Estudio de la capacidad visual en ratones albinos

567/84
ESTUDIO DE LA CAPACIDAD VISUAL EN RATONES ALBINOS. ¿SON LOS ANIMALES ALBINOS UTILES PARA TODOS LOS EXPERIMENTOS EN NEUROCIENCIAS?
1-2
3,4
2
2
2
1
3,4
Vicente-Tejedor, J. ; Zurita, E. ; Marchena, M. ; Ramírez, L. ; Germain, F. ; Sánchez-Ramos, C. ; Montoliu, L. ; de la Villa, P.
1
Alta Eficiencia Tecnológica, S.L. Escuela de Óptica. Universidad Complutense de Madrid, Spain. 2 Departamento de Fisiología. Facultad de Medicina, Universidad de Alcalá, Alcalá de Henares, Spain; 3 Centro Nacional de Biotecnologia, CSIC, Madrid, Spain; 4 CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), ISCIII, Madrid, Spain.
LEYENDA DE FIGURAS.
(I)
Las casas comerciales suministradoras de animales de experimentación ofrecen
ratones albinos para estudios en neurociencias. Habitualmente los
neurocientíficos utilizan dichos animales asumiendo que sus funciones
sensoriales son normales. Estudios preliminares nos han permitido observar
que un elevado porcentaje de dichos animales sufren de anomalías en su
función visual, que podría comprometer algunos de los resultados obtenidos en
ciertos test conductuales. En el presente trabajo mostramos los resultados de
un estudio de la capacidad visual realizado en ratones albinos de cepas (NMRI,
CD1) habitualmente proporcionadas por distribuidores comerciales.
Todos
BASTONES Sano
MIX Sano
PO Sano
CONOS Sano
FLICKER Sano
STR Afectado
BASTONES Afectado
MIX Afectado
PO Afectado
CONOS Afectado
FLICKER Afectado
0,80
400
0,80
300
0,60
80
200
0,40
100
0,20
0,20
100
100
0
0
-100
-100
20
0
-20
0,00
Representación de los registros electrorretinográficos estándar más STR de
los animales Sanos (trazo negro) y Afectados (trazo rojo). De izquierda a
derecha se muestran los registros de la Respuesta Umbral Escotópica (STR),
Bastones, Mixta, Potenciales Oscilatorios, Conos y Flicker. El eje de abscisas
representa el tiempo en milisegundos; el eje de ordenadas la amplitud de las
respuestas en microVoltios. Por debajo de cada uno de estos registros se
representa el estímulo luminoso aplicado (trazo azul), ofreciendo
información del momento en el que se aplica (ms, en abscisas) y la intensidad
(Voltios, en ordenadas).
-40
-200
-200
-60
MATERIALES Y MÉTODOS.
-0,20
-0,20
-300
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN:
En el presente trabajo hemos utilizado ratones albinos de dos cepas diferentes (NMRI y CD1)
procedentes de las casas comerciales HARLAN Laboratories (Laboratorios HARLAN,
www.harlan.com) y JANVIER (Laboratorios JANVIER, www.janvier-europe.com). El total de
animales analizados ha sido de 40 ratones albinos distribuidos en cuatro grupos. Estos grupos
son: CD1-Harlan (n=8); CD1-Janvier (n=15); NMRI-Harlan (n=9) y NMRI-Janvier (n=17).
-0,40
-400
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,0
0,5
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,0
18
14
10
6
2
-2
18
14
10
6
2
-2
0,00
-0,40
0,10
0,20
0,30
0,40
0,00
0,50
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,1
0,2
0,3
0,4
-300
-300
-400
-400
0,5
0,0
18
18
14
10
6
2
-2
0,00
14
10
6
2
-2
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,00
0,1
0,2
0,10
0,3
0,20
0,4
0,30
0,40
(II)
-80
-100
0,5
0,0
0,50
18
14
10
6
2
-2
0,00
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
18
14
10
6
2
0,10
0,20
0,30
0,40
-2
0,50
(II)
1200
Protocolo ISCEV
Albinos Sanos
1200
Protocolo ISCEV
Protocolo ISCEV
Albinos Sanos
1200
Protocolo ISCEV
ns
ns
600
ns
400
ns
200
ns
)
V
µ
(
d
ut
il
p
m
A
*
ns
STR-
ns
BASTONES
a-MIX
b-MIX
PO
CONOS
ns
200
ns
ns
0
FLICKER
STR+
STR-
BASTONES
Luz Blanca
Luz Azul
Luz Rojo
Luz Verde
Luz Blanca Afectados
Luz Azul Afectados
Luz Roja Afectados
Luz Verde Afectados
CONOS
0
0
FLICKER
Luz Blanca
Luz Azul
Luz Rojo
Luz Verde
Luz Blanca Afectados
Luz Azul Afectados
Luz Roja Afectados
Luz Verde Afectados
400
)
V
µ
(
d
ut
il
p
m
A
250
200
100
BASTONES
50
Intensidad (Cd·s·m-2)
)
V
µ
(
d
ut
il
p
m
A
250
200
2000
Opsina Azul
ns
STR+
STR-
CD-1
Harlan
Luz Blanca
Luz Azul
Luz Rojo
Luz Verde
Luz Blanca Afectados
Luz Azul Afectados
Luz Roja Afectados
Luz Verde Afectados
450
BASTONES
250
200
3000
0
-1000
4000
Inmunorreactividad a opsinas y marcaje nuclear
(DAPI) en animales Sanos y Afectados para la
cepa NMRI. Se muestran cuatro fotografías de la
retina media. En este bloque de cuatro
fotografías encontramos una línea superior,
donde se muestran secciones de animales
Sanos y una línea inferior, donde se muestran las
secciones de animales Afectados. Las
instantáneas de la izquierda del cuadro
muestran la inmunorreactividad a la Opsina
Roja/Verde (color rojo), mientras que las
instantáneas de la derecha del cuadro muestran
la inmunorreactividad a la Opsina Azul (color
verde).
Harlan
b-MIX
PO
CONOS
FLICKER
Janvier
Luz Blanca
Luz Azul
Luz Rojo
Luz Verde
Luz Blanca Afectados
Luz Azul Afectados
Luz Roja Afectados
Luz Verde Afectados
REGISTROS FOTÓPICOS
350
Análisis de los registros electrorretinográficos y su representación de todos
los grupos sometidos a estudio. En la parte izquierda de la figura se muestran
las gráficas obtenidas del análisis de la cepa NMRI, tanto de la casa Harlan
como de la casa Janvier. En la parte derecha se muestran las gráficas
obtenidas del análisis de la cepa CD1 (de ambas casas). En una línea superior
de esta figura aparecen los histogramas de barras para la comparación de los
individuos Sanos (barras negras) con los Afectados (barras grises) para cada
uno de los grupos. En cada caso se representa la media con la Desviación
Estandar. La distribución de los animales Sanos/Afectados de cada grupo en
el histograma de barras es: NMRI-Harlan (5/4); NMRI-Janvier (13/4); CD1Janvier (10/5); CD1-Harlan (1/4/3+). Se representa con ns la no existencia de
diferencias estadísticas y con * cualquier diferencia significativa entre los
valores de cada grupo. Se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba
ANOVA de dos vías, con el análisis posterior de Bonferroni; además se utilizó
la t de student.
En una línea inferior de esta figura se representan las gráficas
Intensidad/Respuesta para los registros fotópicos con diferente longitud de
onda en la fuente de estimulación. Con círculos representamos las
diferentes respuestas, a intensidad creciente de estimulación, de los
individuos sanos; siguiendo un código de colores para los distintos LEDs
(negro= luz blanca; rojo= 650nm; verde= 540nm; azul= 450nm). Con
triángulos se representan los individuos afectados ( con el mismo código de
colores para los LEDs). La distribución Sanos/Afectados en este caso es:
NMRI-Harlan (5/4); NMRI-Janvier (8/2); CD1-Janvier (7/1); CD1-Harlan
(1/4/3+). . Se realizó un análisis estadístico utilizando la prueba ANOVA de dos
vías, con el análisis posterior de Bonferroni (estadística no representada).
(
300
250
200
150
CONCLUSIONES.
100
50
0
1000
2000
3000
0
-1000
4000
0
1000
2000
3000
4000
Intensidad (Cd·s·m-2)
Intensidad (Cd·s·m-2)
CD-1
a-MIX
400
)
V
µ
(
d
ut
il
p
m
A
50
1000
*
Registros ERG
100
0
*
ns
FLICKER
150
Opsina Azul
SANOS
Opsina Roja/Verde
CONOS
300
Intensidad (Cd·s·m-2)
Opsina Roja/Verde
PO
350
300
0
-1000
4000
b-MIX
400
50
3000
a-MIX
450
100
2000
STR-
REGISTROS FOTÓPICOS
150
1000
200
STR+
350
0
200
CD-1
REGISTROS FOTÓPICOS
300
600
Registros ERG
450
350
AFECTADOS
PO
ns
800
400
NMRI Janvier
400
NMRI Harlan
b-MIX
600
Registros ERG
REGISTROS FOTÓPICOS
0
-1000
a-MIX
)
V
µ
(
d
ut
il
p
m
A
800
400
*
NMRI Harlan
)
V
µ
(
d
u
itl
p
m
A
)
V
µ
(
d
ut
il
p
m
A
600
Registros ERG
450
ns
400
0
STR+
800
ns
Opsina Roja/Verde
Opsina Azul
SANOS
)
V
µ
(
d
u
ti
l
p
m
A
ns
Albinos Afectados
*
1000
1000
1000
800
Albinos Sanos
Albinos Afectados
Albinos Afectados
ns
1000
1200
Albinos Sanos
Albinos Afectados
150
(Milipore, AB-5405); para el marcaje de los bastones la Rodopsina (Milipore MAB-5356). Como
marcador de contraste se utilizó un intercalador de DNA, el 4',6-diamidino-2-fenil indol o DAPI.
En todos los casos las imágenes fueron captadas en la zona media de la retina. Se utilizó un
microscopio de Epifluorescencia Olympus BX, con cámara DP-71 en color. Se utilizó un
objetivo20x para la obtención de todas las fotografías.
300
100
40
0,40
-200
Los anticuerpos primarios utilizados para el marcaje de los conos fueron la
Opsina Azul (Milipore, AB-5407 y St. Cruz, OPN1SW sc-14363) y la opsina Roja/Verde
300
200
0,00
electrorretinográfico. Los ratones fueron sacrificados mediante inyección i.p. de Pentobarbital.
Tras la enucleación de ambos ojos se sumergieron en PBS con PFA4% y posteriormente se
crioprotegieron en baños saturados con Sacarosa. Las secciones de 14 mm de retina fueron
obtenidas con un criostato(MARCA). Después de tres lavados en PBS las secciones fueron
bloqueadas durante 1 hora con suero de burro 2% y tritón X100 0,2% disueltos en PBS 0,1M.
Posteriormente las secciones fueron incubadas en PBS, que contenía los anticuerpos primarios,
suero al 2% y tritón al 0,2% durante toda la noche. Al día siguiente, las secciones fueron lavadas
nuevamente por tres veces en PBS 0,1M. A continuación se procedió a la incubación de los
anticuerpos secundarios, también acompañados de suero y tritón, durante 90 minutos.
400
60
-100
INMUNOHISTOQUÍMICA:
El análisis histológico fue realizado sobre los animales CD1 y NMRI con posterioridad al análisis
400
0,60
200
0
ELECTRORRETINOGRAFÍA:
Todos los animales antes referidos fueron sometidos al análisis de su capacidad visual mediante
la prueba no invasiva del Electrorretinograma (ERG) de Campo lleno. Mediante el ERG
analizamos los cambios de potencial eléctrico que acontecen en la retina en condiciones de
oscuridad (escotópicas) y de luz (mesópicas y fotópicas). En los 40 animales se procedió al
registro de las cinco respuestas electrorretinográficas recomendadas por la ISCEV
(International Society for the Clinical Electrophysiology of Vision), además de la Respuesta
Umbral Escotópica (STR). Para el análisis de las respuestas fotópicas añadimos a la fuente de
estimulación de luz blanca, diodos emisores de luz (LED) a longitudes de onda
correspondientes al Azul, Verde y Rojo. El estudio de sensibilidad cromática se vio reforzado por
el uso de técnicas de inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para cada una de las
opsinas presentes en los distintos fotorrecepotores clásicos (conos y bastones).
Los ratones fueron anestesiados con iluminación roja de poca intensidad, realizando una
inyección i.p. de una solución de Ketamina (70 mg/kg) y Xilazina (7 mg/kg). Una vez dormidos se
mantuvieron a la temperatura de 37ºC mediante una manta de agua caliente. Las pupilas
fueron dilatadas aplicando un colirio que contenía 1% Tropicamida (Colicursí Tropicamida,
Alcan Cursí, SA El Mosnou, Barcelona, Spain). Se aplicó topicamente gotas de 2%Methocel (Ciba
Vision AG, 8442 Hetlingen, Switzerland) en cada ojo para proceder a la colocación del electrodo
corneal. Los animales anestesiados fueron colocados en una caja de Faraday para la realización
de los experimentos en las condiciones fotópicas y escotópicas. Las respuestas ERG inducidas
por los destellos de la fuente de estimulación fueron registradas en el ojo derecho de los
animales. De cinco a diez repuestas escotópicas (STR y Bastones), con un intervalo de 30
segundos entre cada una, fueron promediadas por el programa informático. Después el animal
fue adaptado a las condiciones de luz durante 10 minutos con un fondo de iluminación de
~30cd/m2.
Las señales del ERG fueron amplificadas y filtradas en una banda entre 1 y 1000 Hz con un
amplificador Grass (CP511 AC amplifier, Grass instruments, Quinay, MA). Las señales electricas
fueron digitalizadas a 10Hz con el programa de Power (AD instruments, CA). Los cambios de
potencial electrico fueron registrados con una lente corneal (Burian-Allen electrode, Hansen
Ophtalmic Development Lab Coralville, IA), con un electrodo de referencia localizado dentro de
la boca del animal y un electrodo de tierra en la cola del mismo.
(I)
STR Sano
Opsina Roja/Verde
AFECTADOS
INTRODUCCIÓN.
2
Opsina Azul
Inmunorreactividad a opsinas y marcaje nuclear
(DAPI) en animales Sanos y Afectados para la
cepa Cd1. Se muestran cuatro fotografías de la
retina media. En este bloque de cuatro
fotografías encontramos una línea superior,
donde se muestran secciones de animales
Sanos y una línea inferior, donde se muestran las
secciones de animales Afectados. Las
instantáneas de la izquierda del cuadro
muestran la inmunorreactividad a la Opsina
Roja/Verde (color rojo), mientras que las
instantáneas de la derecha del cuadro muestran
la inmunorreactividad a la Opsina Azul (color
verde).
• Los animales albinos habitualmente suministrados por casas
comerciales pueden presentan un significativo número de
individuos con defectos en la función visual fotópica.
• El porcentaje de animales Sanos y Afectados varía de unas
partidas a otras, pudiéndos estimar un valor de 20-40% de
animales afectos.
• El defecto fotópico se da tanto en cepas albinas CD1 como NMRI.
• Los defectos de función visual no son debidos a una pérdida
designificativa del número de conos.
• Especulamos que la alteración de la transmisión sináptica entre
conos y células bipolares de cono podrían ser causa de esta
alteración.
AGRADECIMIENTOS.
Este trabajo ha sido posible por el soporte del Programa Torres Quevedo (PTQ-03588) y la Empresa ALTA
EFICACIA TECNOLOGÍA, S.L.
Mi agradecimiento personal al Dr. Nicolás Cuenca y la Dra. Violeta Gómez-Vicente por su generosidad.