ME-711.04-070 (V3) Aminas Biogenas histamina

DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
1.
ME-711.04-070
Emisión:
2002
Versión: 3
Actualización:
05-05-2014
Página 1 de 8
OBJETIVO
Determinar histamina y otras aminas biógenas por HPLC con detector UV.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
El método es aplicable a los alimentos sospechosos de contener histaminas y otras aminas
biógenas, principalmente productos hidrobiológicos frescos o procesados, harina de pescado,
quesos y cecinas, recepcionados en la Sección Química de Alimentos.
3.
FUNDAMENTO
Extracción de aminas biógenas en ácido tricloroacético, derivatización precolumna mediante
cloruro de dansilo y posterior análisis de los respectivos derivados dansilados por HPLC con
detector UV.
4.
DOCUMENTOS DE REFERENCIAS
Norma Chilena NCh 2637.Of 2001 Productos hidrobiológicos “Determinación de histamina y
otras aminas biógenas”- Método HPLC con detector UV.
5.
TERMINOLOGÍA
5.1
Aminas biógenas: compuestos alergénicos generados por la degradación de
aminoácidos que están contenidos en pescados y otros alimentos como derivados
lácteos, cecinas, hígado de vacuno y ave, cacao, vinos y cerveza, los que al ser
consumidos pueden causar reacciones alérgicas o cuadros de intoxicación.
5.2
HPLC
6.
: Cromatografía líquida de alta resolución
REACTIVOS, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
REACTIVOS
6.1.1
Acetona p.a.
6.1.2
Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84).
6.1.3
Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con
estándar interno de efedrina 250 ppm
6.1.4
Fase móvil: metanol HPLC y agua desionizada y filtrada (se usa gradiente).
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
6.1.5
6.2
ME-711.04-070
Estándares:
Aminas biógenas:
Actualización:
05-05-2014
Página 2 de 8
Putrecina
Cadaverina
Tiramina
Histamina
Espermidina
INSUMOS
6.2.1
Tubos de centrífuga con tapa rosca de 50 mL
6.2.2
Papel filtro Whatman N° 1, 4 o equivalente
6.2.3
Filtros de membrana de 0.22 m
6.2.4
Viales con tapa de 2 a 3 mL
6.2.5
Columna C-18 fase reversa, 125-4 (5 m) o equivalente
6.3
EQUIPOS
6.3.1
Equipo HPLC con detector UV de longitud de onda variable.
6.3.2
Balanza analítica 0.0001 g.
6.3.3
Balanza de precisión 0.01 g
6.3.4
Agitador mecánico de tubos
6.3.5
Baño termorregulado a 60 °C
6.3.6
Centrífuga 2000 a 3000 rpm
6.3.7
Micropipetas de 100 – 1000 L
7.
Emisión:
2002
Versión: 3
DESCRIPCIÓN DE ACTIVIDADES
Antes de comenzar a trabajar con las muestras, asegurarse de que todo lo mencionado en
punto materiales, insumos y reactivos esté disponible.
A continuación se describe el método analítico, es crucial si no se dispone de práctica
con el método leer completo este procedimiento antes de comenzar a trabajar.
Es necesario utilizar guantes para este trabajo analítico como medida de bioseguridad.
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
7.1
ME-711.04-070
Emisión:
2002
Versión: 3
Actualización:
05-05-2014
Página 3 de 8
MUESTREO / MUESTRA
7.1.1
Chequear que antecedentes de la muestra en guía de ingreso coincidan con los
rotulados en la muestra.
7.1.2
Una vez recibida la muestra en el laboratorio se debe realizar el análisis lo más
pronto posible. En caso de ser necesario postergar el análisis, ésta se debe
mantener a –18 °C si la muestra proviene de producto congelado; entre 0 °C y 4 °C
si la muestra corresponde a un producto fresco refrigerado, no debiendo superar
más de 36 h en esta condición y a temperatura ambiente si la muestra corresponde
a pescado seco, harina de pescado u otro producto con baja humedad.
7.1.3
Al finalizar el trabajo y una vez informada la muestra, si la cantidad restante lo
permite, almacenar aproximadamente 20 g de muestra como contramuestra y
eliminar lo restante en bolsa de eliminación de desechos de laboratorio (Bolsa roja
y/o amarilla). Anotar fecha de eliminación de la muestra en los antecedentes de la
misma en Registro 711.00-074 “Registro de ingreso de muestras al Laboratorio de
Toxinas Marinas y Micotoxinas”
7.2
PREPARACIÓN DE REACTIVOS
7.2.1
Solución de bicarbonato de sodio 0.25 M (PM=84). Pesar 5.25 g de NaHCO 3 y llevar
a un matraz de 250 mL, aforando con agua desionizada filtrada.
7.2.2
Cloruro de dansilo 10 mg/mL. Pesar 50 mg de cloruro de dansilo y llevar a un matraz
de 5 mL aforando con acetona p.a. Guardar refrigerado en envase ámbar bien
cerrado.
7.2.3
Solución de ácido tricloroacético (TCA) al 5% con estándar interno de efedrina 250
ppm. Pesar 25 g de TCA en un matraz aforado de 500 mL, agregar 0.125 g de
efedrina p.a. y aforar con agua para análisis.
7.2.4
Estándares:
Aminas biógenas:
7.2.5
Putrecina
Cadaverina
Tiramina
Histamina
Espermidina
Preparar una solución patrón de 1000 mg/L de cada una de las aminas biógenas:
Pesar 50 mg de cada una y aforar a 50 mL con solución de TCA 5% con estándar
interno.
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
Emisión:
2002
Versión: 3
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
Actualización:
05-05-2014
Página 4 de 8
ME-711.04-070
7.3
PREPARACIÓN DE CURVA DE CALIBRACIÓN
7.3.1
Preparar a partir de las soluciones patrones, una mezcla que contenga al menos 3
niveles desde 50 a 500 µg/mL para la curva de calibración. Aforar cada vez con TCA
5% con estándar interno.
7.4
PREPARACIÓN DE CONTROLES
7.4.1
Preparar un fortificado al límite de cuantificación del método.
7.5
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O ETAPAS PREVIAS A REALIZAR LA
MEDICIÓN
7.5.1
Conservas: Si el líquido de cobertura es comestible, se recomienda homogeneizar
todo el contenido del envase de lo contrario drenar el producto y homogeneizar en
procesadora de alimentos a alta velocidad durante 60 s.
7.5.2
Congelados: Descongelar dejando a temperatura ambiente por un máximo de 4 h y
drenar.
7.5.3
Productos pesqueros salados: Preparar una solución saturada de cloruro de sodio y
sumergir en ella el producto en salazón algunos segundos para retirar la sal superficial.
Sacar la muestra de la solución y secar con papel absorbente, eliminar las espinas,
trozar y preparar el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta
velocidad durante 60 s.
7.5.4
Productos seco-salados, apanados, ahumados, quesos y derivados cárnicos: Preparar
el homogeneizado del producto en procesadora de alimentos a alta velocidad durante
60 s.
7.5.5
Pescado fresco: limpiar, descamar, eviscerar y preparar el homogeneizado durante 60
s como se indica a continuación:
a) Pescados de tamaño pequeño ( 15 cm): en su totalidad.
b) Pescados de tamaño mediano: Sacar y descartar cabeza, cola, aletas y espinas;
cortar en filetes para obtener toda la carne y piel.
c) Pescados de tamaño grande: De cada uno de más de tres pescados cortar tres
rebanadas en sentido transversal de 2.5 cm cada una, detrás de la aleta pectoral,
en el medio y después de la abertura anal. Eliminar las espinas.
7.5.6
Mariscos frescos refrigerados y/o vivos: lavar, drenar y desconchar.
7.5.7
Homogeneizar la muestra en procesadora de alimentos de alta velocidad por un
minuto.
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
DUEÑO DE PROCESO:
APROBADO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
Emisión:
2002
Versión: 3
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
Actualización:
05-05-2014
Página 5 de 8
ME-711.04-070
7.5.8
Pesar 5 g en un tubo de centrífuga de 50 mL y agregar exactamente 10 mL de TCA
5% con estándar interno y tapar.
7.5.9
Agitar por 30 min en agitador mecánico.
7.5.10 Centrifugar a 2000-3000 rpm por 15 min.
7.5.11 Filtrar el sobrenadante a través de un embudo con papel filtro.
7.5.12 Filtrar el extracto a través de filtro 0.22 m.
7.5.13 Realizar reacción de dansilación de la siguiente manera:
En un vial de vidrio con tapa adicionar consecutivamente:
100 L de extracto o soluciones estándares
400 L de bicarbonato de sodio 0.25 M (pH 8 a 9)
200 L de solución de cloruro de dansilo
300 L de acetona p.a.
7.5.14 Cerrar herméticamente el vial e incubar a 60 °C en baño termorregulado por 1 hora.
7.5.15 Enfriar a temperatura ambiente.
7.5.16 Inyectar 20 L de la muestra en HPLC.
7.5.17 Utilizar como blanco solución de TCA 5% con estándar interno y dansilar de igual
forma que los estándares y las muestras
7.6
ANÁLISIS DE LA MUESTRA O REALIZACIÓN DE LA MEDICIÓN. CONDICIONES
INSTRUMENTALES.
7.6.1 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
Flujo de la fase móvil: 1 mL/min
Longitud de onda: 254 nm
Volumen de inyección: 20 µL
Temperatura del horno de columna: 25°C
Programa de gradiente de fase móvil
Tiempo (min)
Metanol (%)
0
70
20.0
75
20.1
100
22.0
100
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
Agua (%)
30
25
0
0
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
Emisión:
2002
Versión: 3
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
Actualización:
05-05-2014
Página 6 de 8
ME-711.04-070
22.1
30
70
70
30
30
7.6.1
Estabilizar por 15 minutos.
7.6.2
Todas las soluciones deben sonicarse si el equipo HPLC no cuenta con desgasificador
on line.
7.6.3
Limpiar la jeringa y el inyector con agua después de cada inyección.
7.6.4
Al final del trabajo lavar la columna con: 70% metanol y 30% agua por 15 a 30 min.
7.6.5
Los tiempos de retención aproximados son:
Amina biógena
7.7
Tiempo de retención (min)
Efedrina
4a6
Putrecina
6a7
Cadaverina
7a9
Histamina
12 a 14
Tiramina
19 a 21
Espermidina
22 a 25
CÁLCULO DE RESULTADOS
7.7.1
Calcular el nivel de histamina en µg/mL entregado por el HPLC utilizando estándar
interno usando la siguiente fórmula:
Cm = {(Am/Asi)-b} / m
Cm
= Concentración de la amina biógena en el HPLC µg/mL
Am
= Área de la amina biógena de la muestra
m
= Pendiente de la curva de calibración
b
= Intercepto de curva de calibración
Asi
= Área del estándar interno
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
Emisión:
2002
Versión: 3
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
Actualización:
05-05-2014
Página 7 de 8
ME-711.04-070
7.7.2
La concentración total de aminas biógenas se realiza sumando las concentraciones
de cada amina biógena.
7.7.3
Para determinar la concentración de cada amina biógena en la muestra, usar la
siguiente fórmula:
C = Cm x 10
g
Donde:
C
= concentración de amina biogénica en mg/kg, de la muestra
Cm = concentración de amina biogénica de la muestra en µg/mL obtenida de la
curva de calibración
g
7.8
= peso de la muestra en gramos
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DEL ENSAYO
Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los
ensayos realizados con el método de ensayo recogido en este procedimiento. Los
controles de calidad quedan agrupados en tres niveles de control:
a. Nivel I: Ensayos de intercomparación, según disponibilidad.
b. Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas
por el analista.
7.9
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
La forma como se expresan los resultados en el informe de ensayo es en mg/100g
de Histamina.
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición
Emisión:
2002
Versión: 3
DETERMINACIÓN DE AMINAS BIOGENAS
(HISTAMINA)
Método HPLC
Sección Química de
Alimentos y Nutrición
8.
Actualización:
05-05-2014
Página 8 de 8
ME-711.04-070
REGISTRO
IDENTIFICACION
RGG-700.00-034
Registro
preparación de
soluciones
estándares puros
RG-711.00-080
Registro de
análisis de Toxinas
marinas y
micotoxinas
9.
RESPONSABLE
TIEMPO
Técnico y
profesional del
laboratorio
5 años
Técnico y
profesional del
laboratorio
5 años
ALMACENAMIENTO
LUGAR
MEDIO
RESPONSABLE/
SOPORTE
RECUPERACION
Papel
Laboratorio de Toxinas
marinas y micotoxinas/
Carpeta de estándares
Papel
Laboratorio de Toxinas
marinas y micotoxinas/
Cuaderno foliado
DISPOSICION
Picado en
trozos, basura
normal
Picado en
trozos, basura
normal
TABLA DE MODIFICACIONES
VERSION
10.
PRINCIPALES
PUNTOS
MODIFICADOS
FECHA
2
05-05-2014
2
05-05-2014
--7.6
CUADRO DE RESPONSABILIDADES
Ejecuta el método
Elabora el informe de
resultados
Técnico o Encargado Encargado
de Laboratorio
Laboratorio
11.
RESUMEN DE MODIFICACIONES
Se modifica documento a nuevo formato institucional,
pasa de PRT a ME
Se agregan condiciones cromatográficas
Aprueba el informe de resultados
de Jefe de Sección Química de Alimentos y Jefe
de Subdepartamento Alimentos y Nutrición
ANEXOS
No Aplica
DUEÑO DE PROCESO:
Encargado Laboratorio de
Toxinas Marinas y
Micotoxinas
ESTE DOCUMENTO FUERA DE LA
INTRANET O IMPRESO SIN TIMBRE
DE “DOCUMENTO CONTROLADO” SE
CONSIDERA COPIA NO
CONTROLADA
APROBADO:
Jefe Subdepartamento
Alimentos y Nutrición