Actividad Bactericida del veneno de Bothrops alternatus del

Resumen: M-099
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Actividad Bactericida del veneno de Bothrops alternatus
del Nordeste de Argentina
Bustillo, Soledad
1-2
2
1
3
2
- Merino, Luis - Leiva, Laura C. - Bal De Kier Joffé, Elisa - Gorodner, Jorge O.
1.Facultad de Ciencias Exactas, Naturales y Agrimensura. Universidad Nacional del Nordeste.
Av. Libertad 5600 - Corrientes, CP: 3400. Argentina. Tel: 54-3783-457996-112. e-mail: [email protected]
2.Instituto de Medicina Regional. Universidad Nacional del Nordeste. Argentina
3.Instituto Angel H. Roffo. Universidad de Buenos Aires.(UBA)
Antecedentes
Los venenos de serpientes contienen un gran numero de proteínas y péptidos biológicamente activos que son en su
mayoría similares en estructura a los que predominan en los sistemas fisiológicos humanos. En la última década, los
componentes del veneno han sido usados como importantes herramientas para el conocimiento de éstos sistemas
fisiológicos (Meier et al 1994, Vogel et al 2004).
La mordedura de serpiente y posterior intoxicación es un proceso asociado con una baja incidencia de infección
bacteriana (Talan et al 1991, Trabi et al 2001). Esto podría indicar la presencia de moléculas con actividad bactericida
en los venenos, que podrían proteger a las serpientes durante su alimentación.
Se ha demostrado que venenos ofidicos, exhiben actividad citotóxica sobre una amplia gama de bacterias (Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, L. monocytogenes, etc), por lo que se evidencia que sus componentes son capaces de
afectar no solo células eucariotas sino también procariotas (Talan et al 1991; Páramo et al, 1998; Lomonte et al, 1999 ;
Soares et al 2000, 2001; Santamaría et al, 2005; Rodríguez V. et al 2005).
El objetivo del presente trabajo es comprobar si el veneno de Bothrops alternatus posee efecto bactericida sobre cepas
ATCC de bacterias gram positivas (Staphylococcus aureus) y gram negativas (Escherichia coli), en ensayos in vitro. El
abordaje de ésta línea del conocimiento posibilitará evaluar el modo de acción como así también una aplicación
potencial de los venenos enteros, ó de algunos de sus componentes, como antimicrobianos (Mazzi et al 2004;
Clementino de Lima et al 2005)
Materiales y Métodos
Venenos
Se utilizó un pool de venenos de serpientes adultas de Bothrops alternatus (yarara grande) de la región Nordeste de la
Argentina, desecados y conservados a -20ºC hasta el momento de ser utilizados.
Cepas Bacterianas
Escherichia coli (cepa ATCC 25922) y Staphylococcus aureus (cepa ATCC 25923) se utilizaron como cepas blanco
para evaluar la actividad bactericida del veneno de Bothrops alternatus. Para ello se realizaron dos tipos de ensayos:
Método de Dilución en placa
Se ajustaron las concentraciones bacterianas a 4x106 unidades de formación de colonias (CFU)/ml. 50 µl, conteniendo
4x105 CFU se incubaron por 60 minutos a 37°C con 50 µl de diferentes concentraciones del veneno (10, 5, 2.5 y
1.25mg/ml). Las bacterias viables se cuantificaron en placas con agar soya tripticasa (Müller-Hinton) luego de 24 hs de
crecimiento a 37°C. Se realizó un blanco incubando las bacterias con solución fisiológica en lugar de los venenos.
(Páramo et al. 1998)
Método de McGeachie.
Se utilizaron placas de Petri de 9 cm de diámetro, conteniendo agar Müller-Hinton. Se realizaron orificios de 2 mm en
el gel utilizando un sacabocados previamente esterilizado. En cada placa los orificios se distribuyeron
equidistantemente. La suspensión de cada bacteria, correspondiente al tubo No.1 de la escala de Mac Farland, se
distribuyó uniformemente en el medio de cultivo. A seguir, se agregó a cada orificio 10 µl de la dilución
correspondiente del veneno (10, 5, 2.5 y 1.25mg/ml). Uno de los orificios se utilizó como control, el cual consistió
solamente en solución fisiológica. Después de la distribución de las diluciones de los venenos, las placas se incubaron
en estufa a 37 °C durante 24 hs. La lectura se realizó por la mensuración del diámetro del halo de la zona de inhibición,
considerando inclusive el diámetro del orificio. (Branson D.)
Discusión de Resultados
Actividad bactericida sobre Staphylococcus aureus
Se aplicó el método de dilución en placa. Se observó una disminución de la viabilidad bacteriana a medida que aumenta
la concentración empleada del veneno. (Figura 1). La cuantificación de la inhibición del crecimiento pone en evidencia
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una brusca reducción de la viabilidad bacteriana, con una letalidad de más del 80% a dosis tan bajas de veneno como de
2,5 mg/ml (Figura 2)
Actividad bactericida sobre Escherichia coli
El método de dilución en placa mostró una reducción en el crecimiento bacteriano a medida que aumenta la
concentración del veneno. El desarrollo extendido de las colonias impidió su recuento, por lo que en este caso el efecto
bactericida del veneno se evaluó por comparación visual de las áreas de crecimiento (Figura 3)
El método de McGeachie, basado en la determinación de la medida del diámetro del halo de la zona de inhibición del
crecimiento bacteriano, permitió la cuantificación de la acción bactericida del veneno botrópico sobre esta bacteria
gram (-). Se constató una disminución de la medida del halo proporcional al aumento de la concentración del veneno.
(Figura 4) El efecto del veneno sobre el crecimiento de las bacterias resultó significativo a partir de una concentración
de 1.25 mg/ml. (Figura 5)
A
B
C
D
Figura 1. Método de dilución en placa. A. Staphilococcus aureus preincubados sin veneno (control). B. Staphilococcus
aureus preincubados con 1.25mg/ml de veneno. C. Staphilococcus aureus preincubados con 2.5mg/ml de veneno. D.
Staphilococcus aureus preincubados con 5 mg/ml de veneno.
% viabilidad bacteriana
25
20
15
10
5
0
1,25
2,5
5
veneno (mg/ml)
Figura 2. Actividad Bactericida. Porcentaje de colonias bacterianas viables de Staphilococcus aureus luego de la
preincubación con diferentes concentraciones del veneno de Bothrops alternatus.
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A
B
C
D
Figura 3. Método de dilución en placa. A. Escherichia coli preincubada sin veneno (control). B. Escherichia coli
preincubada con 1.25mg/ml de veneno. C. Escherichia coli preincubada con 2.5mg/ml de veneno. D. Escherichia coli
preincubada con 5 mg/ml de veneno.
B
C
A
D
F
E
Figura 4. Método de McGeachie-Escherichia coli: A y B 10mg/ml de veneno de B. alternatus. C. 5mg/ml de veneno
de B. alternatus. D. 2.5mg/ml de veneno de B. alternatus. E. 1.25 mg/ml de veneno de B. alternatus. F. 0.625 mg/ml
de veneno de B. alternatus.
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Halo de inhibición (mm)
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12
10
8
6
4
2
0
10
5
2,5
1,25
0,625
Veneno (mg/ml)
Figura 5. Viabilidad bacteriana. Medida de halos de inhibición de crecimiento de Escherichia coli luego de la
incubación con diferentes concentraciones del veneno de Bothrops alternatus.
Conclusiones
Los ensayos realizados permiten concluir que el veneno de Bothrops alternatus (yarará grande) posee actividad
bactericida sobre Staphilococcus aureus (cepa Gram positiva) como así también sobre Escherichia coli (cepa Gram
negativa).
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