Las serina proteasas y su función en los procesos de muerte neuronal

REVISIONES EN NEUROCIENCIA. EDITOR: J.V. SÁNCHEZ-ANDRÉS
Las serina proteasas y su función en los procesos
de muerte neuronal
O. Fuster-Lluch a, M.F. Galindo b, V. Ceña b, J. Jordán b
THE SERINE PROTEASES AND THEIR FUNCTION IN NEURONAL DEATH PROCESSES
Summary. Aims. In this review we analyse the role played by the serine proteases in the nervous system and we focus on the
role they play in degenerative processes. Development. These proteolytic enzymes, together with the caspases, play a vital role
in the processes regulating cell functioning, both in the development stages and following the response to a harmful stimulus.
This family of proteases includes the granzymes and thrombin (TR). The former, which are closely related to proteases I and II
and cathepsin G, are situated in the cytoplasmic granules of the activated T lymphocytes, together with other proteins such as
perforin or cytolysin. Granzymes A and B are linked to degenerative processes. These enter the target cells thanks to the action
of perforin and once inside they are translocated to the nucleus. Granzyme A has been isolated and identified as the agent
responsible for the immediate and complete retraction of neurites in different models. Its physiological substrates include
fibronectin, type IV collagen and the proteoglycans. Granzyme B is characterised by its being a cysteine protease with substrates such as prointerleukin-1β, TR receptor and poly(ADP-ribose) polymerase. The family of TR-type proteases includes
proteases such as TR itself, plasmin, kallikrein, urokinase plasminogen activator and tissue plasminogen activator. TR is considered to be an early modulator in damaged tissues which acts as an extracellular signal of death, leading to the activation
of intracellular mechanisms that appear to be mediated by calcium. Serine protease activity is regulated by endogenous
inhibitors, such as plasminogen activator inhibitor, protease nexin-1 and neuroserpin. Conclusions. Upsets in the proteaseinhibitor balance are crucial in the processes involved in the neuronal plasticity and death induced by ischemia in the brain
and by excitotoxins. [REV NEUROL 2004; 38: 449-57]
Key words. Degenerative processes. Granzymes. Neuronal death. Serine proteases.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas proteolíticas desempeñan un papel esencial en los
procesos de regulación de funciones celulares, tanto en etapas
del desarrollo como tras la respuesta ante un estímulo dañino.
En el sistema nervioso (SN) se han descrito diferentes funciones para los miembros de las numerosas familias de proteasas,
entre las que destacan las cisteína proteasas y las serina proteasas (SP), caracterizadas por utilizar un residuo de cisteína y de
serina, respectivamente, mediante el cual llevan a cabo las catálisis nucleofílicas, y que participan en los procesos degenerativos que en él tienen lugar (Tabla).
La presencia de las SP y de sus receptores en el SN constituye un intríngulis, debido a que algunas de las formas catalíticamente activas no se han localizado todavía en condiciones
fisiológicas dentro del parénquima neuronal [1], aunque resultan elevadas en situaciones neuropatológicas como la enfermedad de Alzheimer (EA), procesos que rodean a la isquemia o en
traumatismos craneoencefálicos, entre otros [2-5].
Así, y dada su relevancia, en esta revisión nos centraremos
en el grupo de las SP y, dentro de ellas, en dos familias muy numerosas y con un papel importante en diferentes vías de señalización que dominan programas de muerte neuronal: las granzimas y las trombinas (TR).
LA FAMILIA DE LAS GRANZIMAS
Las granzimas son una familia de SP que se localizan en los
gránulos citoplasmáticos de los linfocitos T activados, y se liberan en respuesta a la interacción de éstos con células que expresan antígenos, células diana. Durante este apartado intentaremos dar una visión global de los miembros de esta familia y su
implicación en procesos neurodegenerativos.
 2004, REVISTA DE NEUROLOGÍA
Generalidades
Los linfocitos T citolíticos (LTC) son un subgrupo de células T
cuya función es lisar, matar, las células diana. Éstos lo hacen de
una manera rápida, y utilizan dos rutas que se activan una vez
que los receptores de membrana han reconocido determinados
antígenos en estas células. El primero es un mecanismo secretor,
que implica procesos de exocitosis del contenido de gránulos ya
maduros que poseen en su citoplasma, mientras que el segundo
se media por la expresión del ligando Fas (FasL), que reacciona
con los receptores Fas (FasR) de la célula diana (Fig. 1) [6]. Sin
embargo, otras células del sistema inmune, las natural killer
(NK), implicadas en la inmunidad natural, utilizan principalmente el mecanismo mediado por la secreción del contenido de
sus gránulos.
La susceptibilidad de las células neuronales a la lisis mediada por los LTC es importante en el entendimiento de la respuesta mediada por células en el sistema inmune durante el rechazo
de un transplante de tejido nervioso y la respuesta inflamatoria
que se produce en el SN, tanto central (SNC) como periférico
(SNP), hecho que resulta también de gran importancia en los
procesos que acompañan a las infecciones intracelulares no
fagocíticas, como son las infecciones virales o bacterianas, así
como frente al crecimiento de células tumorales.
Se ha observado que los linfocitos están implicados en las
etiologías de algunos trastornos neurológicos autoinmunes [7];
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Recibido: 04.12.03. Aceptado tras revisión externa sin modificaciones: 13.01.04.
a
Servicio de Análisis Clínicos. Complejo Hospitalario Universitario de Albacete. b Centro Regional de Investigaciones Biomédicas. Universidad de
Castilla-La Mancha. Albacete, España.
Correspondencia: Dr. Joaquín Jordán. Farmacología. Centro Regional de
Investigaciones Biomédicas. Edificio Facultad de Medicina. Avda. de Almansa, s/n. Universidad de Castilla-La Mancha. E-02071 Albacete. Fax:
+34 967 599 327. E-mail: joaquin. [email protected]
O. FUSTER-LLUCH, ET AL
Tabla. Clasificación de la familia de las serina proteasas. Sustratos e inhibidores.
Otros nombres
Sustratos
Inhibidores
Endógenos
Sintéticos
Granzima A
EC 3. 4. 21. 78, proteinasa de LTC1, factor de Hanukkah
granzima 1, triptasa de LTC, fragmentina 1
Mielina
Distrofina
Nebulina
Fibronectina
Colágeno IV
Proteoglicanos
TOS-Gly- Pro- Arg-/-NhphNO2
PMSF
DFP
Benzamidina
DCI
PhHNCONHCiTEtOIC
Granzima B
EC 3. 4. 21. 79, serina proteasa de células T 1-3E,
proteinasa 2 de linfocitos T citotóxicos, SECT,
granzima 2, catepsina G-1, CTLA-1, fragmentina 2,
C11, IEPD
Caspasas 3, 7, 10.
Prointerleucina-1β
Trombina R
Nucleodina
PARP
Acf-BOC-Ala-Ala-Asp-ACF
PI9
CrmA
Trombina
PAR1
Caspasas
Tripsina
Aquimotripsina
Elastasa
sirvan de ejemplo la esclerosis múltiple, donde la destrucción
de mielina está mediada por células efectoras del sistema inmune [8,9]; los procesos que rodean a la encefalomielitis autoinmune experimental, que pueden remediarse por la inyección de
linfocitos T reactivos frente a la proteína básica mielina [10], y,
por último, en casos de encefalomielitis alérgica se ha descrito
la infiltración de linfocitos CD4+ en el cerebro [11].
Las diferencias en susceptibilidad entre las diferentes poblaciones neuronales del SNP y SNC frente a los procesos de lisis
mediados por células T y el nivel de muerte celular inducido en
cultivos celulares del SN por los LTC, se relacionan directamente con la expresión del MHC-I, que depende de la actividad
y función de las neuronas durante el desarrollo neuronal [12].
Del mismo modo, no se puede excluir que quizás las neuronas
del SNC posean, además, mecanismos de protección que las
convierta en células más resistentes a los procesos de lisis mediados por LTC y gránulos que las neuronas del SNP y los astrocitos [13].
Los LTC necesitan activarse para llevar a cabo la lisis celular. Los procesos de activación comienzan con el reconocimiento de un antígeno asociado a la expresión del producto del gen de
la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-I)
en la superficie celular. Tras el reconocimiento, en el interior de
los LTC se producen flujos de calcio que confieren a los LTC la
capacidad de concentrar y secretar vectorialmente, mediante
procesos de exocitosis, el contenido de sus gránulos citoplasmáticos en las áreas de contacto con sus células diana, y se
necesita una proteína adaptadora 3 citosólica [14], cuya deficiencia conduce a la pérdida de citotoxicidad de los LTC. Por
esta razón, los LTC sólo lisan aquellas células a las que se unen,
y no afectan a las células vecinas, aunque un mismo LTC es
capaz de lisar, de forma secuencial, múltiples células diana.
La capacidad citolítica de los LTC se liga íntimamente a la
presencia de proteínas almacenadas en sus gránulos citoplasmáticos, entre las que destacan, una proteína formadora de poros
en la membrana, la perforina, también conocida como citolisina, la calreticulina, y una familia de serina esterasas asociadas a
los gránulos, conocidas como granzimas, altamente relacionadas
con las proteasas I y II y la catepsina G; éstas se han encontrado
también en otras células del sistema inmune, como mastocitos y
granulocitos neutrófilos. Además, también contienen otras ma-
cromoléculas como toxinas proteicas y proteoglicanos [15,16];
recientes estudios demuestran que la forma inductora de la
apoptosis es un macrocomplejo multicomponente, que consiste
en proteínas catiónicas unidas no covalentemente a un proteoglicano condroitín sulfato, seringlicina [17]. La función biológica desempeñada por la perforina y las granzimas en los procesos de reconocimiento de la célula diana, todavía se desconoce.
Extractos proteicos de gránulos aplicados a cultivos celulares
del SN inducen cambios morfológicos rápidos sobre sus neuritas, así como una rápida retracción e hinchazón y, en algunos
casos, la regresión completa puede ocurrir en pocos minutos
[11], y producir la muerte de la célula. Ni la perforina, ni la
granzima presentan una actividad endonucleasa inherente; pero,
en combinación con otros sistemas, pueden inducir apoptosis en
las células diana, y utilizar rutas que no requieren la participación de la propia maquinaria de la célula, ya que en células
completamente pasivas, como son los glóbulos rojos, los LTC
resultan citotóxicos [18].
La perforina se encuentra en forma de monómeros en el
interior de los gránulos y, cuando se secreta, se inserta dentro
del núcleo hidrocarbonado de la membrana de la célula diana, y
se polimeriza con otras moléculas de perforina, lo que requiere
la presencia de valores de concentraciones de Ca2+ de alrededor
de 1-2 mM, valores que coinciden con los de la concentración
citoplasmática. La perforina polimerizada actúa como un poro
transmebranal hidrofílico anfifílico en la célula diana, que permite el acceso de iones y de las granzimas al interior de la célula, y es capaz de inducir la retracción de las neuritas de cultivos
celulares de una forma casi instantánea, quizás debido a que, de
forma concomitante al Ca2+, tiene lugar la entrada del líquido
circundante. La perforina per se puede originar tal número de
poros, que a la célula diana le resulte imposible restablecer el
incremento en iones y agua en su interior, y producirse su hinchazón osmótico y posterior lisis. La importancia de la perforina se ha reflejado en animales deficientes en dicha proteína, que
presentan altamente comprometida su capacidad de sobrevivir
frente infecciones no citofágicas ocasionadas por virus, así como otras alteraciones inmunológicas [19].
El papel de las granzimas en los procesos de citotoxicidad
y otras respuestas inmunes permanece oscuro, pero sus efectos
parecen mediarse por la hidrólisis de sustratos localizados tan-
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Nexina I (PNI)
Hirudina
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SERINA PROTEASAS Y MUERTE NEURONAL
metabólicas independientes de las caspazas; así, por ejemplo, se ha observado
que, debido a su localización en la membrana nuclear, bcl-2 se ha mostrado capaz de antagonizar el transporte de factores de transcripción como p53 y de algunas enzimas como las cinasas dependientes de ciclina hacia el interior del núcleo
[23,24].
Granzima A
De las ocho granzimas identificadas, las
más estudiadas son la granzima A y la B.
La granzima A, también conocida como
Activación
EC 3. 4. 21. 78, proteinasa de LTC1, faccaspasas 3
tor de Hanukkah, granzima 1, triptasa de
y 10
LTC o fragmentina 1, es la más abundante en el organismo. Estructuralmente es
APOPTOSIS
un homodímero unido por un puente
disulfuro en la Cys-93, y constituye una
proteína de aproximadamente 68 kDa. CoFigura 1. Rutas de señalización intracelulares activadas por granzimas, peroforinas y Fas en la célula
mo otros miembros de esta familia, la
diana.
granzima A se sintetiza en forma de cimógeno y se conduce hasta el aparato de
to extra como intracelularmente. De este modo, algunas gran- Golgi mediante gránulos; pero no resulta claro si su activación,
zimas son capaces de hidrolizar el receptor de TR y desencade- en humanos, requiere la retirada de un dipéptido, Glu-Lys, o de
nar sus cascadas metabólicas, mientras que otras, una vez un péptido más largo, por lo que ésta podría mediarse por la
internalizadas, a través de los poros originados por la perfori- acción de la dipeptidil-peptidasa-1 o por otras SP, también locana, pueden hidrolizar sustratos nucleares. La entrada de granzi- lizadas en los gránulos, como son las catepsinas G, la neutril
mas a través de dichos poros parece ser específica, ya que elastasa, o por miembros de su propia familia, como la granzimoléculas de tamaño similar, como el dextrano, de un peso ma B. La granzima A realiza sus cortes en aminoácidos básicos,
aproximado de 20 kDa, o la proteína p13suc1, no resultan capa- y presentan una afinidad preferencial por los residuos de arginices de acumularse en el interior de las células en presencia de na, aunque también hidrolizan tras residuos de lisina y fenilalaperforina. En este proceso, granzimas y perforinas son interna- nina (Arg-/-Xaa ≥ Lys-/-Xaa ≥ Phe-/-Xaa). Entre los inhibidolizadas dentro de vesículas y, durante su fusión a un endosoma, res de esta SP destacan el PMSF, la protinín DFP, la benzamidies la perforina la encargada de liberar la granzima al citosol. La na y el DCI. El Tos-Gly-Pro-Arg-/-NHPhNO2 es un buen susnaturaleza de los efectos ejercidos por la perforina de la mem- trato sintético para de granzima A.
La granzima A se ha aislado e identificado como el agente
brana para que se produzca dicha internalización no parece
aclararse, pero se baraja la posibilidad de que la perforina responsable de la inmediata y completa retracción de las neuriinduzca una señal y entonces las granzimas puedan captarse en tas cuando cultivos, de líneas celulares neuronales, se exponen a
forma vesicular o acomplejada [20]; aunque otra alternativa extractos de proteínas contenidas en los gránulos de los LTC;
sería que la perforina induzca un cambio en el estado de fosfo- entre sus sustratos fisiológicos se encuentran la fibronectina, el
rilación de alguna proteína requerida para la acumulación de colágeno de tipo IV y los proteoglicanos, que desempeñan una
granzimas. Una vez en el interior de la célula, la granzima se función importante en migración vascular y en procesos de citotransloca desde el citoplasma hasta el núcleo mediante un toxicidad. Sin embargo, alguna de las acciones de esta SP puemecanismo independiente de ATP y que no impiden fármacos de mediarse por la activación hidrolítica del receptor de TR y la
inhibidores de GTPasas. Dicha acumulación nuclear precede a consecuente activación de rutas metabólicas, entre las que se
las alteraciones morfológicas en el ADN características de los encuentran la activación de la proteína cinasa C (PKC). El trataprocesos citolíticos [21], por lo que parece lógico pensar que se miento con fármacos inhibidores de estas rutas, como la estaurosporina, bloquea dichos efectos, los cuales también resultan
produzcan por estas proteasas.
Es importante resaltar que, aunque no evita la entrada de dependientes de la actividad proteásica de las granzimas, ya que
granzima en el citoplasma en presencia de perforina, se ha ob- el inhibidor Ph-HNCONH-CiTEtOIC evita los cambios morfoservado que el producto del gen bcl-2 sí puede prevenir la tras- lógicos [25]. La granzima A, a través del receptor de TR, indulocación al núcleo de las granzimas, de forma concomitante con ce una señal débil de calcio intracelular suficiente para originar
el bloqueo del daño en el ADN, quizás debido a que se integra cambios morfológicos en células neurales, pero que resulta
en una ruta de señalización como puede ser la activación de las insuficiente para causar agregación, incluso a concentraciones
caspasas, paso requerido para la muerte inducida por granzimas de dos órdenes de magnitud más altas [11]. Al competir por el
[22]. Así, inhibidores de caspasas bloquean los procesos de receptor, la granzima A bloquea, de una manera dosisdepenmuerte celular inducidos por granzimas y la degradación de diente, la agregación plaquetaria inducida por TR, sin afectar la
sustratos como la proteína cinasa de ADN y la NuMA. No se respuesta a ADP o al péptido agonista del receptor de la TR
puede descartar que los efectos de bcl-2 se medien por vías SFLLRN, conocido como TRAP (del inglés, thrombine recep-
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O. FUSTER-LLUCH, ET AL
tor agonist peptide); no induce la formación de polímeros de
fibrina a partir de fibrinógeno, ni afecta la actividad catalítica de
la TR para hidrolizar fibrinógeno.
Se ha comprobado que, una vez translocada al núcleo, la
granzima A puede hidrolizar proteínas nucleares específicas, y
activar endonucleasas autolíticas que fragmentarían el ADN,
como es el caso de la proteína nuclear nucleolina [26], que puede inducir la producción de citocinas como las interleucinas 6 y
8, así como el factor de necrosis tumoral [27] y que su liberación en el cerebro puede contribuir a la etiología de los trastornos autoinmunes en el SN [11].
Sin embargo, la delección de la granzima A no altera la
expresión de otros componentes de los gránulos, tales como las
granzimas B-G o la perforina. Los animales deficientes en granzima A son sanos y muestran un desarrollo normal del sistema
hematopoyético, y sus células T y NK resultan indistinguibles, en
su actividad citolítica. Asimismo, ratones deficientes en granzima
A se recuperan frente al virus Choriomeningitis lymphocytica e
infecciones con Listeria monocytogenes [28].
Granzima B
La granzima B, también conocida como EC 3. 4. 21. 79, serina
proteasa de células T 1-3E, proteinasa 2 de linfocitos T citotóxicos, SECT, granzima 2, catepsina G-1, CTLA-1, fragmentina 2
o C11, es un monómero de 32 kDa. Se caracteriza por ser una
cisteína proteasa, que corta en los residuos de ácido aspártico, y
su secuencia es preferente IEPD [29]. Entre sus sustratos destacan la prointerleucina 1-beta [30], así como proteínas tanto intra
como extracelulares, entre las que se incluye el receptor de TR
[11]. Dentro del núcleo, también puede entrar en contacto e
hidrolizar la proteína nucleolina [31], la enzima reparadora de
ADN, la polimerasas poli-ADP-ribosa (PARP) y la subunidad
catalítica de la proteína cinasa dependiente de ADN. Además, la
granzima B es capaz de inducir parada del ciclo celular debido
a su capacidad de inducir rápidamente la activación de ciclina
A/cdc2 y ciclina A/cdK1 [32].
Un hecho que complica el estudio de las rutas metabólicas de
la granzima B es que, al realizar proteólisis detrás de residuos de
aspartato, ésta pueda reconocer una secuencia compatible con el
lugar de activación de la familia de las cisteína proteasas, así
como sustratos comunes a ésta [33]. La granzima B puede activar
las caspasas 3, 7, 9 y 10, aunque presenta especial afinidad por la
7 y 10 [34] y de estas dos, quizás sea la caspasa 10 la más susceptible de activarse por la granzima B, debido, en parte, a su localización citoplasmática [35]. Por tanto, la granzima B presenta
grandes relaciones con la cascada de las caspasas, lo que explica
el hecho de que, en ocasiones, aparezcan sobrecruzamientos entre estas rutas en los procesos de muerte celular [36]. Por ello,
fármacos peptídicos inhibidores de miembros de las caspasas
pueden inhibir la muerte inducida por los LTC, al bloquear la
activación de FasR, y, por tanto, de la caspasas 8 y 10. Sin embargo, se han descrito situaciones donde P35, un inhibidor de las
caspasas 1-4, no inhibe la lisis celular inducida por los LTC [37].
Los LTC provenientes de animales que son deficientes en
granzima B son capaces de inducir daño nuclear en las células
diana, aunque dichos procesos transcurren de una manera más
lenta, mientras que su capacidad de lisar mediante mecanismos
de exocitosis del contenido de sus gránulos, no se altera significativamente [38]. Sin embargo, la capacidad de producir lisis
celular mediada por los NK, de estos mismos animales, sí disminuye parcialmente [39]. En cualquier caso, la microinyección
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de granzima B en el citoplasma resultó suficiente para inducir
muerte celular [40].
LA FAMILIA DE LA PROTEASA TROMBINA
La familia de las proteasas del tipo TR engloba una serie de proteasas que contienen en su centro catalítico residuos de serina,
histidina y ácido aspártico. Dentro de esta familia se engloban
proteasas como la propia TR, que da nombre al grupo, la plasmina, la kallikreína, el activador del plasminógeno urocinasa
(uPA) y el activador del plasminógeno tisular (tPA).
Trombina
La TR es una serina proteasa multifuncional que desempeña actividades biológicas importantes en los procesos de hemostasis
y cicatrización de heridas que van desde procesos de coagulación, en los que participa catalizando la hidrólisis del fibrinógeno a fibrina y la activación de las plaquetas, hasta la estimulación de las respuestas celulares implicadas en los procesos de
inflamación y de reparación de los tejidos dañados.
Así, la TR presenta la capacidad de ser quimioatractiva para
los macrófagos y mitogénica para células de la musculatura lisa
y fibroblastos [41], e induce a partir de todos ellos la secreción
de citocinas y de factores de crecimiento. Además, la TR actúa
como agente regulador en procesos de extensión y crecimiento
de tumores, de modo que miembros de la familia de receptores
de TR, como el receptor activado por proteasas 1 (PAR-1), se
han identificado en diferentes células cancerígenas, con inclusión de glioblastoma y meningioma.
La TR se produce inmediatamente a partir de su cimógeno,
la protrombina, en lugares donde se ha llevado a cabo un daño
tisular, de manera que pueda actuar en las etapas más tempranas
de la cicatrización y como catalizador en las etapas finales de los
procesos de coagulación de la sangre en los lugares de lesión.
Los niveles de TR se mantienen elevados durante días después
de un daño en nervios periféricos, lo que sostiene que la TR puede implicarse en los procesos de cicatrización en el SN [42].
La generación de TR se inicia por células inflamatorias,
monocitos/macrófagos y por células endoteliales angiogénicas
que pueden inducir la exposición del factor del tejido (tissue
factor, TF), el cual resulta ser el cofactor catalítico para otra
serina proteasa, el factor de coagulación VIIa. De esta manera,
la asociación célula-TF-VIIa es el principal activador del factor
X que conduce a la posterior generación de TR.
Durante mucho tiempo se postuló que la TR se sintetizaba
exclusivamente en el hígado, pero gracias al uso de técnicas de
Biología molecular se ha demostrado que también se sintetiza
en otros órganos como el cerebro, y aumenta su expresión significativamente con la edad [43]. Sin embargo, todavía se desconoce si la protrombina se hidroliza hasta TR en el SNC, y se ha
propuesto que el cimógeno ejerza, por sí mismo, una actividad
biológica local dentro del SN [44], excepto en las condiciones
donde la barrera hematoencefálica se altera, en las que sí se ha
descrito la presencia de TR.
Péptidos sintéticos capaces de activar el receptor de TR
protegen a los cultivos de astrocitos y de neuronas frente a
estímulos citotóxicos, hecho que pone de manifiesto que los
efectos de la TR se median vía receptor; pero, por el contrario,
altas concentraciones de TR resultan tóxicas para los cultivos
tanto de neuronas como de astrocitos. Dichos efectos neurotóxicos se bloquean por el inhibidor de TR la proteasa nexina-1
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SERINA PROTEASAS Y MUERTE NEURONAL
liza el corte entre los aminoácidos Arg41Ser42, situados en el segundo dominio extracelular, y genera un nuevo extremo Nterminal que desempeña las funciones de
ligando atado [47,48]. Así, la hidrólisis
de este receptor conlleva a la activación de
una cascada de señales donde se ha descrito la implicación desde segundos mensajeros como la familia de proteínas G y el
calcio, hasta fosfolipasas y cinasas como
la PKC (Fig. 2).
Cultivos de astrocitos estimulados
brevemente con TR o péptidos sintéticos
con capacidad de activar PAR-1, presentan una elevación de la [Ca2+]i de una
forma dosisdependiente. La respuesta de
calcio responde a una curva doble sigmoidal (EC50 3 pM y 150 pM) y puede
bloquearse con fármacos inhibidores de
las fosfolipasa C (PLC), como es el U73122, así como por el inhibidor de la
Figura 2. Mecanismo de acción de la trombina. TR: trombina; TR R: receptor de trombina; PG: proTR, nexina-1, también conocido como neteína G; AA: ácido araquidónico; FT: factor de transcripción; MAP K: MAP cinasa; PL C: fosfolipasa C;
PIP2: fosfoinositol bifosfato; DAG: diacilglicerol; IP3: inositol trifosfato.
xina derivada de la glía. Se ha observado
que en condiciones donde el ion calcio se
retira del medio extracelular, la TR indu(PN-1), y pone de manifiesto que la TR requiere de su capaci- ce un aumento único, estrecho y transiente en Ca2+, hecho que
dad hidrolítica para ejercer su función tóxica, y que TR y PN-1 se ha comprobado mediante thapsigargina, con el fin de vaciar
pueden regular la viabilidad de astrocitos y neuronas en esta- los almacenes de Ca2+ intracelulares; se observa que la respuesdios tempranos que tienen lugar tras un traumatismo en el ta del Ca2+ a TR disminuye o se bloquea completamente, lo que
SNC o en otras condiciones donde la barrera hematoencefálica indica que la TR es capaz de inducir salida de calcio desde sus
almacenes intracelulares. Por tanto, la TR, mediante la activase altera.
Por tanto, la TR se considera como un modulador temprano ción de su receptor de membrana, induce diferentes tipos de resen los tejidos dañados, que sirve como una señal extracelular de puesta de Ca2+, a través de la activación de fosfolipasa C, genemuerte que conduce a la activación de mecanismos intracelula- radas por una combinación de liberación de dicho ion desde los
res, de manera que puede regular la expresión de genes e indu- lugares de almacenamiento intracelular, regulados por inositolcir el crecimiento de neuronas y de astrocitos, pero también trifosfato, y por su entrada a través de la membrana plasmática
retracciones de las neuritas en cultivos de líneas celulares pro- [49]. Este hecho se ha observado en neuronas donde la TR
venientes de neuroblastomas y neuronas provenientes de los incrementa la movilización de [Ca2+]i en su interior y en cultiganglios de la raíz dorsal, efecto que se revierte por la presencia vos neuronales expuestos tanto a TR como al péptido activador
del receptor de TR, que mostraban una rápida activación de fosde un inhibidor específico, hirudina.
Por último, la TR también disminuye la longitud de las neu- folipasa C gamma-1 [50]. Además, la señal de activación
ritas y previene la ramificación de éstas, e induce apoptosis en mediada por el receptor de la TR activa la PKC, cinasas de resimotoneuronas, por un mecanismo dosisdependiente, efectos que duos de tirosina y las cinasas de proteínas activadores mitogénise prevenían si los cultivos también se trataban con hirudina. El cos (MAP cinasa) y resultan en la activación de factores de
tratamiento de los cultivos con un péptido sintético con capaci- transcripción como el factor de transcripción nuclear kappa B
dad de activar el receptor de TR (SFLLRNP) remedaba los efec- (NF-κB) (Fig. 2). Así, el tratamiento de células con sondas antisentido que bloquean la expresión de la proteína p65 de la famitos deletéreos presentados por TR en motoneuronas [45].
lia del NF-κB inhibía los efectos de la TR [51], mientras que
Mecanismo de acción de la trombina
fármacos inhibidores de encimas con capacidad cinasa, como la
El SNC expresa muchos de los componentes de las vías de se- estaurosporina, previenen de los efectos producidos por TR, y
ñalización de las proteasas extracelulares, entre los que se inclu- nos revela cómo la PKC se implica también en estas rutas de
ye la familia de los receptores activados por proteasa (PAR, del señalización. Por último, decir que la toxina del cólera es capaz
inglés protease activated receptor). Estudios inmunocitoquími- de inhibir el incremento en Ca2+, mientras la toxina pertussi no
cos revelan una tinción específica de los receptores de TR en logró modificar significativamente la acción de la TR, y como
neuronas, con un intenso marcaje a lo largo de las neuritas. De lovastatín, un modulador de Ras GTPasa (Rho), presentaba una
los cuatro miembros descritos, el 2 y 4 no se expresan en el tendencia a reducir los efectos [52].
cerebro, mientras que el 3 lo hace muy levemente, y el 1, PAR-1,
La trombina en los procesos neurodegenerativos
es el más importante.
PAR-1 contiene siete dominios intramembranales y se acopla Entre los distintos procesos en los que se implica la TR, parece
a la cascada de señalización mediada por las proteínas G [46]. La ser que interviene de manera decisiva en la modulación neuroTR se une al lugar de unión aniónico de una región acídica, y rea- nal, y participa en la diferenciación y morfología neuronal y en
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O. FUSTER-LLUCH, ET AL
la vitalidad de las células nerviosas, así como en su respuesta
ante una isquemia, y puede llegar a desencadenar una muerte
celular programada.
En cuanto a los procesos de diferenciación neuronal, parece
ser que puede llegar a inhibirlos mediante la degradación de la
matriz extracelular, mientras que la actividad morforreguladora
puede producirse por un péptido agonista del receptor de TR, e
indicar que TR induce los cambios morfológicos por mecanismos mediados por el receptor y no por una segunda degradación extracelular. Los procesos que median la agregación plaquetaria y los cambios morfológicos de los astrocitos, aunque
se median por la proteólisis de PAR-1, son distintos. Péptidos
activadores del receptor que son capaces de revertir los efectos
sobre las neuritas, no desencadenan agregación plaquetaria
[42]. Estos cambios morfológicos inducidos por TR no parecen
mediarse por PKC ni por nucleótidos cíclicos; sin embargo, la
respuesta morfológica a TR se bloquea por pervanadato, un
inhibidor de fosfatasas de residuos de tirosina, y por unos inhibidores de amplio espectro de cinasas. Además, en los cambios
morfológicos, el receptor de TR debería comunicarse con un
efector todavía sin caracterizar, que reorganizaría el citoesqueleto de actina y revertiría el fenotipo diferenciado de las células
neuronales [53].
Los efectos de la TR sobre la viabilidad de las células nerviosas es confuso, aunque parece presentar una función dual,
dependiendo de la concentración, como ya se ha comentado
anteriormente. Esto coincide con el hecho de que concentraciones moderadas de TR resultan protectoras cuando se añaden a
cultivos de neuronas de hipocampo y de astrocitos y éstos se someten a diferentes estímulos citotóxicos como hipoglucemia, retirada de factores de crecimiento de los medios de cultivo, estrés
oxidativo y a la presencia del péptido β-amiloide [54,55]. Sin
embargo, altas concentraciones de TR resultan per se tóxicas
para esas mismas poblaciones celulares [56,57]. Además, la TR
parece implicarse en los procesos de aumento de resistencia por
preisquemias en áreas de cerebro como hipocampo. Así pues, el
tratamiento con dosis bajas de TR (50 pM, 0,01 U/mL) o con
péptidos sintéticos agonistas del receptor inducen protección
frente a situaciones experimentales de isquemia, mientras que el
tratamiento con hirudina, un inhibidor específico de TR, revierte
el efecto protector presentado por situaciones isquémicas condicionantes en un modelo de isquemia en gerbos. Sin embargo,
altas concentraciones de TR, 50 nM (10 U/mL), disminuyen la
viabilidad neuronal que sigue a los procesos de isquemia, y llegan incluso a inducir muerte neuronal per se. Concentraciones
bajas de TR inducen picos en la concentración de calcio intracelular, mientras que concentraciones altas conllevan aumentos
sostenidos en dicha concentración, por lo que las distintas señales en la concentración de calcio pueden resultar en señales bien
de protección o bien de toxicidad de la TR en procesos neuropatológicos como son los procesos de isquemia [58].
El hecho de que la formación de TR aumente en aquellos
lugares donde existe daño vascular, permite postular que la TR
actuaría como un modulador de etapas tempranas, y ejercería
como mensajero extracelular que activaría a miembros de otras
familias de proteasas, intracelulares, como serían las caspasas;
todo ello mediado por la activación de su receptor PAR-1. Quizás por este hecho algunos procesos de muerte celular mediados
por TR pueden bloquearse por la presencia de fármacos inhibidores de caspasas, benciloxicarbonil-Asp-(oMe)-fluorometil cetona (Boc-D-FMK) [59].
454
Por tanto, la TR puede contribuir en procesos agudos como
el traumatismo, así como en procesos crónicos, como es el
caso de la EA. También puede mediar la respuesta inflamatoria
y celular, incluyendo en ellas a las neuronas. Altas concentraciones de TR activan procesos apoptóticos en cultivos de astrocitos y de neuronas, originan la fragmentación de ADN en
fragmentos oligonuclesomales, fragmentación del núcleo y la
prevención de la muerte por la inhibición de la síntesis proteica. La cascada de señalización incluye cinasas de la familia
que fosforilan residuos de tirosina y serina/treonina y a aquellas que tienen como sustrato la actina del citoesqueleto. TR
induce la actividad de RhoA tanto en astrocitos como en neuronas de hipocampo, y la inhibición de la actividad de RhoA mediante la exoenzima C3 atenúa la muerte neuronal, lo cual es
una evidencia más sobre cómo la activación de RhoA se necesita para la inducción de muerte neuronal inducida por TR.
También inhibidores de las cinasas de tirosina bloqueaban la
inducción de RhoA, e indicaban como esta familia de cinasas
se sitúa en un eslabón superior en la cadena de activación de
RhoA, para inducir apoptosis [60].
Otros miembros de la familia
El activador de plasminógeno de tejidos (tPA) es otro miembro
de la familia de las SP implicado en los procesos de plasticidad
neuronal y en los procesos de muerte neuronal inducidos por
isquemia en el cerebro, y por excitotoxinas, en condiciones
donde no aparece inflamación; este último mecanismo parece
mediarse por la degradación de la laminina, que forma parte de
la matriz extracelular.
La actividad proteolítica del tPA se ha descrito aumentada en
modelos donde se ha inducido daño en el nervio ciático. Cuando se realizaron experimentos en modelos de animales manipulados genéticamente que no expresan tPA, en ellos se pudo
observar que los procesos de desmielinización axonal se exacerbaban, lo cual indica que tPA presenta un papel protector en
los procesos de daño del nervio, y que dicho papel protector se
media por la acción proteolítica sobre el plasminógeno. Estos
datos, junto con el daño axonal producido por el aumento del
fibrinógeno, identifican a la fibrina como el sustrato de la plasmina en el SN en condiciones de daño axonal inflamatorio. En
definitiva, la deposición de fibrina aumenta el daño axonal, y,
por lo tanto, la inducción de una cascada proteolítica extracelular resulta un proceso beneficioso con el fin de la retirada de
fibrina. Consistente con esta idea, la degeneración axonal aumentada en los animales que no expresaban tPA o plasminógeno se disminuía por la depleción bien farmacológica o genética
del fibrinógeno. Por tanto, la fibrinólisis mediada por tPA o
plasmina pude ser un mecanismo de respuesta ante múltiples
patologías neuroinflamatorias [61].
La actividad de tPA en el SNC se regula por la activación de
inhibidores de proteasas serina, serpinas, como es el caso del
inhibidor de activador del plasminógeno (del inglés, plasminogen activator inhibitor-1), la proteasa nexina-1 (PN-1), y la neuroserpina (NSP). En condiciones in vitro, PAI-1 se produce por
astrocitos y presenta un papel neuroprotector frente a la citocina
factor de crecimiento transformante-beta1 (TGF-β1) en los mecanismos de muerte celular inducidos por NMDA [62].
La producción de PAI-1, principal inhibidor fisiológico de
los activadores de plasminógeno se media por TR. Así, el receptor de TR, la proteína G sensible a la toxina pertussis, la tirosina-cinasa sensible a genisteína, la fosfolipasa C, y la PKC,
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SERINA PROTEASAS Y MUERTE NEURONAL
pueden implicarse en los procesos intracelulares de producción
de PAI-1, mientras que el tratamiento con forskolina y 8-bromo-AMP cíclico inhibe la producción de PAI-1 inducida por
TR. Asimismo, el tratamiento con hirulog-1, un inhibidor sintético del receptor de TR, suprime la generación de ARN mensajero y los niveles de proteína de PAI-1 inducidos por TR. Por
tanto, la producción de la estimulación de PAI-1 por TR puede
modularse farmacológicamente por inhibidores del receptor
de TR [63].
La adición de plasmina induce un cambio morfológico y un
aumento en la migración, pero no previene o revierte los efectos
sobre el crecimiento de las neuritas. Sin embargo, la inhibición
de la plasmina endógena por su inhibidor específico, aprotinina,
suprime los procesos de migración, pero no induce la génesis de
nuevas neuritas. Además, la retirada o inhibición de TR directamente o por la adición de hirudina induce el crecimiento de las
neuritas, pero no afecta a los procesos de migración. Por otro
lado, la tripsina induce simultáneamente cambios morfológicos
y afecta a la longitud de las neuritas. Por todo ello, la plasmina
puede regular los procesos de migración, mientras las proteasas
de la familia de las TR regulan los procesos de los conos de crecimiento de las neuritas. Aunque la plasmina resulte incapaz de
producir la síntesis de novo de neuritogénesis, su inhibición
potencia de alguna manera la transiente inducción de neuritas
que inhibiría a las proteasas del tipo de la TR [64].
La kallikreína actúa tanto extracelular como extravascularmente. Esta familia de proteasas se han estudiado tradicionalmente en su aspecto de fibrinólisis intravascular, pero también
parecen implicarse en procesos biológicos que implican el
movimiento de las células dentro de la matriz extracelular, procesos que desempeñan un papel importante en la remodelación
de los tejidos, en el desarrollo del SN y en las respuestas al daño
y enfermedades neurodegenerativas [65,66].
CONCLUSIONES
A lo largo de este estudio hemos analizado la importancia de la
familia de SP en procesos neurodegenerativos. Así, estudios
inmunocitoquímicos muestran que algunos miembros de esta
familia (tripsina, quimotripsina y TR) se localizan con sus respectivos inhibidores, serpinas (α1-antitripsina, α1-antiquimotripsina, y la proteasa nexina I) en una situación de desequilibrio a favor de las proteasas en procesos neurodegenerativos,
como los relacionados con la formación de los esferoides axonales o conglomerados de neurofilamentos e inclusiones en
motoneuronas descritas en la esclerosis lateral amiotrófica
[67]. Por otro lado, la activación del receptor activado por proteasas, PAR-1, conduce a la pérdida de maduración de las conexiones presinápticas y postsinápticas de las uniones neuromusculares [68], mientras que el homólogo de las serpinas proteasa nexina I (PNI), así como CrmA, previenen los procesos
apoptóticos descritos en motoneuronas lumbares, además de
aumentar su ARN tras el daño en el nervio [69]. Además, la
TR, por medio de sus receptores, es capaz de producir hiperfosforilación en la proteína tau en neuronas de hipocampo y
conducirlas a la muerte apoptótica, hecho que se relaciona con
la EA [70]. Por tanto, y para concluir, se puede decir que un
desequilibrio entre las SP y sus inhibidores puede conducir a
estados patológicos asociados a algunas enfermedades neurodegenerativas como la EA [71], la esclerosis lateral amiotrófica, e intervenir en la modulación neuronal y en la respuesta
ante estímulos isquémicos.
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SERINA PROTEASAS Y MUERTE NEURONAL
LAS SERINA PROTEASAS Y SU FUNCIÓN
EN LOS PROCESOS DE MUERTE NEURONAL
Resumen. Objetivo. En esta revisión analizamos el papel de las
serina proteasas en el sistema nervioso y nos centramos en su participación en los procesos degenerativos. Desarrollo. Estas enzimas
proteolíticas, junto a las caspasas, desempeñan un papel esencial
en los procesos de regulación de funciones celulares, tanto en etapas del desarrollo como tras la respuesta ante un estímulo dañino.
Dentro de esta familia de proteasas se engloban las granzimas y la
trombina (TR). Las primeras, altamente relacionadas con las proteasas I y II y la catepsina G, se localizan en los gránulos citoplasmáticos de los linfocitos T activados, junto a otras proteínas como
la perforina o citolisina. Las granzimas A y B se relacionan con los
procesos degenerativos. Éstas entran en el interior de las células
diana gracias a la acción de la perforina, y una vez en su interior
se translocan al núcleo. La granzima A se ha aislado e identificado
como el agente responsable de la inmediata y completa retracción
de las neuritas en diversos modelos, y entre sus sustratos fisiológicos se encuentran la fibronectina, el colágeno de tipo IV y los proteoglicanos. La granzima B se caracteriza por ser una cisteína proteasa con sustratos como la prointerleucina-1β, el receptor de TR y
la polimerasa poli(ADP-ribosa). La familia de las proteasas del
tipo TR engloba proteasas como la propia TR, la plasmina, la kallikreína, el activador del plasminógeno urocinasa, y el activador del
plasminógeno tisular. La TR se considera como un modulador temprano en los tejidos dañados, que sirve como señal extracelular de
muerte que conduce a la activación de mecanismos intracelulares
por un mecanismo que parece mediarse por calcio. La actividad de
las serina proteasas se regula por inhibidores endógenos, como el
inhibidor de activador del plasminógeno, la proteasa nexina-1 y la
neuroserpina. Conclusión. Alteraciones en el equilibrio proteasainhibidor resultan cruciales en los procesos implicados en plasticidad y muerte neuronal inducidos por isquemia en el cerebro y por
excitotoxinas. [REV NEUROL 2004; 38: 449-57]
Palabras clave. Granzimas. Muerte neuronal. Procesos degenerativos. Serina proteasas.
REV NEUROL 2004; 38 (5): 449-457
AS SERINAPROTEASES E A SUA FUNÇÃO
NOS PROCESSOS DE MORTE NEURONAL
Resumo. Objectivo. Nesta revisão analisamos o papel das serinaproteases no sistema nervoso e centramo-nos na sua participação
nos processos degenerativos. Desenvolvimento. Estas enzimas proteolíticas, juntamente com as caspases, desempenham um papel
essencial nos processos de regulação das funções celulares, tanto
em etapas do desenvolvimento, como após resposta perante um estímulo nocivo. Dentro desta família de proteases englobam-se as
granzimas e a trombina (TR). As primeiras, altamente relacionadas
com as proteínas I e II e a catepsina G, localizam-se nos grânulos
citoplasmáticos dos linfócitos T activados, junto com outras proteínas como a perforina ou citolisina. As granzimas A e B relacionamse com os processos degenerativos. Estas entram no interior das
células alvo pela acção da perforina e, uma vez no seu interior, deslocam-se para o núcleo. A granzima A foi isolada e identificada
como sendo o agente responsável da imediata e completa retracção
das neurites em diversos modelos, e entre os seus substratos fisiológicos encontram-se a fibronectina, o colagénio de tipo IV e os proteoglicanos. A granzima B caracteriza-se por ser uma cisteinaprotease com substratos como a prointerleucina-1β, o receptor da TR e a
polimerase poli(ADP-ribose). A família das proteases do tipo TR
engloba proteases como a própria TR, a plasmina, a kalikreína, o
activador do plasminogénio, uroquinase, e o activador do plasminogénio tissular. A TR considera-se como um modulador precoce
nos tecidos lesados, que serve como sinal extra-celular de morte
que conduz à activação de mecanismos intracelulares por um mecanismo que parece ser mediado pelo cálcio. A actividade das serinaproteases regula-se por inibidores endógenos, como o inibidor do
activador do plasminogénio, a protease nexina-1 e a neuroserpina.
Conclusão. Alterações do equilíbrio protease-inibidor são cruciais
nos processos envolvidos na plasticidade e morte neuronal induzidos por isquemia cerebral e por excitotoxinas. [REV NEUROL
2004; 38: 449-57]
Palavras chave. Granzimas. Morte neuronal. Processos degenerativos. Serinaproteases.
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