¿es posible detectar con antelación el agente causal

74
Fitosanidad
Análisis microbiológico y molecular del "lloro primaveral" del kiwi:
¿ES POSIBLE DETECTAR CON ANTELACIÓN EL AGENTE
CAUSAL DEL CANCRO BACTERIANO?
En este artículo los autores señalan la necesidad de desarrollar un modelo de prevención de PSA que reduzca la diseminación del cancro
bacteriano. Así mismo explica un modelo de detección desarrollado en Italia y experimentado en Chile que se basa en el muestreo y
análisis del “lloro primaveral” del kiwi, es decir, del flujo xilemático que se libera por los cortes de poda de las plantas.
Stefano Ardizzi*, Enrico Biondi*, Set Pérez*, Carla Lucchese*, Assunta Bertaccini*, Alan Zamorano**, Ximena González**, Jimena Carrasco Figueroa***, Carolina Ureta Olivares***, Carolina Soto Pereira***, Catalina Cerpa***, Juan Alejandro Molina***, Ernesto Vega Berroeta***, Nicola Fiore**.
*DipSA, Patología vegetal, Alma Mater Studiorum, Universidad de Bolonia, Italia
**Departamento de Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agronómicas, Universidad de Chile, Chile
*** Servicio Agrícola y Ganadero, Chile
E
l cancro bacteriano del kiwi, causado por la bacteria Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa),
desde el año 2008 es responsable de
importantes epidemias en Europa y
en Nueva Zelanda. En Chile, particularmente en la región del Maule, Psa fue
detectado en el año 2010 y al 2013 ya
se confirmaba su presencia también
en las Regiones del Bio Bio y Libertador Bernardo O´Higgins.
Los principales síntomas en kiwi atribuibles al patógeno son: manchas
foliares necróticas con forma poligonal y usualmente con halo clorótico,
exudados rojos en primavera y, ante
el empeoramiento de la enfermedad,
cancros en las ramas, marchitamientos de flores y hojas (Figuras 1, 2 y
3). La diseminación de Psa ocurre a
través de: utensilios y ropa; incorrecta
eliminación de material (vegetal y no)
contaminado, infectado o sucio; polen;
lluvia y viento. Sin embargo, la causa
más importante es el movimiento de
material viverístico asintomático con
fines comerciales.
Para reducir la diseminación del cancro bacteriano del kiwi es importante
identificar y eliminar tempranamente
las nuevas fuentes de inóculo. A tal
propósito, es necesario desarrollar un
modelo de prevención, apoyado por un
protocolo de detección confiable y rápido en la identificación de las nuevas
fuentes de inoculo asintomáticas, antes del término del reposo vegetativo
de la actinidia.
Con esta finalidad, recientemente en
Italia se ha trabajado en una metodología diagnóstica basada en la recolección y análisis del fluido xilemático, llamado también “lloro primaveral”. Este
fenómeno natural y común en algunas
especies vegetales, se debe al aumento de la presión osmótica a nivel del
aparato radical, en concomitancia con
el gradual aumento de temperatura,
condición que se traduce en abundan-
Julio 2015
te flujo de linfa por los vasos xilemáticos que posteriormente es liberado
a través de cortes de poda (Davison,
1990; Clearwater y col., 2007; Biondi
y col., 2013; Biondi y col., 2014). Entre
las especies cultivadas, el lloro es muy
abundante en actinidia y en la vid, a
causa de las grandes dimensiones de
los vasos xilemáticos, los que ofrecen
poca resistencia hidráulica y permiten
el fácil tránsito de la linfa. En la vid,
el análisis microbiológico del fluido
xilemático ha sido utilizado con fines
diagnósticos para detectar la presencia de Agrobacterium vitis en plantas
asintomáticas (Szegedi y Bottka, 2002;
Flamini y col., 2006).
El método utilizado en este estudio,
se basa en el análisis microbiológico
y molecular del lloro primaveral de la
actinidia, para detectar la presencia de
infecciones latentes causadas por Psa
en perjuicio de plantas adultas cultivadas en pleno campo (Biondi y col.,
2013). Este método, ya desarrollado en
Italia (Biondi y col., 2014), ha sido experimentado también en Chile, en territorios afectados por Psa en las regiones
del Maule y Bíobío, a través de un trabajo realizado en conjunto entre la Universidad de Chile, el Servicio Agrícola
y Ganadero (SAG) y la Universidad de
Bologna (Italia).
SE SELECCIONARON PLANTAS HAYWARD
ASINTOMÁTICAS DE PREDIOS POSITIVOS
Las plantas analizadas, provenientes
de los distintos predios, pertenecían
al cultivar Hayward; para la recolección
de muestras, fueron seleccionados
predios positivos a Psa. Se eligieron
solo plantas asintomáticas, conservando como único criterio el de analizar un
número de muestras representativo
del área de investigación. Fue realizado
un muestreo de lloro de cada predio,
en primavera (inicios de octubre 2013).
Desde cada planta asintomática, después de haber esterilizado la superficie
con etanol al 70%, fueron cortadas las
porciones distales (2 - 3 cm) de tres sarmientos de un año. Una probeta Falcón
de 15 mL fue fijada en cada punto de
corte para colectar el lloro (tres probetas
Falcón por cada planta) (Figuras 4 y 5).
Alrededor de 1 hora después - el tiempo
de recolección puede llegar también incluso a 2 horas (Biondi y col., 2014) - las
probetas fueron retiradas y conservadas
en un contenedor refrigerado portátil
(15°C). Una vez en laboratorio, el líquido
contenido en las tres probetas Falcón de
15 mL, fue agitado en vórtex por algunos
segundos y posteriormente vertido en
una única probeta con capacidad total de
50 mL. El total del contenido fue centrifugado a 10.000 g por 20 minutos a 4°C.
El sobrenadante fue eliminado y el pellet
resuspendido en 1 mL de agua destilada
estéril. Una alícuota del precipitado resuspendido fue conservada a -80°C incor-
porando 20% de glicerol, mientras que la
otra alícuota fue mantenida a -20°C para
realizar análisis microbiológico y PCR anidada (Biondi y col., 2013).
La detección e identificación microbiológica de Psa, ha sido realizada a través
de aislamientos en substrato nutritivo
(NSA), y purificación en medio King B,
de manera de establecer las características morfológicas de las colonias,
evaluación de fluorescencia, pruebas
bioquímicas (LOPAT: producción de LEVANA, citocromo OXIDASA, pudrición
de PAPA, dihidrolasa de la ARGININA
e hipersensibilidad en TABACO). Las
pruebas moleculares han sido efectuadas desde los lloros y en las colonias
purificadas obtenidas a través del análisis microbiológico (PCR anidada; Biondi y col., 2013).
Tabla 1. En la tabla se indica fecha, zona y relativos volúmenes de los lloros de
plantas de actinidia muestreados.
FECHA Y ZONA DE MUESTREO
03 octubre 2013
"Curicó” región del Maule
11 octubre 2013
"Chillán – San Carlos” región
del Bíobío
Predio 1
11 octubre 2013
"Chillán – San Carlos” región
del Bíobío
Predio 2
Nº MUESTRA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
VOLUMEN DE LLORO OBTENIDO
POR MUESTREO (ML)
10,5
11
29,5
8
1
29,8
9,5
31
32,5
2
0
24
38,5
2
0
35,5
3,5
30
35,5
6,5
32
17
39
25
6
4,5
42,5
Fitosanidad
1
En el transcurso de la estación vegetativa, luego del análisis de los lloros,
se efectuaron observaciones fitopatométricas en las plantas usadas en cada
muestreo; con este fin, se recogieron
sarmientos sintomáticos (en las plantas donde empezaban a aparecer los
síntomas) y asintomáticos, los cuales
fueron analizados en laboratorio. Pequeñas porciones subcorticales de
sarmiento fueron esterilizadas por inmersión en hipoclorito de sodio (1%)
y, luego de haberlas enjuagado con
agua destilada estéril, inmediatamente puestas en bolsa de Stomacher.
Las muestras fueron sumergidas en
aproximadamente 25 mL de tampón
fosfato sódico (AFT) y mantenidas en
agitación lenta por 20 minutos. Desde
el extracto obtenido, 1 mL fue retirado
y conservado a temperatura de -20°C,
incorporando previamente 20% de gli-
2
cerol. El protocolo descrito por Biondi y
col. (2013) ha sido usado para la detección y la identificación del patógeno.
VOLÚMENES RECOLECTADOS Y
PORCENTAJES POR TIPO DE ANÁLISIS
Los volúmenes de lloro total, se indican en Tabla 1. En el predio de la región
del Maule, el volumen promedio de lloro recolectado fue alrededor de 14 mL,
muy cercano al obtenido en muestreos
realizados en el predio 1 en la región
del Bíobío (aprox. 17 mL). En el predio
2, de la región del Bíobío, el volumen
promedio de lloro recolectado fue mayor a 23 mL. El porcentaje de lloro obtenido en cada predio y utilizable para
un análisis, hasta un mínimo de 1 mL
- fue del 100% en el predio de la región del Maule y en el predio 2 de la del
Bíobío; en el predio 1 de la región del
Bíobío el porcentaje fue del 80%.
75
3
El 57% de los lloros recolectados
en el predio de la región del Maule
resultó positivo al análisis PCR anidada, mientras que aquellos obtenidos
desde los predios 1 y 2 de la región
del Bíobío, el porcentaje de muestras
positivas fue respectivamente 87%
y 77%. El aislamiento y la identificación microbiológica de Psa desde
lloro fueron posibles en el 14% de
las muestras provenientes del predio
de la región del Maule, mientras que
en aquellas provenientes de los dos
predios de la región del Bíobío, resultaron positivos el 25% y 20% de los
casos.
En los predios 1 y 2 de la región del
Bíobío, las observaciones fitopatométricas realizadas en las mismas
plantas utilizadas para los análisis del
lloro, evidenciaron la presencia de
síntomas de Psa en el 0% y 30% de
los casos, respectivamente. El aislamiento e identificación del patógeno
desde los sarmientos sintomáticos y
asintomáticos, provenientes desde
los predios 1 y 2 de la región del Bíobío, fueron posibles en el 20% y 50%
de las muestras respectivamente. En
el predio de la región del Maule no
se realizaron las observaciones fitopatométricas y tampoco se colectó
material vegetal.
EN CHILE AÚN FALTA ESTABLECER CON
EXACTITUD EL MEJOR PERIODO DE
MUESTREO
En los tres predios en los que fue realizado el muestreo, más del 90% de las
plantas de kiwi proporcionó volúmenes
de lloro adecuados para completar los
análisis microbiológicos y moleculares; solo en dos casos hubo ausencia
76
Fitosanidad
4
de lloro. En tres casos se obtuvieron
muestras de volumen exiguo (1 - 2
mL; Tabla 1), aunque suficiente para
completar los análisis. En particular,
el predio 1 de la región del Bíobío, no
obstante los volúmenes promedio recogidos en los tres predios hayan sido
significativamente similares entre sí, la
recolección no fue homogénea y los
volúmenes fueron muy variables; de
hecho, en este predio dos plantas (11 y
15) no produjeron lloro, y en dos casos
el volumen recogido fue de 2 mL. Esta
variabilidad se puede atribuir a daños
cuantiosos del sistema de conducción
xilemático causados por la presencia
de Psa (especialmente en el caso de las
muestras 11 y 15, positivas a la bacteria según resultados obtenidos en material vegetal) o a probables daños en
las raíces debidos a la acción de otros
agentes bióticos y/o abióticos. En Italia
ha sido posible identificar un período
ideal de recolección de lloro, correspondiente a aproximadamente un mes,
durante el cual se obtienen volúmenes
abundantes y con alta carga bacteriana
(Biondi y col., 2014). En Chile, si bien
se han generados más informaciones
durante la temporada 2014, aún falta investigar para establecer con exactitud
el mejor periodo de muestreo de lloro
en relación a variables como nivel de
precipitaciones, humedad relativa, especie, cultivar y volúmenes de riego de
cada zona agroclimática interesada por
el muestreo.
El porcentaje de muestras positivas
al análisis de PCR anidada, realizado
directamente en el extracto crudo de
lloro, fue mayor respecto del obtenido
en los análisis microbiológicos (aislamientos), al igual de lo observado utilizando como base para los análisis en el
material vegetal.
Los análisis microbiológicos y moleculares realizados en Chile evidenciaron la
misma discrepancia de resultados notada también en los experimentos llevados a cabo en Italia. Las dificultades
4 DÍAS /
3
Tabla 2. Resultados de los análisis moleculares y microbiológicos en lloro y material vegetal. Las muestras están numeradas y divididas en la tabla por cada región
de recolección.
PCR ANIDADA DIRECTA
EN LLORO
Neg.
Pos.
Pos.
Neg.
Pos.
Pos.
Neg.
Neg.
Pos.
Pos.
/
Pos.
Pos.
Pos.
/
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Pos.
Neg.
Neg.
Neg.
Nº MUESTRA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
AISLAMIENTOS DESDE
LLORO
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Pos.
Neg.
Pos.
Pos.
/
Neg.
Neg.
Neg.
/
Neg.
Neg.
Neg.
Pos.
Neg.
Neg.
Pos.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
Neg.
AISLAMIENTOS DESDE
SARMIENTOS
n/m
n/m
n/m
n/m
n/m
n/m
n/m
Neg.
Neg.
Neg.
Pos.
Neg.
Neg.
Neg.
Pos.
Neg.
Neg.
Pos.
Neg.
Pos.
Pos.
Pos.
Neg.
Pos.
Neg.
Neg.
Neg.
n/m: no muestreado; /: ausencia de lloro; Pos.: positivo; Neg.: negativo
encontradas en el aislamiento de Psa,
han sido sindicadas muy a menudo a la
presencia de otras especies endófitas o
EVENTOS DE
VANGUARDIA
epifita, más numerosas y veloces en el
crecimiento, y que han inhibido a Psa,
o bien han hecho imposible el reconoci-
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Fitosanidad
Para la detección de Psa, la prueba molecular PCR anidada resultó ser más
sensible que el aislamiento en medio
de cultivo. Trabajos anteriores (Biondi
y col., 2013), dejan también en conocimiento que el análisis molecular del
lloro primaveral de actinidia, es eficaz
también si se utilizan otros protocolos
moleculares (Gallelli y col., 2011; ReesGeorge y col., 2010).
5
miento de las colonias. En Italia, el periodo óptimo de muestreo del lloro se
ha obtenido no sólo en base a la numerosidad y el volumen de lloro promedio
recolectado, sino que también en base
a la mayor facilidad de aislamiento de
Psa (Biondi y col., 2014). Como se ha
indicado anteriormente, en Chile aún
no se establece con exactitud el periodo óptimo de muestreo de lloro. Pero,
a través de este trabajo, a pesar del limitado número de muestras, aparecen
importantes indicaciones. En específico, desde los lloros obtenidos en la última recolección (11/10/2013), fue posible
aislar el patógeno en un porcentaje del
6% al 11% superior respecto a lo obtenido en las muestras recogidas una
semana antes.
Es necesario también no olvidar que en
el caso de análisis de plantas asintomáticas, debido a la insuficiente información científica disponible actualmente,
es preferible utilizar la prueba molecular solo para complementar y confirmar la detección realizada a través del
aislamiento del patógeno en medio de
cultivo. El estudio de nuevos sustratos
semiselectivos más específicos, podría
ayudar a mejorar la eficiencia en el aislamiento de Psa; pese a que en este
trabajo se ha usado sólo el substrato
NSA para los aislamientos, se sabe
por trabajos anteriores, que utilizando
NSA con incorporación de ácido bórico, cefalexina y cycloheximide (Gallelli
y col., 2011) para limitar el crecimiento
de especies contaminantes, ha sido
posible aumentar la eficacia del aislamiento, aunque en pequeña medida
(Biondi y col., 2014). Por otro lado, de
todas las plantas cuyo lloro haya resultado negativo con PCR anidada, solo
en una muestra (la 7) ha sido posible
aislar la bacteria en medio de cultivo.
Estos resultados indican que el análisis
de lloro es un método suficientemente
confiable para ser utilizado en el monitoreo del territorio, permitiendo señalar como libre de enfermedad aquellos
cuarteles en los cuales todas las plantas analizadas a través de muestras de
lloro hayan resultado negativas a Psa
por el método molecular.
EL MÉTODO PROPUESTO DEMOSTRÓ SER
EFICAZ Y CONFIABLE
El método de análisis propuesto demostró ser eficaz y confiable para detectar la presencia de Psa también en
plantas asintomáticas, por eso es que
se propone como instrumento para
identificar precozmente nuevas fuentes
de inoculo. Permite, además simplificar
el monitoreo de Psa en el territorio, con
evidente disminución de los costos.
El análisis del lloro en primavera, unido a otras tipologías de intervención,
como el control biológico y químico, la
elección de cultivares menos susceptibles, y otros medios agronómicos,
contribuiría a disminuir la diseminación
de la bacteria, no solo en los cuarteles
en producción, sino que sobre todo si
se aplicara en vivero para la selección
sanitaria de las plantas destinadas a la
propagación vegetativa.
77
BIBLIOGRAFÍA
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