
1:20
1:80
Final dilution
1:80
Wells 1-4 Qualitative test
Wells 5-12 Quantitative test
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Diluent solution µl
25
100
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
Sample µl
25
1:40
1:80
75
75
Mix and transfer 25 µl
Control reagent µl
1:640 1:1280 1:2560
1:5120
75
Antigen reagent µl
75
Final dilution
75
75
3.
Add 75 µl of antigen reagent to wells 1-8.
4.
Mix the contents of the wells by tapping the sides of the plate or by using a plate shaker
for at least 30 seconds.
5.
Cover the plate and incubate for 45-60 minutes at room temperature. Avoid any source of
vibration and keep away from heat.
6.
Read results.
Use of positive control:
Well no.
1:160 1:320
Transfer 25 µl of the 1:10 sample dilution made in the qualitative test to well 1. Mix the
contents of well 1 and transfer 25 µl to well 2. Mix and continue this preparation of serial
two-fold dilutions through well 8. Discard 25 µl from well 8.
NOTE: If the qualitative test has not been performed, perform dilutions as in the qualitative
test. Then, add 25 µl of diluent to wells 5 to 12. Mix and transfer 25 µl from well 4 to 5 and
continue this preparation of serial two-fold dilutions through well 12. Discard 25 µl from well
12. Add 75 µl of control reagent to well 3 and 75 µl of antigen reagent to wells 4-12. Perform
next steps as in the quantitative test.
Qualitative (4 wells) / Quantitative test
1:2 1:10 1:20 1:20
2.
1:80
Table/Tabla/Tabelle/Table/Tabella/Tabela 1
Sample dilution
Add 25 µl of diluent to wells 1 to 8.
75
Antigen reagent µl
1:80
1.
75
75
75
75
1:80 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 1:20480
Include the positive control in each series of samples taking into account that it is prediluted to 1:20.
See Table 3.
Add 25 µl of diluent to wells 2 to 8. Add 50 µl of control directly into well 1. Do not add any
diluent in this well. Transfer 25 µl from well 1 to well 2, mix and continue as in the
quantitative test.
Reading of the results
4+ : Smooth mat of agglutinated cells covering the entire bottom of the well,
sometimes with folded edges.
3+ : Smooth mat of agglutinated cells partially covering the bottom of the well.
2+ : Smooth mat of agglutinated cells surrounded by a ring of cells.
Table/Tabla/Tabelle/Table/Tabella/Tabela 2
1+ : Smooth mat of agglutinated cells surrounded by a heavy ring of cells.
Positive control - Quantitative test
± : Button of cells with a small central opening.
 : Button of cells with or without a very small hole in the center.
Well no.
1
2
3
4
5
6
7
8
25
25
25
25
25
25
25
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
75
75
75
75
Diluent solution µl
Positive control 1:20
Positive
: from 4+ to 1+
Borderline : ±
Negative : 
50
NOTE: Any agglutination seen in the control well (well 3) indicates the presence of
non-specific agglutinins. Although non-specific reactions are very rare using chicken
erythrocytes, a sample giving this result can not be interpreted with this kit.
Mix and transfer 25 µl
Sample dilution
Antigen reagent µl
Final dilution
1:80 1:160
75
1:320
1:640 1:1280 1:2560
75
1:640 1:1280 1:2560
75
75
1:5120
1:10240
Interpretation of the results
The negative control should give a negative result.
The positive control should give a positive result in the qualitative test. For the quantitative
test, refer to the vial label for titer and acceptable range.
Table/Tabla/Tabelle/Table/Tabella/Tabela 3
Qualitative test:
A positive result (1:80 final dilution or higher) indicates the presence of antibodies to
T. pallidum, resulting from a past or present infection.
26
3
A negative result (1:80 final dilution) indicates the absence of antibodies to T. pallidum (see
limitations of the procedure).
A borderline result in the qualitative test may correspond to a low level of antibodies in early
stages of syphilis or to residual antibodies in treated syphilis. In this case a further sample
should be tested to demonstrate a rise in the antibody titer.
Quantitative test:
The approximate titer will correspond to the highest final dilution giving a positive reaction.
Teste qualitativo:
Um resultado positivo (diluição final 1:80 ou superior) indica a presença de anticorpos
anti-T. Pallidum, que resultam de uma infecção passada ou presente.
Um resultado negativo (diluição final 1:80) indica a ausência de anticorpos anti-T. Pallidum
(ver as limitações da técnica).
Um teste qualitativo com resultado duvidoso pode corresponder a um baixo nível de
anticorpos próprio dos estados iniciais da sífilis ou a anticorpos residuais de uma sífilis já
tratada. Neste caso, deve-se testar uma amostra posterior para demonstrar um possível
aumento no título de anticorpos.
Limitations of the procedure
Teste quantitativo:
-
O título aproximado corresponderá ao da diluição final mais alta que ainda apresente um
resultado claramente positivo.
-
Although serum is the specimen of choice for all tests for syphilis, for screening
purposes in blood banks, EDTA plasma samples may be used. However, some
incidence of false positive reactions has been reported. Therefore, serum must be
used for all repeat testing of initial positive or borderline results obtained from
plasma samples.
Specific antibodies may persist for a long period of time, even after successful
treatment of the disease. In order to assess the response to treatment, the use of a
reagin test (RPR reditest) is recommended.
The TPHA technique can give cross reactions with other forms of treponemal infections
and false positive reactions with samples from patients with infectious mononucleosis,
leprosy, autoimmune diseases and drug addiction.
Occasionally, in early primary syphilis, the specific antibodies could not be detected by
the TPHA technique.
Limitações do procedimento
-
-
Performance characteristics
Several evaluations have been performed with the syphagen TPHA kit. In one
evaluation performed in Germany, the specificity found was 99.6% in front of
695 negative samples (serum and plasma) including samples from patients of different
ages, of pregnant women, and also samples that can cause false positive reactions such
as lipemic and icteric samples, samples with auto-antibodies and from patients with
different infections. In the same evaluation the sensitivity was 100% in front of a panel of
191 known positive samples.
In a second evaluation performed in France, 100% of sensitivity and 100% specificity was
found in front of 55 positive and 201 negative serum samples, also including samples with
heterophile antibodies, rheumatoid factor, EBV and Borrelia.
In another evaluation, four commercially available TPHA assays and one TPPA assay
were evaluated to determine their ability to detect anti-treponemal antibodies. Of the
235 initially positive specimens used for the sensitivity calculation of syphagen
TPHA, 10 gave unspecific reaction with the control reagent, 4 gave indeterminate and
2 negative. The syphagen TPHA gave an initial sensitivity of 99.1% (223/225; 95%
confidence interval: 96.8 - 99.9) once excluded the unspecific specimens. After
retesting, 7 of the initially unspecific specimens gave positive and 3 of the
indeterminate specimens became negative, giving a final sensitivity of 97.8%
(227/232; 95% confidence interval: 95.0 - 99.3). The syphagen TPHA was the most
sensitive test among the TPHA kits studied.
Of the 235 positive specimens, 114 were from individuals of known disease stage and
treatment. One specimen gave unspecific with the control reagent and was excluded. The
following table indicates the distribution of the 113 remaining specimens (number of positive
by syphagen TPHA / total number of specimens).
Primary
Secondary
Early latent
Late latent
Untreated
Treated
Untreated
Treated
Untreated
Treated
Untreated
Treated
31/33
7/7
37/37
5/5
15/15
4/4
4/4
7/8
-
Se bem que o soro é a amostra geralmente escolhida para todos os testes de sífilis,
também podem ser utilizadas amostras de plasma EDTA para screening em bancos de
sangue. Não obstante e, dado que se observa uma relativa incidência de reações
falsamente positivas, debe-se repetir o teste daquelas amostras que, inicialmente,
derem resultado positivo ou duvidoso, utilizando, neste caso, o soro do paciente.
Os anticorpos específicos podem persistir durante um longo período de tempo,
inclusive após o tratamento da doença. Para avaliar a resposta ao tratamento,
recomenda-se utilizar testes reagínicos (RPR reditest).
A técnica TPHA pode apresentar reações cruzadas com outras formas de infecções
treponêmicas e apresentar reações falsamente positivas com amostras de pacientes afetados
por mononucleose, lepra e doenças auto-imunes, além de indivíduos adictos às drogas.
Ocasionalmente, nos estados iniciais da sífilis, os anticorpos específicos não podem
ser detectados pela técnica de TPHA.
Características funcionais
Foram realizadas várias avaliações com o kit syphagen TPHA. Em uma avaliação
realizada na Alemanha, se obteve uma especificidade de 99,6% ao analisar 695 amostras
negativas (soro e plasma), incluindo amostras de pacientes de diferentes idades, mulheres
grávidas e também amostras que podem produzir reações falso-positivas tais como soros
lipêmicos ou ictéricos, com auto-anticorpos e amostras de infecções diversas. Na mesma
avaliação foi obtida uma sensibilidade de 100% com um painel de 191 amostras positivas.
Numa segunda avaliação realizada na França, com um painel de 55 soros positivos e
201 negativos que incluia também amostras com anticorpos heterófilos, fator reumatóide,
EBV e Borrélia, a sensibilidade e a especificidade obtidas foram de 100%.
Em outra avaliação, 4 ensaios de TPHA disponíveis comercialmente e um ensaio de TPPA
foram avaliados para determinar a sua capacidade para detectar anticorpos anti-treponema.
Das 235 amostras inicialmente positivas usadas para o cálculo de sensibilidade do
syphagen TPHA, 10 mostraram reação inespecífica com o reativo controle, 4 deram
resultado indeterminado e 2 negativo. O syphagen TPHA mostrou uma sensibilidade inicial
de 99,1% (223/225; 95% intervalo de confiança: 96,8 - 99,9) uma vez excluídas as amostras
inespecíficas. Depois da recomprovação, 7 das amostras inicialmente inespecíficas
deram resultado positivo e 3 das amostras indeterminadas foram negativas, resultando uma
sensibilidade final de 97,8% (227/232; 95% intervalo de confiança: 95,0 - 99,3).
O syphagen TPHA foi o teste mais sensível entre os testes de TPHA estudados.
Das 235 amostras positivas, 114 eram de indivíduos com estádio da doença e tratamento
conhecidos. Uma amostra deu resultado inespecífico com o reativo controle e foi excluída.
O quadro seguinte indica a distribuição das 113 amostras restantes (número de positivas
com syphagen TPHA / número de amostras totais).
Primária
Secundária
Latente precoce
Latentetardia
Não tratada
Tratada
Não tratada
Tratada
Não tratada
Tratada
Não tratada
Tratada
31/33
7/7
37/37
5/5
15/15
4/4
4/4
7/8
Bibliografia
4
Ver “References” do texto inglês.
25
TESTE QUANTITATIVO
References
Para cada teste são necessários 8 pocinhos. Utilizar a diluição da amostra a 1:10 preparada
no teste qualitativo inicial (pocinho 2). Ver Tabela 2.
1.
Biosafety in Microbiological
5th Edition, 2007.
1.
Distribuir 25 µl de diluente nos pocinhos de 1 a 8.
2.
2.
Transferir 25 µl da diluição a 1:10 da amostra preparada para a técnica qualitativa ao
pocinho 1. Misturar o conteúdo do pocinho 1 e transferir 25 µl para o pocinho 2.
Misturar e continuar com esta preparação de diluições duplas seriadas até alcançar o
pocinho 8. Descartar 25 µl do pocinho 8.
Garner MF, Backhouse JL, Daskalopoulos G, Walsh JL. The Treponema pallidum
Haemagglutination (TPHA) in Biological False Positive and Leprosy Sera. J Clin Path
26: 258-260, 1973.
3.
Hagedorn HJ, Naumann P. Moderne Serodiagnostik der Syphilis. Dtsch med Wschr
104: 209-214, 1979.
4.
Larsen SA, Hambie EA, Pettit DE, Perryman MW, Kraus SJ. Specificity, Sensitivity, and
Reproducibility Among the Fluorescent Treponemal Antibody-Absorption Test, the
Microhemagglutination Assay for Treponema pallidum Antibodies, and the
Hemagglutination Treponemal Test for Syphilis. J Clin Microbiol 14: 441-445, 1981.
5.
Rathlev T. Haemagglutination Test Utilizing Pathogenic Treponema pallidum for the
Sero-diagnosis of Syphilis. Brit J Vener Dis 43: 181-185, 1967.
6.
Sequeira PJL, Eldridge AE. Treponemal Haemagglutination Test. Brit J Vener Dis
49: 242-248, 1973.
7.
Tomizawa T. Hemagglutination Tests for Diagnosis of Syphilis. A preliminary report. Jap J
Med Sci Biol 19: 305-308, 1966.
8.
Tomizawa T, Kasamatsu S, Yamaya S. Usefulness of the Hemagglutination Test Using
Treponema pallidum Antigen (TPHA) for the Serodiagnosis of Syphilis. Jap J Med Sci
Biol 22: 341-350, 1969.
9.
Cole M, Dean L, Perry KR, Parry JV. Five Syphilis Agglutination Assays. MHRA
Evaluation Report 04007, 2004.
3.
Acrescentar 75 µl de reativo antígeno nos pocinhos de 1 a 8.
4.
Misturar o conteúdo dos pocinhos dando leves golpes nas laterais da placa, ou utilizar
um agitador de placas durante, no mínimo, 30 segundos.
5.
Cobrir a placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar
qualquer movimento da placa, mantendo-a distante de fontes de calor.
6.
Ler os resultados.
NOTA: No caso de não se efetuar o teste qualitativo, deve-se preparar as diluições
como no teste qualitativo. A seguir, distribuir 25 µl de diluente nos pocinhos de 5 a
12. Misturar e transferir 25 µl do pocinho 4 ao 5 e continuar com esta preparação de
diluições duplas seriadas até alcançar o pocinho 12. Descartar 25 µl do pocinho 12.
Adicionar 75 µl do reativo controle no pocinho 3 e 75 µl do reativo antígeno nos
pocinhos de 4 a 12. Efetuar os passos seguintes, utilizando a teste quantitativo.
Utilização do controle positivo:
and
Biomedical
Laboratories.
CDC/NIH
manual,
Incluir o controle positivo em cada uma das séries de amostras tendo em conta que o
mesmo já foi previamente diluído a 1:20. Ver Tabela 3.
Adicionar 25 µl de diluente nos pocinhos 2 a 8. Adicionar 50 µl de controle diretamente no
pocinho 1. Não colocar diluente neste pocinho. Transferir 25 µl do pocinho 1 ao 2, misturar
e seguir o processo como na técnica quantitativa.
Leitura dos resultados
4+ : Manto homogêneo de células que cobre o fundo do pocinho, as vezes com
margens irregulares.
3+ : Manto homogêneo de células que cobre parcialmente o fundo do pocinho.
2+ : Manto homogêneo de células rodeado por um anel de hemácias.
1+ : Manto homogêneo de células rodeado por um evidente anel de hemácias.
± : Botão de hemácias com uma pequena abertura central.
 : Botão de hemácias com uma abertura central muito pequena ou botão
totalmente compacto.
Positivo
Duvidoso
Negativo
: de 4+ a 1+
:±
:
NOTA: Qualquer aglutinação que se observe no pocinho do reativo controle (pocinho 3)
indica a presença de aglutininas inespecíficas. Se bem que as reações inespecíficas sejam
pouco freqüentes quando se utilizam hemácias de frango, uma amostra que apresente este
tipo de reação não deve ser interpretada com este kit.
Interpretação dos resultados
O controle negativo deve dar resultado negativo.
O controle positivo deve dar resultado positivo no teste qualitativo. Para o teste quantitativo,
ver título e limite aceitável na etiqueta do frasco.
24
5
LEER CAMBIOS SOMBREADOS
Plasma:
syphagen TPHA
Test de hemaglutinación pasiva para la detección de
anticuerpos específicos anti-Treponema pallidum en suero
o plasma humano.
Principio
Los hematíes de pollo estabilizados se sensibilizan con un extracto antigénico de
Treponema pallidum (cepa Nichols). Estos hematíes aglutinarán con los anticuerpos
específicos presentes en el suero o plasma de pacientes afectos de sífilis.
Las reacciones no específicas se detectan con el reactivo control no sensibilizado.
Los anticuerpos del grupo Treponema no específicos de la sífilis se absorben con un
extracto de treponema Reiter incluido en la solución diluyente.
Se bem que o soro é a amostra geralmente escolhida para todos os testes de sífilis, também
podem ser utilizadas amostras de plasma EDTA para screening em bancos de sangue. Outros
tipos de anticoagulantes devem ser testados antes de serem usados. O plasma pode ser
conservado entre 2-8°C e deveria realizar-se o teste antes de passadas 72 horas da extração.
PROCEDIMENTO
Controle de qualidade: Antes de efetuar uma série de determinações é aconselhável testar
os reativos com cada um dos controles incluídos no kit, seguindo os passos descritos na
seção correspondente. Se os resultados esperados não são obtidos, não utilize o kit.
TESTE QUALITATIVO
Componentes
Deixar que os reativos alcancem a temperatura ambiente.
Comprovar que o reativo antígeno e o reativo controle estejam bem ressuspendidos.
Para cada teste são necessários 4 pocinhos, dos quais 2 serão utilizados para a diluição da
amostra. Ver Tabela 1.
REF 300615700.
1.
Distribuir 25 µl de diluente no pocinho 1, 100 µl no pocinho 2 e 25 µl nos pocinhos 3 e 4.
a)
2.
Acrescentar 25 µl da amostra no pocinho 1. Misturar o conteúdo do pocinho 1 e
transferir 25 µl para o pocinho 2.
Misturar e transferir 25 µl do pocinho 2 para o pocinho 3, misturar e descartar 25 µl do
pocinho 3.
Transferir outros 25 µl do pocinho 2 para o pocinho 4, misturar e descartar 25 µl do pocinho 4.
3.
Acrescentar 75 µl de reativo controle no pocinho 3 e 75 µl de reativo antígeno no pocinho 4.
4.
Misturar o conteúdo dos pocinhos dando leves golpes nas laterais da placa, ou utilizar
um agitador da placas durante, no mínimo, 30 segundos.
5.
Cobrir a placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar
qualquer movimento da placa, mantendo-a distante de fontes de calor.
6.
Ler os resultados.
b)
c)
d)
e)
Reactivo antígeno: 1 x 15 ml.
Suspensión de hematíes de pollo sensibilizados. Listo para su uso. Contiene < 0,1% de
azida sódica.
Reactivo control: 1 x 15 ml.
Suspensión de hematíes de pollo no sensibilizados. Listo para su uso. Contiene < 0,1%
de azida sódica.
Solución diluyente: 1 x 50 ml.
Tampón fosfato salino que contiene componentes solubles de T. Reiter y agentes
estabilizadores. Contiene < 0,1% de azida sódica.
Control positivo: 1 x 2,5 ml.
Suero de conejo inmune. Prediluido a 1:20. Ver el título y rango establecido en la
etiqueta del vial. Contiene < 0,1% de azida sódica.
Control negativo: 1 x 2,5 ml.
Suero de conejo no inmune. Prediluido a 1:20. Contiene < 0,1% de azida sódica.
Precauciones
syphagen TPHA es sólo para el diagnóstico IN VITRO.
Los reactivos contienen azida sódica como conservante. Las azidas pueden reaccionar con
tuberías y desagües metálicos dando lugar a compuestos explosivos. Al tirar los restos de
reactivos, dejar correr agua suficiente.
Depositar todos los materiales usados en recipientes adecuados para material biocontaminante.
Clase de peligro
No clasificado.
Indicaciones de peligro
Ninguna.
Consejos de prudencia
P280: Llevar guantes/prendas/gafas/máscara de protección.
P305+351+338: EN CASO DE CONTACTO CON LOS OJOS: Aclarar cuidadosamente con agua
durante varios minutos. Quitar las lentes de contacto, si lleva y resulta fácil. Seguir aclarando.
Utilização dos controles:
Incluir os controles positivo e negativo em cada série de amostras, tendo em conta que os
mesmos já foram previamente diluídos a 1:20. Adicionar 25 µl de cada um dos controles
diretamente nos pocinhos 3 e 4. Não acrescentar solução diluente.
Pocinho nº
1
2
3
Controle
4
Teste
Solução diluente µl
25
100
25
25
Amostra µl
25
25
25
25 
25 
Conservación
Misturar e
transferir µl
Los reactivos permanecerán inalterados hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta, si se almacenan entre 2 y 8°C. No congelar.
Diluição da amostra
1:2
1:10
1:20
1:20
Material necesario no incluido
Reativo controle µl
-
-
75
-
Placas de microtitulación con fondo en U (redondo), pipetas automáticas.
Reativo antígeno µl
-
-
-
75
Recolección de la muestra
Diluição final
1:80
1:80
Suero:
25
INCUBAR DURANTE 45-60 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE
Usar suero fresco. Los sueros pueden ser conservados durante 5 días entre 2 y 8°C. Si es
por un período de tiempo más largo los sueros deben ser congelados (-20°C).
6
Tabela 1
23
LER ALTERAÇÕES DESTACADAS
syphagen TPHA
Teste de hemaglutinação passiva para a detecção de
anticorpos específicos anti-Treponema pallidum no soro
ou plasma humano.
Princípio
Hemácias de frango estabilizadas são sensibilizadas com um extrato antigênico de
Treponema pallidum (cepa Nichols). Estas hemácias se aglutinarão com os anticorpos
específicos presentes no soro ou plasma daqueles pacientes afetados pela sífilis.
As reações inespecíficas são detectadas por meio do reativo controle não sensibilizado.
Os anticorpos do grupo Treponema não específicos da sífilis são absorvidos com um
extrato de treponema Reiter incluído na solução diluente.
Componentes
REF 300615700.
a)
b)
c)
d)
e)
Reativo antígeno: 1 x 15 ml.
Suspensão de hemácias de frango sensibilizadas. Pronto para usar. Contém < 0,1% de
azida sódica.
Reativo controle: 1 x 15 ml.
Suspensão de hemácias de frango não sensibilizadas. Pronto para usar. Contém
< 0,1% de azida sódica.
Solução diluente: 1 x 50 ml.
Tampão fosfato salino que contém componentes solúveis de T. Reiter e agentes
estabilizadores. Contém < 0,1% de azida sódica.
Controle positivo: 1 x 2,5 ml.
Soro imune de coelho. Pré-diluído a 1:20. Ver título e limite aceitável na etiqueta do
frasco. Contém < 0,1% de azida sódica.
Controle negativo: 1 x 2,5 ml.
Soro não imune de coelho. Pré-diluído a 1:20. Contém < 0,1% de azida sódica.
Precauções
syphagen TPHA é só para o diagnóstico IN VITRO.
Os reativos deste kit contém azida sódica como conservante. A azida sódica pode reagir
com encanamentos de esgoto que contenham chumbo ou cobre, originando azidas
metálicas altamente explosivas. Ao descartar os restos de reativos, fazê-lo em abundante
volume de água para evitar o acúmulo de azidas.
Descartar todos os materiais usados em recipientes adequados para material bio-contaminante.
Classe de perigo
Não classificado.
Advertências de perigo
Nenhuma.
Recomendações de prudência
P280: Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial.
P305+351+338: SE ENTRAR EM CONTACTO COM OS OLHOS: enxaguar
cuidadosamente com água durante vários minutos. Se usar lentes de contato, retire-as, se
tal lhe for possível. Continuar a enxaguar.
Plasma:
Aunque el suero es la muestra de elección para todos los tests de sífilis, pueden utilizarse
muestras de plasma EDTA para screening en bancos de sangre. Otros anticoagulantes
deben ser comprobados antes de utilizarse. El plasma puede ser conservado entre 2-8°C y
debe realizarse el test antes de transcurridas 72 horas de la extracción.
PROCEDIMIENTO
Control de calidad: Antes de realizar una serie de determinaciones es aconsejable controlar
los reactivos con cada uno de los controles incluidos en el kit, siguiendo los pasos descritos
en la sección correspondiente. Si no se obtienen los resultados esperados, no utilice el kit.
TEST CUALITATIVO
Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente.
Asegurarse de que el reactivo antígeno y el reactivo control estén bien resuspendidos.
Para cada test se necesitan 4 pocillos, 2 de los cuales se utilizarán para la preparación de la
dilución de la muestra. Ver Tabla 1.
1.
Distribuir 25 µl de diluyente en el pocillo 1, 100 µl en el pocillo 2 y 25 µl en cada uno de
los pocillos 3 y 4.
2.
Añadir 25 µl de la muestra en el pocillo 1. Mezclar el contenido del pocillo 1 y transferir
25 µl al pocillo 2.
Mezclar y transferir 25 µl del pocillo 2 al pocillo 3, mezclar y desechar 25 µl del pocillo
3. Transferir otros 25 µl del pocillo 2 al pocillo 4, mezclar y desechar 25 µl del pocillo 4.
3.
Añadir 75 µl de reactivo control al pocillo 3 y 75 µl de reactivo antígeno al pocillo 4.
4.
Mezclar el contenido de los pocillos dando ligeros golpes en los lados de la placa o
utilizar un agitador de placas durante al menos 30 segundos.
5.
Cubrir la placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar
cualquier movimiento de la placa y mantener lejos de cualquier fuente de calor.
6.
Leer los resultados.
Utilización de los controles:
Incluir los controles positivo y negativo en cada serie de muestras teniendo en cuenta que
los controles ya están prediluidos 1:20. Añadir 25 µl de cada control directamente en los
pocillos 3 y 4. No añadir solución diluyente.
Pocillo nº
1
2
3
Control
4
Prueba
Solución diluyente µl
25
100
25
25
Muestra µl
25
Conservação
Dilución de la muestra
Os reativos permanecem estáveis até a data de validade indicada na etiqueta, se forem
conservados entre 2 e 8C. Não congelar.
Material necessário não incluído
Placas de microtitulação com fundo em forma de U (redondo), pipetas automáticas.
Coleta da amostra
25
Mezclar y
Transferir µl
25
25
25 
25 
1:2
1:10
1:20
1:20
Reactivo control µl
-
-
75
-
Reactivo antígeno µl
-
-
-
75
1:80
1:80
Dilución final
INCUBAR DURANTE 45-60 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE
Soro:
Utilizar soro fresco. Los soros podem ser conservados por 5 días entre 2 e 8C. Para
guardar por um período mais longo os soros devem ser congelados (-20°C).
22
Tabla 1
7
TEST CUANTITATIVO
Se necesitan 8 pocillos para cada test. Utilizar la dilución 1:10 de la muestra preparada en
el test cualitativo inicial (pocillo 2). Ver Tabla 2.
1.
Distribuir 25 µl de diluyente en los pocillos 1 al 8.
2.
Transferir 25 µl de la dilución 1:10 de la muestra preparada en el test cualitativo al pocillo 1.
Mezclar el contenido del pocillo 1 y transferir 25 µl al pocillo 2. Mezclar y continuar esta
preparación de diluciones dobles seriadas hasta el pocillo 8. Desechar 25 µl del pocillo 8.
3.
Añadir 75 µl de reactivo antígeno en los pocillos 1-8.
4.
Mezclar el contenido de los pocillos dando ligeros golpes en los lados de la placa o
utilizar un agitador de placas durante al menos 30 segundos.
5.
Cubrir la placa e incubar durante 45-60 minutos a temperatura ambiente. Evitar
cualquier movimiento y mantener lejos de cualquier fuente de calor.
6.
Leer los resultados.
Un risultato negativo (diluizione finale 1:80) indica l’assenza di anticorpi anti-T. pallidum
(leggere le limitazioni della metodica).
Un risultato borderline può corrispondere ad uno stato iniziale della sifilide o ad una
concentrazione di anticorpi residui presenti nel siero per una vecchia patologia sifilitica.
In questo caso dovrà essere testato un nuovo campione del paziente, per dimostrare un
eventuale aumento del titolo anticorpale, oppure potranno essere effettuati test di altra
natura.
Test quantitativo:
Un titolo approssimato corrisponderà alla più alta diluizione finale alla quale è presente una
reazione positiva.
Limitazioni della procedura
-
-
NOTA: Si el test cualitativo no se ha llevado a cabo, realizar las diluciones como en el test
cualitativo. Después, distribuir 25 µl de diluyente en los pocillos 5 al 12. Mezclar y transferir 25 µl
del pocillo 4 al 5 y proceder con esta preparación de diluciones dobles seriadas hasta el pocillo 12.
Desechar 25 µl del pocillo 12. Añadir 75 µl de reactivo control en el pocillo 3 y 75 µl de reactivo
antígeno en los pocillos 4-12. Proceder con los siguientes pasos como en el test cuantitativo.
Utilización del control positivo:
Incluir el control positivo en cada serie de muestras teniendo en cuenta que está prediluido 1:20.
Ver Tabla 3.
Añadir 25 µl de diluyente en los pocillos 2 a 8. Añadir 50 µl de control positivo directamente en
el pocillo 1. No añadir diluyente en este pocillo. Transferir 25 µl del pocillo 1 al pocillo 2, mezclar
y continuar como en el test cuantitativo.
Lectura de los resultados
-
Il siero è il materiale preferito per tutti i test della sifilide, ma può anche essere usato
plasma con EDTA per lo screening nelle emoteche. Nonostante ciò, sono state
riscontrate alcune reazioni falsamente positive. I test risultati positivi o borderline
effettuati su plasma devono essere ripetuti su siero.
Anticorpi specifici possono persistere per un lungo periodo di tempo, anche dopo un
efficace trattamento farmacologico contro tale patologia. Per valutare la risposta al
trattamento, è raccomandato l’uso di un test reaginico (RPR reditest).
La tecnica TPHA può dare origine a reazioni crociate con altre forme di infezione da
Treponema, e reazioni falsamente positive con campioni provenienti da pazienti affetti
da mononucleosi (EBV), lebbra, malattie autoimmuni e tossicomani.
Occasionalmente, nello stadio iniziale della patologia, gli anticorpi specifici possono non
essere individuati con la tecnica TPHA.
Caratteristiche di funzionalità
Sono state effettuate diverse valutazioni con il kit syphagen TPHA. In una delle valutazioni,
eseguita in Germania, è stata ottenuta una specificità del 99,6% con l’analisi di
695 campioni (siero e plasma) che comprendevano campioni di individui di età diverse, di
donne in stato di gravidanza e anche campioni che potevano provocare reazioni falsamente
positive, come quelli lipemici e itterici, con autoanticorpi, e campioni di varie infezioni. Nella
stessa valutazione la sensibilità ottenuta su 191 campioni già noti come positivi è stata
del 100%.
4+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas que cubre el fondo del pocillo, a
veces con bordes irregulares.
In una seconda valutazione eseguita in Francia, su un gruppo di 55 campioni di siero
positivo e 201 di siero negativo, comprendente anche siero con anticorpi eterofili, fattore
reumatoide, EBV e Borrelia, la sensibilità e la specificità ottenuta sono state del 100%.
3+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas que cubre parcialmente el fondo del pocillo.
In un’altra prova, 4 test di TPHA disponibili in commercio e un test di TPPA vennero
valutati per determinarne la capacità di rivelare anticorpi anti-treponema.
Dei 235 campioni inizialmente positivi usati per il calcolo di sensibilità del
syphagen TPHA, 10 mostrarono una reazione non specifica con il reagente di controllo,
4 diedero un risultato indeterminato e 2 negativo. Il syphagen TPHA mostrò una
sensibilità iniziale del 99,1% (223/225; intervallo de confidenza del 95%: 96,8 - 99,9) una
volta esclusi i campioni non specifici. Dopo un secondo test, 7 dei campioni inizial mente
non specifici diedero un risultato positivo e 3 dei campioni indeterminati furono
negativi, risultando una sensibilità finale del 97,8% (227/232; intervallo di confidenza
del 95%: 95,0 - 99,3). Il syphagen TPHA fu il più sensibile dei test di TPHA studiati.
Dei 235 campioni positivi, 114 erano di individui con uno stadio di malattia e un trattamento
noti. Un campione diede risultato non specifico con il reagente di controllo e venne escluso.
La tavola che segue indica la distribuzione dei 113 campioni restanti (numero di campioni
positivi con syphagen TPHA / numero di campioni totale).
2+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas rodeado por un anillo de hematíes.
1+ : Tapiz homogéneo de células aglutinadas rodeado por un patente anillo de hematíes.
± : Botón de hematíes con una pequeña abertura central.
 : Botón de hematíes con una muy pequeña abertura central o botón totalmente
compacto.
Positivo
Dudoso
Negativo
: desde 4+ a 1+
:±
:
NOTA: Cualquier aglutinación observada en el pocillo del reactivo control (pocillo 3) indica
la presencia de aglutininas no específicas. Aunque las reacciones inespecíficas son poco
frecuentes cuando se utilizan hematíes de pollo, una muestra con este tipo de reacción no
puede interpretarse con este kit.
Primaria
Secondaria
Interpretación de los resultados
Latente precoce
El control negativo debe dar un resultado negativo.
El control positivo debe dar un resultado positivo en el test cualitativo. Para el test
cuantitativo, ver el título y rango establecido en la etiqueta del vial.
Latente tardiva
Test cualitativo:
Un resultado positivo (dilución final 1:80 o superior) indica la presencia de anticuerpos
anti-T. pallidum, que resultan de una infección pasada o presente.
8
Non trattata
Trattata
Non trattata
Trattata
Non trattata
Trattata
Non trattata
Trattata
31/33
7/7
37/37
5/5
15/15
4/4
4/4
7/8
Bibliografia
Vedere “References” nel testo inglese.
21
TEST QUANTITATIVO
Ogni test richiede 8 pozzetti. Usare il campione diluito 1:10, preparato per il test qualitativo
(pozzetto 2). Vedere Tabella 2.
1.
Aggiungere 25 µl di diluente dal pozzetto 1 al pozzetto 8.
2.
Trasferire 25 µl del campione diluito 1:10 ottenuto nel precedente test qualitativo nel
pozzetto 1. Mescolare il contenuto del pozzetto 1 e trasferire 25 µl nel pozzetto 2.
Mescolare e continuare la preparazione della serie di diluizioni al raddoppio fino al
pozzetto 8. Scartare 25 µl dal pozzetto 8.
3.
Aggiungere 75 µl di reattivo antigene nei pozzetti da 1 ad 8.
4.
Mescolare il contenuto dei pozzetti dando leggeri colpi ai lati della piastra, oppure
utilizzando un agitatore di piastra per minimo 30 secondi.
5.
Coprire la piastra ed incubare per 45-60 minuti a temperatura ambiente. Evitare le
vibrazioni e mantenere lontano da fonti di calore.
6.
Leggere i risultati.
NOTA: Se il test qualitativo non è stato ancora effettuato, eseguire le diluizioni come nel test
qualitativo; poi aggiungere 25 µl di diluente dal pozzetto 5 all’12. Mescolare e trasferire 25 µl dal
pozzetto 4 al 5 e continuare la preparazione della serie di diluizioni al raddoppio fino al pozzetto 12.
Scartare 25 µl dal pozzetto 12. Aggiungere 75 µl di reattivo controllo al pozzetto 3 e 75 µl di reattivo
antigene dal pozzetto 4 all’12. Proseguire poi con le successive fasi come nel test quantitativo.
Uso del controllo positivo:
Includere il controllo positivo in ogni serie di campione tenendo conto che è prediluito 1:20.
Vedere Tabella 3.
Aggiungere 25 µl di diluente dal pozzetti 2 al 8. Aggiungere 50 µl di controllo direttamente nel
pozzetto 1. Non aggiungere diluente in questo pozzetto. Trasferire 25 µl dal pozzetto 1 al 2,
mescolare e continuare come nel test quantitativo.
Lettura dei risultati
4+ : Tappeto omogeneo di cellule che copre il fondo del pozzetto, talvolta con
contorni irregolari.
3+ : Tappeto omogeneo di cellule che copre parzialmente il fondo del pozzetto.
2+ : Tappeto omogeneo di cellule circondato da un anello di cellule.
1+ : Tappeto omogeneo di cellule circondato da un marcato anello di cellule.
± : Bottone di cellule con una piccola apertura centrale.
 : Bottone di cellule con o senza una piccolissima apertura nel centro.
Positivo
: da 4+ a 1+
Borderline : ±
Negativo : 
NOTA: Qualunque agglutinazione osservate nel pozzetto del reattivo controllo (pozzetto 3)
indicano la presenza di agglutinine non specifiche. Comunque reazioni non specifiche sono
molto rare usando emazie di pollo, un campione che dà questo risultato non può essere
interpretato con queste kit.
Un resultado negativo (dilución final 1:80) indica la ausencia de anticuerpos anti-T. pallidum
(ver limitaciones de la técnica).
Un resultado dudoso en el test cualitativo puede corresponder a un bajo nivel de
anticuerpos en estados iniciales de sífilis o a anticuerpos residuales de una sífilis ya tratada.
En este caso se debe probar una nueva muestra para demostrar un posible aumento en el
título de anticuerpos.
Test cuantitativo:
El título aproximado corresponderá a la dilución final más alta que muestre reacción positiva.
Limitaciones del procedimiento
-
-
Aunque el suero es la muestra de elección para todos los tests de sífilis, pueden
utilizarse muestras de plasma EDTA para screening en bancos de sangre. Sin
embargo, y puesto que se ha descrito una relativa incidencia de reacciones falsamente
positivas o dudosas, deberá repetirse el test de aquellas muestras inicialmente
positivas utilizando el suero del paciente.
Los anticuerpos específicos pueden persistir durante un largo período de tiempo,
incluso después de haberse tratado la enfermedad. Para evaluar la respuesta al
tratamiento, se recomienda hacer uso de los tests reagínicos (RPR reditest).
La técnica TPHA puede dar lugar a reaciones cruzadas con otras formas de
infecciones treponémicas y a reacciones falsamente positivas con muestras de
pacientes afectos de mononucleosis, lepra, drogadictos o enfermedades autoinmunes.
Ocasionalmente, en estados iniciales de sífilis, los anticuerpos específicos no pueden
ser detectados por la técnica de TPHA.
Características funcionales
Se han realizado varias evaluaciones con el kit syphagen TPHA. En una de las
evaluaciones realizada en Alemania, se obtuvo una especificidad de un 99,6% al analizar
695 muestras (suero y plasma) que incluían muestras de individuos de diferentes edades,
de mujeres embarazadas y también muestras que pueden producir reacciones falsamente
positivas como son muestras lipémicas e ictéricas, con auto-anticuerpos y muestras de
infecciones diversas. En la misma evaluación la sensibilidad obtenida frente a un panel de
191 muestras ya conocidas como positivas fue del 100%.
En una segunda evaluación realizada en Francia, con un panel de 55 muestras de sueros
positivos y de 201 sueros negativos, que incluía también sueros con anticuerpos heterófilos,
factor reumatoide, EBV y Borrelia, se obtuvo una sensibilidad y una especificidad de un 100%.
En otra evaluación, 4 ensayos de TPHA disponibles comercialmente y un ensayo de
TPPA se evaluaron para determinar su capacidad para detectar anticuerpos anti treponema. De las 235 muestras inicialmente positivas usadas para el cálculo de
sensibilidad del syphagen TPHA, 10 mostraron reacción inespecífica con el reactivo
control, 4 dieron resultado indeterminado y 2 negativo. El syphagen TPHA mostró una
sensibilidad inicial del 99,1% (223/225; 95% intervalo de confianza: 96,8 - 99,9) una vez
excluidas las muestras inespecíficas. Después de la recomprobación, 7 de las muestras
inicialmente inespecíficas dieron resultado positivo y 3 de las muestras indeterminadas
fueron negativas, resultando una sensibilidad final del 97,8% (227/232; 95% intervalo de
confianza: 95,0 - 99,3). El syphagen TPHA fue el test más sensible entre los tests de
TPHA estudiados.
De las 235 muestras positivas, 114 eran de individuos con estadio de la enfermedad y
tratamiento conocidos. Una muestra dio resultado inespecífico con el reactivo control y fue
excluida. La tabla siguiente indica la distribución de las 113 muestras restantes (número de
positivas con syphagen TPHA / número de muestras totales).
Primaria
Secundaria
Interpretazione dei risultati
Latente temprana
Il controllo negativo deve dare un risultato negativo.
Il controllo positivo deve dare un risultato positivo nel test qualitativo. Per il test quantitativo,
vedere il titolo e il range prescritto nell’etichetta del flacone.
Latente tardía
Test qualitativo:
Un risultato positivo (diluizione finale 1:80 o superiore) indica la presenza di anticorpi
anti-T. pallidum, dovuti ad una passata o presente infezione.
20
No tratada
Tratada
No tratada
Tratada
No tratada
Tratada
No tratada
Tratada
31/33
7/7
37/37
5/5
15/15
4/4
4/4
7/8
Bibliografía
Ver “References” del texto inglés.
9
HERVORGEHOBENE ÄNDERUNGEN LESEN
Plasma:
syphagen TPHA
Indirekter
Hämagglutinationstest
zum
Nachweis
spezifischer Antikörper gegen Treponema pallidum in
Humanserum und –plasma.
Prinzip
Kükenerythrozyten wurden mit Extrakten von Treponema pallidum (Stamm Nichols)
sensibilisiert. Bei Anwesenheit von spezifischen Antikörpern im Serum oder Plasma von
Syphilispatienten agglutinieren die Antikörper mit den Erythrozyten.
Unspezifische Reaktionen werden durch einen Ansatz mit nichtsensibilisierten Erythrozyten
(Kontrollreagenz) nachgewiesen.
Nichtpathogene Treponemen-Antikörper werden durch einen im Probendiluent enthaltenen
Extrakt aus Reiter-Treponemen absorbiert.
Bestandteile
REF 300015700.
a)
b)
c)
d)
e)
Antigenreagenz: 1 x 15 ml.
Suspension aus Kükenerythrozyten, sensibilisiert mit T. pallidum Antigenextrakten.
Gebrauchsfertig. Enthält < 0,1% Natriumazid.
Kontrollreagenz: 1 x 15 ml.
Suspension aus nichtsensibilisierten Kükenerythrozyten. Gebrauchsfertig. Enthält
< 0,1% Natriumazid.
Diluent (Absorptionsmedium): 1 x 50 ml.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit löslichen Komponenten von T. Reiter und
Stabilisatoren. Enthält < 0,1% Natriumazid.
Positive Kontrolle: 1 x 2,5 ml.
Immunreaktives Kaninchenserum. 1:20 vorverdünnt. Siehe Titer und zulässiges
Intervall auf dem Reagenzflaschenetikett. Enthält < 0,1% Natriumazid.
Negative Kontrolle: 1 x 2,5 ml.
Normales, nichtreaktives Kaninchenserum. 1:20 vorverdünnt. Enthält < 0,1% Natriumazid.
Vorsichtsmaßnahmen
syphagen TPHA ist ausschließlich für die IN VITRO-Diagnostik bestimmt.
Die Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Durch die Reaktion der
Azide in Metallabflussrohren können explosive Komponenten entstehen. Mit ausreichend
Wasser nachspülen.
Alle benutzten Materialien sind separat in Behältern für biologische Abfälle zu entsorgen.
Gefahrenklasse
Nicht eingestuft.
Gefahrenhinweise
Keine.
Sicherheitshinweise
P280: Schutzhandschuhe / Schutzkleidung / Augenschutz / Gesichtsschutz tragen.
P305+351+338: BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser
spülen. Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.
Il siero è la matrice preferita per tutti i test della sifilide, ma può essere anche usato plasma
con EDTA per lo screening nelle emoteche. Altri anticoagulanti dovranno essere valutati
prima dell’uso. Il plasma può essere conservato a 2-8°C e il test deve essere eseguito entro
72 ore dal prelievo.
PROCEDURA
Controllo di qualità: Prima di fare un gruppo di determinazioni è consigliabile testare i
reagenti con tutti i controlli inclusi nel kit, eseguendo le operazioni descritte nella relativa
sezione. Se non si ottengono i risultati sperati, scartare il kit.
TEST QUALITATIVO
Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente.
Assicurarsi che il reattivo antigene ed il reattivo controllo siano opportunamente risospesi.
Ogni test necessita di 4 pozzetti, 2 dei quali verranno utilizzati per la preparazione della
diluizione del campione. Vedere Tabella 1.
1.
Aggiungere 25 µl di diluente nel pozzetto 1, 100 µl nel pozzetto 2 e 25 µl nei pozzetti 3 e 4.
2.
Aggiungere 25 µl di campione nel pozzetto 1. Mescolare il contenuto del pozzetto 1 e trasferire
25 µl nel pozzetto 2.
Mescolare e trasferire 25 µl dal pozzetto 2 al 3, mescolare e scartare 25 µl dal pozzetto 3.
Trasferire ulteriori 25 µl dal pozzetto 2 al 4, mescolare e scartare 25 µl dal pozzetto 4.
3.
Aggiungere 75 µl di reattivo controllo al pozzetto 3 e 75 µl di reattivo antigene al pozzetto 4.
4.
Mescolare il contenuto dei pozzetti dando leggeri colpi ai lati della piastra, oppure
utilizzando un agitatore di piastra per minimo 30 secondi.
5.
Coprire la piastra ed incubare per 45-60 minuti a temperatura ambiente. Evitare le
vibrazioni e mantenere lontano da fonti di calore.
6.
Leggere i risultati.
Uso dei controlli:
Includere i controlli, positivo e negativo, in ogni serie di campioni tenendo conto che i
controlli sono già prediluiti 1:20. Aggiungere 25 µl di ogni controllo direttamente nei pozzetti
3 e 4. Non aggiungere soluzione diluente.
Pozzetto nº
1
2
3
Controllo
4
Test
Soluzione diluente µl
25
100
25
25
Campione µl
25
25
Mescolare e
transferire µl
Lagerung
Diluizione di campione
Die Reagenzien sind bei Lagerung zwischen 2 und 8°C bis zu dem auf dem Etikett
angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nicht einfrieren.
25 
25 
25
25
1:2
1:10
1:20
1:20
Reattivo controllo µl
-
-
75
-
Erforderliches, nicht mitgeliefertes Material
Reattivo antigene µl
-
-
-
75
Mikrotiterplatten mit rundem Boden (U-Form), Hubkolbenpipetten.
Diluizione finale
1:80
1:80
Probenmaterial
INCUBARE A TEMPERATURA AMBIENTE PER 45-60 MINUTI
Serum:
Frisches Serum verwenden. Bei Lagerung zwischen 2 und 8°C können die Seren 5 Tage
verwendet werden. Bei längerer Lagerung sollten die Proben eingefroren werden (-20°C).
10
Tabella 1
19
VEDI CAMBI RISALTATI
syphagen TPHA
Test di emoagglutinazione indiretta per la determinazione
di anticorpi specifici anti-Treponema pallidum, nel siero o
plasma umano.
Principio
Le emazie di pollo stabilizzate vengono sensibilizzate con un estratto antigenico di
Treponema pallidum (ceppo di Nichols). Queste emazie agglutineranno a contatto con gli
anticorpi specifici, presenti nel siero o plasma di pazienti affetti da sifilide.
Le eventuali reazioni aspecifiche vengono messe in evidenza tramite l’utilizzo di un reattivo
controllo costituito da emazie di pollo non sensibilizzate.
Gli anticorpi volti verso ceppi non patogeni di treponema, vengono adsorbiti tramite un
estratto di treponema di Reiter, presente nella soluzione diluente.
Componenti
Plasma:
Obgleich Serum das Probenmaterial der Wahl für alle Syphilistestungen ist, kann zu
Screening-Zwecken in Blutbanken EDTA-Plasma verwendet werden. Andere Antikoagulantien
müssen zuvor evaluiert werden. Die Proben sollten innerhalb von 72 Stunden nach der
Blutentnahme analysiert werden.
DURCHFÜHRUNG
Qualitätskontrolle: Vor der Probenanalyse ist die Qualität der Reagenzien mit den beiden, in
der Packung enthaltenen Kontrollen zu überprüfen. Die Vorgehensweise ist im
entsprechenden Abschnitt beschrieben. Sollten die erwarteten Werte nicht erreicht werden,
ist die Packung nicht zu verwenden.
QUALITATIVE BESTIMMUNG
Die Reagenzien sind auf Raumtemperatur zu bringen.
Antigen- und Kontrollreagenz sind vollständig zu resuspendieren.
Für jeden Test werden 4 Vertiefungen der Mikrotiterplatte benötigt, 2 davon zur
Probenverdünnung. Sehen Tabelle 1.
REF 300615700.
1.
25 µl Diluent in Vertiefung 1, 100 µl in Vertiefung 2 und je 25 µl in Vertiefungen 3 und 4 geben.
a)
2.
25 µl Probe in Vertiefung 1 geben. Mischen und 25 µl aus Vertiefung 1 in Vertiefung
2 überführen.
Mischen und 25 µl aus Vertiefung 2 in Vertiefung 3 überführen, mischen und 25 µl aus
Vertiefung 3 verwerfen.
Weitere 25 µl aus Vertiefung 2 in Vertiefung 4 überführen, mischen und 25 µl aus
Vertiefung 4 verwerfen.
3.
75 µl Kontrollreagenz in Vertiefung 3 und 75 µl Antigenreagenz in Vertiefung 4 geben.
4.
Reaktionsansätze durch leichtes Kippen der Mikrotiterplatte oder mittels eines
Schüttlers für 30 Sekunden mischen.
5.
Platte abdecken und für 45-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Jegliche Art
von Vibration vermeiden und vor Hitze schützen.
6.
Ergebnisse ablesen.
b)
c)
d)
e)
Reattivo antigene: 1 x 15 ml.
Sospensione di emazie di pollo sensibilizzate. Pronto all’uso. Contiene < 0,1% di sodio azide.
Reattivo controllo: 1 x 15 ml.
Sospensione di emazie di pollo non sensibilizzate. Pronto all’uso. Contiene < 0,1% di
sodio azide.
Soluzione diluente: 1 x 50 ml.
Tampone fosfato salino, contenente componenti solubili di T. Reiter ed agenti stabilizzanti.
Contiene < 0,1% di sodio azide.
Controllo positivo: 1 x 2,5 ml.
Siero di coniglio immune. Prediluito 1:20. Vedere il titolo e il range prescritto
nell’etichetta del flacone. Contiene < 0,1% di sodio azide.
Controllo negativo: 1 x 2,5 ml.
Siero di coniglio normale. Prediluito 1:20. Contiene < 0,1% di sodio azide.
Precauzioni
syphagen TPHA è per uso diagnostico IN VITRO.
I reattivi di questo kit contengono sodio azide come conservante. La sodio azide può reagire
con il piombo o in rame formando composti altamente esplosivi, perciò lavare
abbondantemente con acqua le tubature per evitarne l’accumulo.
Depositare tutti i materiali utilizzati in recipienti idonei per materiale biocontaminante.
Classe di pericolo
Non classificato.
Indicazioni di pericolo
Nessuna.
Consigli di prudenza
P280: Indossare guanti/indumenti protettivi/Proteggere gli occhi/il viso.
P305+351+338: IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: sciacquare accuratamente per
parecchi minuti. Togliere le eventuali lenti a contatto se è agevole farlo. Continuare a
sciacquare.
Conservazione
Tutti i componenti del kit sono stabili fino alla data di scadenza se conservati a 2-8°C. Non
congelare.
Verwendung der Kontrollen:
Bei jeder Serie von Proben sind die negative und positive Kontrolle (1:20 vorverdünnt) mit zu
analysieren. 25 µl jeder Kontrolle sind direkt in Vertiefung 3 bzw. 4 zu geben. Es ist kein
Diluent hinzuzufügen.
Vertiefung Nr.
1
2
3
Kontrollreagenz
4
Test
Diluent µl
25
100
25
25
Probe µl
25
25
Mischen und
überführen µl
25
25 
25 
1:2
1:10
1:20
1:20
Kontrollreagenz µl
-
-
75
-
Micropiastre a fondo tondo (ad U), pipette automatiche.
Antigenreagenz µl
-
-
-
75
Raccolta dei campioni
Endverdünnung
1:80
1:80
Materiale necessario non incluso
Siero:
Usare siero fresco. Il siero va conservato a 2-8°C per non più di 5 giorni; per tempi più lunghi
debe essere congelato (-20°C).
18
Verdünnung der Probe
25
FÜR 45-60 MINUTEN BEI RAUMTEMPERATUR INKUBIEREN
Tabelle 1
11
QUANTITATIVE BESTIMMUNG
Für jeden Testansatz werden 8 Vertiefungen der Mikrotiterplatte benötigt. Als
Ausgangsverdünnung ist die Probenverdünnung von 1:10 des qualitativen Ansatzes zu
verwenden (Vertiefung 2). Sehen Tabelle 2.
Un résultat négatif (dilution finale 1:80) indique l’absence d’anticorps anti-T. pallidum (voir
limites de la méthode).
Un résultat douteux dans le test qualitatif peut correspondre à un taux bas d’anticorps dans
les stades précoces de syphilis ou à un taux résiduel d’anticorps dans les syphilis traitées.
Dans ce cas, une nouvelle échantillon supplémentaire pourra être testé pour démontrer une
possible augmentation du titre des anticorps.
1.
25 µl Diluent in die Vertiefungen 1-8 geben.
2.
25 µl der 1:10 verdünnten Probe aus dem qualitativen Ansatz in Vertiefung 1 geben. Mischen
und 25 µl aus Vertiefung 1 in Vertiefung 2 überführen. Mischen und in gleicher Weise die
Verdünnung bis Vertiefung 8 fortsetzen. Aus Vertiefung 8 nach Mischen 25 µl verwerfen.
3.
75 µl Antigenreagenz in die Vertiefungen 1-8 zugeben.
4.
Reaktionsansätze durch leichtes Kippen der Mikrotiterplatte oder mittels eines
Schüttlers für 30 Sekunden mischen.
5.
Platte abdecken und für 45-60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Jegliche Art
von Vibration vermeiden und vor Hitze schützen.
-
6.
Ergebnisse ablesen.
-
Test quantitatif:
Le titre approximatif correspondra à la dernière dilution finale donnant une réaction positive.
Limites de la procédure
-
WICHTIGE BEMERKUNG: Sollte der qualitative Ansatz nicht durchgeführt worden sein,
so sind die Verdünnungen entsprechend des qualitativen Tests anzusetzen. In diesem Fall
muß für den quantitativen Ansatz je 25 µl Diluent in die Vertiefungen 5 bis 12 pipettiert
werden. Mischen und 25 µl aus Vertiefung 4 in Vertiefung 5 geben und die
Verdünnungsreihe entsprechend bis Vertiefung 12 fortsetzen. Aus Vertiefung 12 nach
Mischen 25 µl verwerfen. Anschließend 75 µl Kontrollreagenz in Vertiefung 3 und je 75 µl
Antigenreagenz in die Vertiefungen 4-12 geben. Die weiteren Schritte sind wie oben
beschrieben durchzuführen
Verwendung der positiven Kontrolle:
Bei jeder Serie von Proben ist die positive Kontrolle (1:20 vorverdünnt) mit zu analysieren.
Sehen Tabelle 3.
25 µl Diluent in die Vertiefungen 2-8 geben. 50 µl der Kontrolle direkt in Vertiefung 1 pipettieren. In
Vertiefung 1 kein Diluent zugeben. 25 µl aus Vertiefung 1 in Vertiefung 2 überführen, mischen und
die Verdünnungsreihe entsprechend fortsetzen. Aus Vertiefung 8 nach Mischen 25 µl verwerfen.
Auswertung der Ergebnisse
-
Bien que le sérum est l’échantillon type pour tous les tests de syphilis, des échantillons de
plasma EDTA peuvent être utilisés pour screening dans les banques de sang. Cependant,
certaines réactions peuvent s’avérer faussement positives. Dans ce cas, on devra
renouveler l’expérience avec du sérum sur tous les tests initialement positifs ou douteux.
Les anticorps spécifiques peuvent persister pendant une longue période, même après
un traitement réussi de la maladie. Afin d’estimer la réponse au traitement, l’emploi d’un
test réagine (RPR reditest) est recommandé.
La technique TPHA peut donner des réactions croisées avec d’autres formes d’infections à
tréponèmes et des réactions faussement positives avec des échantillons de patients atteints de
la mononucléose infectieuse, de la lèpre, toxicomanes ou de maladies autoimmunes.
Occasionnellement, dans certains cas de syphilis primaires précoces, les anticorps
spécifiques ne pourront pas être détectés par la technique TPHA.
Caractéristiques fonctionnelles
Il a été procédé à différentes évaluations avec le kit syphagen TPHA. Dans le cadre de
l’une des évaluations réalisées en Allemagne, une spécificité de 99,6% a été obtenue à
partir de l’analyse de 695 échantillons (sérums et plasmas), comprenant des échantillons
d’individus de différents âges, de femmes enceintes, de même que d’autres échantillons
susceptibles de produire des réactions faussement positives tels que les échantillons
lipémiques et ictériques avec des auto-anticorps et des échantillons d’interactions
diverses. Dans le cadre de la même évaluation, la sensibilité obtenue face à un tableau
de 191 échantillons déjà connus comme étant positifs a été de 100%.
Dans le cadre d’une deuxième évaluation réalisée en France, avec un tableau de
55 échantillons de sérums positifs et de 201 sérums négatifs, parmi lesquels nous trouvions
également des sérums avec des anticorps hétérophyles, facteur rhumatoïde, EBV et
Borréliose, la sensibilité et la spécificité obtenues ont été de 100%.
Au cours d’une autre évaluation, 4 tests de TPHA disponibles dans le commerce et un
test de TPPA ont été étudiés afin de déterminer leur capacité à détecter des anticorps
anti-tréponèmes. Parmi les 235 échantillons initialement positifs utilisés pour calculer la
sensibilité du syphagen TPHA, 10 ont affiché une réaction non spécifique avec le
réactif de contrôle, 4 ont donné un résultat indéterminé et 2 un résultat négatif. Le
syphagen TPHA a montré une sensibilité initiale de 99,1% (223/225; 95% intervalle de
confiance: 96,8 - 99,9) après avoir rejeté les échantillons non spécifiques. Après une
nouvelle vérification, 7 des échantillons initialement non spécifiques ont donné un
résultat positif et 3 des échantillons indéterminés ont été négatifs, ce qui a donné une
sensibilité finale de 97,8% (227/232; 95% intervalle de confiance: 95,0 - 99,3). Le
syphagen TPHA a été le test le plus sensible parmi les tests de TPHA étudiés.
Parmi les 235 échantillons positifs, 114 étaient des individus présentant un stade de la
maladie et un traitement connus. Un échantillon a donné un résultat non spécifique avec le
réactif de contrôle et il a été rejeté. Le tableau suivant indique la distribution des 113 autres
échantillons (nombre de positifs avec syphagen TPHA / nombre total d’échantillons).
4+ : Glatte, manchmal mit gefalteten Rändern.
3+ : Glatte Zellmatte, den Boden der Vertiefung teilweise bedeckend.
2+ : Glatte Zellmatte, umgeben von schmalem Erythrozytenring.
1+ : Glatte Zellmatte, umgeben von breitem Erythrozytenring.
± : Zellknopf mit kleiner, zentraler.
 : Kompakter Zellknopf mit oder ohne sehr schmaler Öffung im Zentrum.
Positiv
: von 4+ bis 1+
Grenzwertig : ±
Negativ
:
Primaire
BEMERKUNG: Sollte es in Vertiefung 3 (Kontrollreagenz) zu einer Agglutination
kommen, so deutet dies auf unspezifische Agglutinine hin. Obwohl nichtspezifische
Reaktionen bei der Verwendung von Kükenerythrozyten äußerst selten vorkommen, kann
bei einer solchen Probe das Ergebnis nicht interpretiert werden.
Secondaire
Latente précoce
Latente tardive
Interpretation der Ergebnisse
Die negative Kontrolle sollte ein negatives Ergebnis zeigen.
Die positive Kontrolle sollte ein positives Ergebnis in der qualitativen Bestimmung. Für den
quantitativen Test, siehe Titer und zulässiges Intervall auf dem Reagenzflaschenetikett.
12
Non traité
Traité
Non traité
Traité
Non traité
Traité
Non traité
Traité
31/33
7/7
37/37
5/5
15/15
4/4
4/4
7/8
Bibliographie
Voir “References” du texte anglais.
17
TEST QUANTITATIF
Qualitativer Test:
Chaque test nécessite 8 puits. Utiliser la dilution au 1:10 de l’échantillon préparé pour les
test qualitatif (puits 2). Voir Table 2.
Ein positives Ergebnis (Endverdünnung 1:80 oder höher) zeigt die Anwesenheit von
Antikörpern gegen T. pallidum aufgrund einer akuten oder zurückliegenden Infektion an.
Ein negatives Ergebnis (Endverdünnung 1:80) weist auf die Abwesenheit von Antikörpern
gegen T. pallidum hin (Beschränkungen der Technik lesen).
Ein grenzwertiges Ergebnis im qualitativen Test kann auf einen niedrigen Antikörpertiter in
der Frühphase einer Syphilisinfektion oder auf Restantikörper nach einer behandelten
Syphilis zurückzuführen sein. In diesem Fall muß zwecks Verlaufskontrolle eine weitere
Blutprobe analysiert werden.
1.
Ajouter 25 µl de diluant dans les puits 1 à 8.
2.
Trasférer 25 µl de la dilution au 1:10 de l’échantillon préparé dans le test qualitatif dans le
puits 1. Mélanger le contenu du puits 1 et trasférer 25 µl dans le puits 2. Mélanger et continuer
la préparation de cette série de doubles dilutions jusq’au puits 8. Eliminer 25 µl du puits 8.
3.
Ajouter 75 µl de réactif antigène dans les puits 1 à 8.
Quantitiver Test:
Der Titer wird mit der höchsten Endverdünnung angegeben, die eine positive Reaktion zeigt.
4.
Mélanger le contenu des puits par tapotement de la plaque ou en utilisant un agitateur
de plaques pendant au moins 30 secondes.
Begrenzung der Methode
5.
Couvrir la plaque et incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Eviter
toute source de vibration et garder à l’abri de toute source de chaleur.
6.
Lire le résultats.
NOTE: Si le test qualitatif n’a pas été effectué, faire les dilutions comme dans le test qualitatif.
Ajouter alors 25 µl de diluant du puits 5 au puits 12. Mélanger et transférer 25 µl du puits 4 au
puits 5 et continuer la préparation de cette série de doubles dilutions jusqu’au puits 12. Eliminer
25 µl du puits 12. Ajouter 75 µl de réactif contrôle dans le puits 3 et 75 µl de réactif antigène
dans les puits 4 à 12. Réaliser les étapes suivantes comme dans le test quantitatif.
-
Utilisation du contrôle positif:
Inclure le contrôle positif dans chaque série d’echantillons en tenant compte du fait que le
contrôle est prédilué au 1:20. Voir Table 3.
Ajouter 25 µl de diluant dans les puits 2 à 8. Ajouter 50 µl du contrôle positif directement dans le
puits 1. Ne pas ajouter de diluant dans ce puits. Transférer 25 µl du puits 1 au puits 2, mélanger
et continuer comme dans le test quantitatif.
Lecture des résultats
4+ : Voile homogène de cellules couvrant la totalité du puits, quelquefois avec des
bords repliés.
3+ : Voile homogène de cellules couvrant partiellement le fond du puits.
2+ : Voile de cellules entouré par un cercle de cellules.
1+ : Voile de cellules entouré par un cercle plus épais de cellules.
± : Bouton de cellules avec une petite overture centrale.
 : Bouton de cellules avec, ou sans, une très petite overture centrale.
Positif
Douteux
Négatif
-
: de 4+ à 1+
:±
:
NOTE: Une agglutination dans le puits de contrôle (puits 3) indique la présence
d’agglutinines non spécifiques. Cependant, les réactions non spécifiques sont très rares
avec l’emploi des érythrocytes de poulet, un échantillon donnant ce résultat ne pourra pas
être interprété avec cet kit.
Obgleich Serum das Probenmaterial der Wahl für alle Syphilistestungen ist, kann zu
Screening-Zwecken in Blutbanken EDTA-Plasma verwendet werden. In wenigen Fällen
wurden falsch positive Ergebnisse gefunden. Daher muß Serum für alle
Bestätigungsuntersuchungen, schwach positive und grenzwertige Ergebnisse aus
Plasmaproben verwendet werden.
Spezifische Antikörper können auch nach erfolgreich behandelter Infektion lange Zeit
im Blut persistieren. Zur Kontrolle des Behandlungserfolgs empfiehlt sich die
Durchführung eines Cardiolipin-Tests (RPR reditest von Biokit).
Bei der TPHA-Methode kann es zu Kreuzreaktivitäten bei anderen TreponemenInfektionen und zu falsch positiven Ergebnissen bei Patienten mit infektiöser
Mononukleose, Lepra, Autoimmunerkrankungen und Drogenabhängigkeit kommen.
Im Frühstadium einer Syphilis-Infektion kann es vorkommen, dass die spezifischen
Antikörper mit der TPHA-Technik nicht detektiert werden.
Charakteristische des Tests
Die Qualität des Syphagen TPHA-Tests wurde in einigen Evaluierungen untersucht.
In einer in Deutschland durchgeführten Studie wurde eine Spezifität von 99,6% ermittelt. Für
diese Evaluierung wurden 695 negative Proben (Serum und Plasma) verwendet, wobei das
Versuchspanel Proben von Patienten unterschiedlichen Alters, von Schwangeren, mit
Autoantikörpern und verschiedenen Infektionen sowie lipämische und ikterische Proben
umfasste. Bei einer Studie mit 191 positiven Proben ergab sich eine Sensitivität von 100%.
Aus einer Gruppe von 55 positiven und 201 negativen Proben wurde in Frankreich eine
Sensitivität und Spezifität von 100% ermittelt. Darin enthalten waren auch Proben mit
heterophilen Antikörpern, Rheumafaktoren, EBV und Borrelien.
Bei einer anderen Untersuchung wurde bei 4 handelsüblichen TPHA-Tests und einem
TPPA-Test die Fähigkeit zum Nachweis von Treponema-Antikörpern untersucht. Von den
235 eingesetzten, ursprünglich positiven Proben zur Berechnung der Sensitivität von syphagen
TPHA wiesen 10 eine unspezifische Reaktion mit dem Kontrollreagenz auf, 4 ergaben ein
unbestimmtes und 2 ein negatives Ergebnis. Nach Ausschluss der unspezifischen Proben wies
syphagen TPHA eine anfängliche Sensitivität von 99,1% (223/225; 95%-Konfidenzintervall:
96,8 - 99,9). Bei neuerlicher Überprüfung erzielten 7 der ursprünglich unspezifischen Proben ein
positives Ergebnis und 3 der unbestimmten Proben ein negatives Ergebnisse. Dies ergibt eine
endgültige Sensitivität von 97,8% (227/232; 95%-Konfidenzintervall: 95,0 - 99,3). Von den
untersuchten TPHA-Tests erzielte syphagen TPHA die höchsten Sensitivitätswerte.
Von den 235 positiven Testproben stammten 114 von Personen deren Krankheitsstadium
und Behandlung bekannt war. Eine Probe ergab ein unspezifisches Resultat mit dem
Kontrollreagenz und wurde ausgeschlossen. Die nachfolgende Tabelle zeigt die Verteilung
der restlichen 113 Proben (Anzahl der positiven Ergebnisse mit syphagen TPHA /
Gesamtanzahl der Proben).
Primärstadium
Sekundärstadium
Interprétation des résultats
Le contrôle négatif doit donner un résultat négatif.
Le contrôle positif doit donner un résultat positif dans le test qualitatif. Pour le test quantitatif,
voir le titre et le rang établi sur l’étiquette du flacon.
Test qualitatif:
Un résultat positif (dilution finale 1:80 ou supérieure) indique la présence d’anticorps
anti-T. pallidum résultant d’une infection passée ou présente.
16
Frühlatenz
Spätlatenz
unbehandelt
behandelt
unbehandelt
behandelt
unbehandelt
behandelt
unbehandelt
behandelt
31/33
7/7
37/37
5/5
15/15
4/4
4/4
7/8
Literatur
Sehen “References“ im englischen Text.
13
LIRE LES CHANGEMENTS SURLIGNÉS
syphagen TPHA
Test d’hémagglutination indirecte pour la détection des
anticorps spécifiques anti-Treponema pallidum dans le
sérum ou le plasma humain.
Principe
Des érythrocytes stabilisés de poulet sont sensibilisés avec un extrait antigénique de
Treponema pallidum (souche Nichols). Ces cellules agglutineront avec les anticorps
spécifiques présents dans le sérum ou le plasma des patients syphilitiques.
Les réactions non spécifiques sont détectées par l’emploi d’un réactif contrôle non sensibilisé.
Les anticorps de tréponèmes non pathogènes sont absorbés par un extrait de tréponèmes
de Reiter inclus dans le diluant.
Composants
REF 300615700.
Plasma:
Bien que le sérum est l’échantillon type pour tous les tests de syphilis, des échantillons de
plasma EDTA peuvent être utilisés pour screening dans les banques de sang. Autres
anticoagulants doivent être évalués avant leur utilisation. Le plasma peut être conservé à
2-8°C et testé dans les 72 heures qui suivent la collecte du sang.
PROCÉDURE
Contrôle de qualité: Avant de réaliser une série de déterminations, tester les réactifs avec
chaque contrôle, inclus dans le coffret, suivant les étapes décrites dans la section
correspondante. Si les résultats attendus ne sont pas obtenus, ne pas utiliser le réactif.
TEST QUALITATIF
Attendre que les réactifs atteignent la température ambiante.
S’assurer que le réactif antigène et le réactif contrôle soient bien en suspension.
Chaque test nécessite 4 puits, 2 d’entre eux servant pour la preparation de la dilution de
l’échantillon. Voir Table 1.
1.
Déposer 25 µl de diluant dans les puits 1, 100 µl dans le puits 2 et 25 µl dans chaq’un
des puits 3 et 4.
2.
Ajouter 25 µl d’échantillon dans le puits 1. Mélanger le contenu du puits 1 et transférer
25 µl dans le puits 2.
Mélanger et transférer 25 µl du puits 2 au puits 3. Mél anger et retirer 25 µl du
puits 3. Transférer de nouveau 25 µl du puits 2 au puits 4. Mélanger et retirer
25 µl du puits 4.
3
Ajouter 75 µl de réactif contrôle au puits 3 et 75 µl de réactif antigène au puits 4.
4
Mélanger le contenu des puits par tapotement de la plaque ou en utilisant un agitateur
de plaques pendant au moins 30 secondes.
5
Couvrir la plaque et incuber pendant 45-60 minutes à température ambiante. Eviter
toute source de vibration et garder à l’abri de toute source de chaleur.
Précautions
6
Lire les résultats.
syphagen TPHA est destiné à un usage diagnostique IN VITRO.
Les réactifs contiennent de l’azide sodique comme conservateur. Les azides peuvent réagir
avec des canalisations métalliques et former des composants explosifs. Aprés elimination,
rincer abondamment avec de l’eau.
Déposer tout le matériel utilisé dans des récipients conçus pour le matériel biocontaminant.
Utilisation des contrôles:
a)
b)
c)
d)
e)
Réactif antigène: 1 x 15 ml.
Suspension des hématies de poulet sensibilisées. Prêt a l’emploi. Contient < 0,1%
d’azide de sodium.
Réactif contrôle: 1 x 15 ml.
Suspension des hématies de poulet non sensibilisées. Prêt a l’emploi. Contient < 0,1%
d’azide de sodium.
Solution diluant: 1 x 50 ml.
Solution tampon phosphate contenant des composants solubles de T. Reiter et des
agents stabilisateurs. Contient < 0,1% d’azide de sodium.
Contrôle positif: 1 x 2,5 ml.
Sérum de lapin immunisé. Prédilué au 1:20. Voir le titre et le rang établi sur l’étiquette
du flacon. Contient < 0,1% d’azide de sodium.
Contrôle négatif: 1 x 2,5 ml.
Sérum de lapin non immunisé. Pédilué au 1:20. Contient < 0,1% d’azide de sodium.
Classe de danger
Non classifié.
Mentions de danger
Aucune.
Conseils de prudence
P280 : Porter des gants de protection/des vêtements de protection/un équipement de
protection des yeux/ du visage.
P305+351+338 : EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : rincer avec précaution à l’eau
pendant plusieurs minutes. Enlever les lentilles de contact si la victime en porte et si elles peuvent
être facilement enlevées. Continuer à rincer.
Conservation
Les réactifs sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur le coffret, si ils sont
conservés à 2-8°C. Ne pas congeler.
Matériel nécessaire non fourni
Inclure les contrôles positif et négatif dans chaque série d’échantillons en tenant compte du
fait que les contrôles sont dejà prédilués au 1:20. Ajouter 25 µl de chaque contrôle
directement dans les puits 3 et 4. Ne pas ajouter de diluant.
Puits nº
1
2
3
Contrôle
4
Test
Diluant µl
25
100
25
25
Échantillon µl
25
25
Mélanger et
transférer µl
Dilution de l'échantillon
25
25
25 
25 
1:2
1:10
1:20
1:20
Réactif contrôle µl
-
-
75
-
Réactif antigène µl
-
-
-
75
1:80
1:80
Plaques de microtitration avec puits en U (fond rond), pipettes automatiques.
Dilution finale
Prélèvement de l'échantillon
Sérum:
Utiliser du sérum frais. Le sérum peut être conservé à 2-8°C pendant 5 jours. Pour des
périodes plus longues, les serums doivent être congelés (-20°C).
14
INCUBER PENDANT 45-60 MINUTES À TEMPÉRATURE AMBIANTE
Table 1
15