ácidos presentes en la cerveza lager mediante voltamperometría de

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ISO--ÁCIDOS
PRESENTES EN LA CERVEZA LAGER MEDIANTE
VOLTAMPEROMETRÍA DE REDISOLUCIÓN CATÓDICA
Caballero I.*, Blanco C.A., Sancho D.
Departamento de Ingeniería Agrícola y Forestal (Área de Tecnología de los Alimentos).
ETS Ingenierías Agrarias, Universidad de Valladolid, Avda. Madrid s/n, 34004 Palencia,
España
[email protected]
Palabras clave:
Cerveza, amargor, métodos electroquímicos.
RESUMEN
La cerveza es una de las bebidas alcohólicas más antiguas conocidas. Es una bebida
fermentada elaborada con malta y aromatizada con lúpulo. Durante el proceso de
elaboración de la cerveza, los -ácidos presentes en el lúpulo se transforman en iso -ácidos, responsables del sabor amargo de la cerveza. Estos iso --ácidos y sus variantes
modificadas químicamente juegan un papel importante en la calidad de la cerveza.
En los últimos años los métodos de voltamperometría de redisolución han sido muy utilizados
en el análisis de alimentos, debido a que son técnicas muy adecuadas, versátiles y rápidas
para la determinación de metales y otros compuestos, como los iso - -ácidos, en matrices
complejas, eliminando la posible contaminación de la muestra y la pérdida de analitos. Al
mismo tiempo, esta técnica presenta una alta sensibilidad llegando a detectar ppb.
En este trabajo se ha determinado la concentración de iso--ácidos presentes en cerveza
mediante “Voltamperometría de Redisolución Catódica (CSV)”, para lo cual se han analizado
15 cervezas comerciales (negras, rubias y sin alcohol). Los resultados obtenidos han puesto
de manifiesto que el contenido de iso--ácidos en las cervezas analizadas varía ente 44.06 y
122.56 ppm. De los resultados obtenidos se puede concluir que la técnica CSV resulta válida
para determinar la concentración de iso--ácidos en cervezas lager.
INTRODUCCIÓN
La cerveza es una de las bebidas alcohólicas más antiguas conocidas. Es una bebida
fermentada elaborada con malta y aromatizada con lúpulo (Llario et al., 2006).
Durante el proceso de elaboración de la cerveza, los α-ácidos, inicialmente insolubles son
isomerizados en la etapa de cocción del mosto, y convertidos en iso-α-ácidos solubles, que
son los responsables del amargor de la cerveza terminada (De Cooman et al., 2000). El
término iso--ácidos comprende una mezcla de 6 compuestos diferentes isocohumulonas,
isohumulonas and isoadhumulonas en sus formas cis- y trans-. (Figure 1).
Figura1. Estructura de la humulona y sus isómeros cis y trans
La concentración de iso -ácidos presente en la cerveza depende de varios factores como
son; la variedad de lúpulo elegida, la cantidad de lúpulo utilizada y las condiciones
empleadas durante la elaboración de la cerveza (Hughes et al., 1996). Los productos del
lúpulo usados en cervecería son comercialmente presentados en varias formas, entre las que
se encuentran los conos, en polvo, en extractos y en extractos isomerizados. (Lewis and
Young, 1995; Moir, 2000).
Además de aromatizar y aportar el amargor a la cerveza poseen otras propiedades:
-
Mejoran la estabilidad de la espuma, debido a que son compuestos muy tensioactivos
(Kunimune and Shellhammer 2008).
Inhiben el desarrollo de los microorganismos en la cerveza, aumentando su
estabilidad biológica. Sin embargo no es una actividad bacteriostática lo
suficientemente grande como para sustituir las medidas necesarias para la
conservación del producto (Blanco et al., 2007; Caballero et al., 2009).
La voltamperometría de redisolución, tiene el límite de detección más bajo de las técnicas
electroanalíticas comúnmente usadas.
Las técnicas voltamperométricas de redisolución están basadas en la preconcentración de un
analito presente en disolución. La principal ventaja de esta técnica frente al análisis
voltamperométrico directo, es la preconcentración de la especie objeto.
El análisis electroquímico de redisolución, comprende dos etapas:
-
Primera etapa: El analito se deposita electroquímicamente sobre el electrodo de gota
de mercurio.
-
Segunda etapa: Tiene lugar una electrólisis inversa, o redisolución, en la cual el
analito depositado se retira del electrodo. Cada especie electroquímica se redisuelve
a un potencial característico (Hobart et al, 1991).
En este estudio se ha determinado la concentración iso-α-ácidos y sus derivados reducidos
en muestras comerciales de cervezas lager con y sin alcohol mediante voltamperometría de
redisolución catódica.
MATERIAL Y MÉTODOS
Materiales
Baño de ultrasonidos (ELMA Model Transsonic 700/H) para la desgasificación de las muestras
de cervezas.pH-metro (CRISON 2002) para la medición del pH.Refractómetro (COMECTA,
Model C-2) para la medición del grado Brix.El análisis voltamperométrico se ha llevado a
cabo con un 746 VA TRACE ANALYZER que consta de dos partes; Metrohm 746 VA Trace
Analyzer y Metrohm 747 VA Stand. Se ha utilizado un electrodo estacionario de gota
colgante de mercurio (HMDE) como electrodo de trabajo, un electrodo Ag/AgCl, KCl sat como
electrodo de de referencia y un electrodo de platino como electrodo auxiliar.
Muestras
Se analizaron quince cervezas lager comerciales; 6 con alcohol y 9 sin alcohol.
Método
El análisis se dividió en tres etapas:
Preparación de las muestras
Las muestras de cervezas seleccionadas, fueron compradas y almacenadas a temperatura de
5,5 ºC en una cámara frigorífica. Dichas muestras fueron codificadas.Posteriormente, las
cervezas se introdujeron en viales y se midió el pH (mediante un pH-metro), el grado
alcohólico (según el método de análisis del B.O.E. 23/10/1985) y el grado Brix (mediante un
refractómetro).
Las muestras de cerveza fueron desgasificadas en un equipo de ultrasonidos durante 15
minutos para evitar el problema que podría originar la espuma a la hora de realizar las
determinaciones. Además, durante el análisis tuvo lugar la eliminación del O 2 disuelto en el
agua, antes de la etapa de preconcentración, realizándose una purga durante 10 minutos
con un gas inerte (N2), que burbujeaba en la disolución saturándola de dicho gas.
Previamente al análisis de las muestras se optimizaron las condiciones de medida mediante
la realización de varios ensayos, parar optimizar las medidas sobre las muestras de cervezas
sin la interferencia de materia orgánica, ya que en altas concentraciones puede provocar
problemas en la determinación de los iso--ácidos. Estos compuestos orgánicos se adsorben
en la superficie del electrodo e impiden la deposición y/o el proceso de redisolución (Carvajal
et al., 1991).
Optimización de la etapa de medida voltamperométrica
La purga con nitrógeno se fijó en 600 segundos en la etapa previa al análisis y 30 segundos
entre la realización de las adiciones de disolución estándar de los iso--ácidos.
Se estudió la influencia del tiempo de deposición, el tamaño de gota y el número de
adicciones. El volumen total de disolución en la celda de medida fue de 25 ml y las adiciones
de patrón iso--ácidos fue de 100 l. El análisis cuantitativo y la calibración se realizaron
mediante el método de las adicciones patrón. Antes de proceder al análisis de las muestras
de cerveza se determinó el límite de detección y de cuantificación de los iso-α-ácidos.
También se procedió a la validación del método para lo cual se estudió la repetibilidad y la
reproducibilidad.
Análisis voltamperométrico de las muestras
Una vez establecidos todos los parámetros (tiempo de deposición, tamaño de gota y número
de adiciones) y los volúmenes de cada reactivo y muestras, se procedió a su análisis de la
concentración de iso-α-ácidos mediante voltamperometría de redisolución catódica.
Tratamiento estadístico
El estudio estadístico de
STATGRAPHICS® Plus 5.1.
los
datos
se
efectuó
mediante
el
paquete
estadístico
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación de las condiciones óptimas
Tiempo de deposición
Se realizaron diversas pruebas a diferentes tiempos de deposición (Td) en el intervalo de 30
a 120 segundos. Las condiciones de la disolución fueron: 24 mL de agua ultrapura, 1 mL de
disolución tampón, pH=5 y 450 μL de disolución estándar. El tiempo seleccionado fue de 60
segundos ya que se consigue una señal óptima y además un tiempo menor no es
aconsejado. La figura 2 muestra la variación de la intensidad con el tiempo de deposición.
(Figura 2).
Figura 2.- Variación de la intensidad con el tiempo de deposición
Volumen solución tampón y pH
Se utilizaron tres soluciones diferentes, AcH/AcONa pH=3,12, AcH/AcONa pH=5,
KH2PO4/KOH pH=8.04. Las condiciones de la disolución fueron: 24 mL de agua ultrapura y 1
ml de solución tampón. Se realizaron cinco adicciones de disolución patrón de 50µl y otras
cinco de100 l. La figura 3 muestra las rectas de calibrado obtenidas para las diferentes
disoluciones empleadas. (Figura 3). La disolución tampón utilizada fue la de AcH/AcONa,
para determinar el parámetro del pH nos fijamos en el valor de R2 obtenido en la recta de
calibrado. Para pH= 5, el valor de R2 es el más cercano a 1, por lo tanto los resultados
obtenidos son mejores para este pH.
Figura 3.-Líneas de calibración obtenidas para las diferentes soluciones empleadas
La tabla 1 muestra un resumen de las condiciones del proceso voltamperométrico
previamente optimizado. Posteriormente a la determinación de las condiciones óptimas para
la determinación de los iso-ácidos en la cerveza se determinaron los parámetros de
calibración, así como los límites de detección y cuantificación
I=a+bC, donde
I= intensidad relativa
C= concentración
R2= 0.9840
a= 0.0199
b= 15.644
sy/x(desviación estándar del blanco)= 0.2659
LD (Límite de Detección)= 40.08
LQ (Límite de Cuantificación)= 133.62
Tabla 1. Condiciones optimizadas para la medida de iso- -ácidos mediante CSV en cerveza.
Tiempo de deposición
60 s
pH de solución tampón
5
Volumen de cerveza
100 L
Volumen de agua
24 mL
Volumen de solución estándar
50 µL
Número de adicciones
8
Validación del método
Antes de proceder a la determinación de la concentración de iso--acidos presentes en la
cerveza se determinaron la reproducibilidad y repetitividad del método. La tabla 2 muestra
los resultados obtenidos.
Tabla 2. Repetitividad y reproducibilidad del método voltamperométrico.
Media
σ
DSR (%)
Repetitividad
1,677
0.014
0,846
Reproducibilidad
1,661
0.045
2,712
σ: desviación estándar
DSR: desviación estándar relativa (100 σ /media)
Voltamperometría de Redisolución catódica (CSV)
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el contenido de iso--acidos en las 15
cervezas lager analizadas varía ente 44.06 y 122.56 ppm (Tabla 3).
Tabla 3. Resultados obtenidos para cervezas analizadas.
5,5
BRIX
(%)
5,8
ALCOHOL
(%)
4,08
Iso-α-ácidos
(ppm)
90,49
3,96
5,2
0,0
113,36
4,12
6,8
6,5
122,56
4,03
5,0
<1
95,64
4,20
5,1
4,8
93,52
4,16
4,6
0,0
44,06
4,23
6,0
5,5
103,04
4,01
4,8
<1
75,08
4,21
4,04
6,2
6,0
5,4
5,4
80,96
82,84
3,95
3,0
0,0
99,48
3,99
6,0
0,0
101,76
4,19
6,0
<1
95,00
4,13
4,2
0,3
102,72
4,16
5,8
<1
95,72
MUESTRA
ORIGEN
TIPO
pH
1
Nacional
2
Nacional
3
Nacional
4
Nacional
5
Nacional
6
Nacional
7
Nacional
8
Nacional
9
10
Nacional
Nacional
11
Nacional
12
Nacional
13
Importación
14
Importación
15
Importación
Rubia
Sin
Alcohol
Rubia
Sin
Alcohol
Rubia
Sin
Alcohol
Rubia
Sin
Alcohol
Rubia
Rubia
Sin
Alcohol
Sin
Alcohol
Sin
Alcohol
Sin
Alcohol
Sin
Alcohol
Análisis de componentes principales (ACP)
El objetivo de esta técnica es realizar una reducción de dimensionalidad, es decir, del
número de variables (pH, % alcohol, % Brix y concentración de iso --ácidos) y evaluar las
cervezas mediante esas variables principales que resulten.
Tabla de análisis de componentes principales:
En la tabla 4 se muestra el resultado del análisis, de la que se extraen los autovalores
mayores de 1 (autovalor mínimo fijado), que como se puede comprobar son 2 y juntos
explican el 74,578 % de la variabilidad de los datos originales
Tabla 4.- Anális is de Componentes Principales .
COMPONENTE
NÚMERO
AUTOVALOR
PORCENTAJE DE
VARIANZA
PORCENTAJE
ACUMULADO
1
1,87118
46,780
46,780
2
1,11192
27,798
74,578
3
0,599728
14,993
89,571
4
0,417163
10,429
100,000
El sumatorio de los autovalores es igual al número de variables iniciales (4 en este caso). El
espacio de dimensión cuatro ha sido reducido a un espacio de dimensión dos, en el cual la
primera variable tendría una importancia de 1,87 sobre 4 y la segunda tendría un autovalor
de 1,11 sobre 4.
Clasificación de las muestras de cervezas
 Dendograma (Análisis Cluster de las muestras)
El método que se va a utilizar para realizar el Dendograma (Figura 4), será el Método Ward,
que se basa en juntar los grupos que tengan medias cercanas.
25
Distancia
20
15
10
5
9
10
7
5
3
8
11
6
15
13
12
4
14
2
1
0
Figura 4 . Dendograma
Los cluster y sus caracterísicas serán los siguientes:
Cluster 1: La muestra de cerveza 1, presenta un pH alto, brix medio-alto, una
concentración de iso--ácidos baja, y alto contenido en alcohol.
Cluster 2: Lo componen las cervezas 2, 4, 6, 8, 11, 12, 13, 14, 15. Se caracteriza por
tener niveles bajos de alcohol, niveles bajos de pH y grado brix, y concentración de iso-ácidos media. Lo forman las cervezas sin alcohol.
Cluster 3: Formado por las muestras de cerveza 3, 5, 7, 9, 10. Son cervezas con niveles
altos de alcohol, pH medios, grados brix altos y concentración de iso--ácidos elevada.
CONCLUSIONES
Según los resultados obtenidos mediante voltamperometría de redisolución catódica, el
contenido de iso--ácidos en las cervezas lager analizadas varía entre 44.06 y 122.56 ppm,
valores que se encuentran dentro del intervalo de concentraciones que aparecen reflejadas
en la bibliografía (Benitez et al., 1997). Por lo cual la CSV se puede considerar un método
apropiado para determinar el contenido de iso--ácidos en cervezas lager.
BIBLIOGRAFÍA
Benitez J. L., Forster A., De Keukeleire D., Moir M., Sharpe F. R., Verhagen L. C. and
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Caballero I, Agut M, Armentia A and Blanco CA,. (2009). Importance of
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