Expresión de la proteína bcl-2 en lesiones activas de la piel en la

sumario
INFORME
Expresión de la proteína bcl-2 en lesiones
activas de la piel en la enfermedad de Behçet
NILGÜN SENTURK, LEVENT YILDIZ, YUKSEL SULLU, BEDRI KANDEMIR Y AHMET YASAR TURANLI
Facultad de Medicina, Universidad Ondokuz Mayis, Samsun, Turquía
■ Resumen
Antecedentes: Se ha demostrado que la expresión
de la proteína bcl-2 desempeña un papel importante
en la patogenia de algunas enfermedades inflamatorias
y neoplasias. En este estudio hemos investigado la presencia de la proteína bcl-2 en lesiones activas de piel
en la enfermedad de Behçet y hemos comparado estos
resultados con muestras de piel normal de pacientes
con la enfermedad de Behçet (EB) y de vasculitis leucocitoclásticas no relacionadas con EB.
Métodos: Se investigaron lesiones activas de la piel
de 23 pacientes con la enfermedad de Behçet, muestras de piel normal de 7 pacientes con enfermedad de
Behçet y muestras de archivo de biopsias de 23 vasculitis leucocitoclásticas cutáneas para determinar la presencia de proteína bcl-2 mediante métodos inmunohistoquímicos. Los resultados de la tinción se valoraron
semicuantitativamente. Se usó el test de χ2 para realizar los análisis estadísticos.
Resultados: Se demostró la expresión de la proteína
bcl-2 en 16 de 23 (69,5%) y 8 de 23 (34,7%) pacientes
con enfermedad de Behçet y vasculitis leucocitoclástica,
respectivamente. Hubo diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos (χ2=27, p<0,05). Ninguna de las muestras de piel normal de pacientes con enfermedad de Behçet expresó bcl-2.
Conclusión: La expresión de proteína bcl-2 puede
desempeñar un papel particular en el desarrollo de las
lesiones de piel en la enfermedad de Behçet, originando
supervivencia prolongada o infiltración de linfocitos.
■ Introducción
La enfermedad de Behçet (EB) es una vasculitis
multisistémica, de etiología desconocida, caracterizada
por recurrencia de ulceración aftosa oral, ulceración
genital, lesiones oculares, diversas lesiones de piel, lesiones vasculares, y afectación del sistema nervioso
central y gastrointestinal (1,2). La EB vascular puede
afectar a arterias y venas de todos los tamaños (3). Las
lesiones de piel son características importantes de la
EB y, entre ellas, las lesiones similares al eritema nodoso, pápulo-ampollares y acneiformes se definen como
criterios diagnósticos por el Grupo de Estudio Internacional (ISG) de la EB (4). Sin embargo, también pueden observarse lesiones parecidas al síndrome de Sweet, pioderma gangrenoso, eritema multiforme, púrpura
palpable, infartos subungueales, bullas hemorrágicas y
ulceraciones extragenitales a lo largo de la enfermedad
de Behçet. Las lesiones de piel de la enfermedad de
Behçet se caracterizan histopatológicamente por vasculitis leucocitoclástica o linfocítica (3).
La regulación de la muerte celular es fundamental
para mantener el sistema inmunocompetente (5). En la
respuesta inflamatoria normal, las células inmunocompetentes activadas se destruyen por apoptosis después
de la fase aguda de inflamación, pero en la EB, la inflamación activa continúa de forma recurrente (6).
El papel de la apoptosis en la eliminación de las
células inflamatorias infiltradas se ha observado en varias enfermedades inflamatorias, como la vasculitis
leucocitoclástica cutánea y la EB (7,8).
El bcl-2 es un protooncogén que codifica una proteína de 25 kilodaltons, que está situada en la membrana interna de las mitocondrias, en el retículo endoplásmico y en la membrana nuclear (9-11). Esta
proteína tiene un efecto regulador sobre varios tipos
específicos de células, previniendo la apoptosis (9,1214). Esto se demostró mediante métodos inmunohistoquímicos. Recientemente, se ha observado el aumento
de la expresión de bcl-2 en células mononucleares de
sangre periférica y de zonas inflamatorias de pacientes
con EB (15).
Pensamos que la investigación de la expresión de
Senturk N, Yildiz L, Sullu Y, Kandemir B, Turanli AY. Expression of bcl-2 protein in active skin lesion of Behçet’s disease. International Journal of Dermatology 2001; 40: 747-750. ©Blackwell Science Ltd.
84
Enfermedad de Behçet
bcl-2 en lesiones de piel activas de pacientes con EB
podría demostrar el papel del fenómeno antiapoptósico en la patogenia de las lesiones de piel de la enfermedad de Behçet. Por otra parte, la investigación de la
expresión de bcl-2 en vasculitis leucocitoclástica cutánea no relacionada con EB podría demostrar similitudes o diferencias en el desarrollo de estas enfermedades. Con el fin de demostrar el papel del fenómeno
antiapoptósico en el desarrollo de las lesiones de piel
de la enfermedad de Behçet, investigamos la presencia
de proteína bcl-2 en lesiones activas de piel y en
muestras de piel normal de pacientes con enfermedad
de Behçet y en vasculitis leucocitoclástica cutánea,
usando métodos inmunohistoquímicos.
■ Materiales
y métodos
Se incluyeron en el estudio 23 pacientes con enfermedad de Behçet, diagnosticada de acuerdo con los criterios del ISG. Todos los pacientes estaban siendo tratados con colchicina y uno de ellos, además de
colchicina, recibía azatioprina. Diecisiete de los pacientes tenían úlceras orales activas (73,91%), 13 tenían úlceras genitales activas (13,04%), 2 lesiones oculares
(8,69%), 8 artralgia (34,78%) y todos los pacientes tenían lesiones activas en la piel en el momento de la
biopsia. Once pacientes tenían lesiones similares al eritema nodoso (47,82%), 10 lesiones acneiformes (43,47%),
1 úlceras genitales (4,34%) y 1 úlceras extragenitales
(4,34%). Las lesiones acneiformes de la piel de los adolescentes localizadas en la cara, cuello, espalda y tórax
no se biopsiaron para evitar confusión con acné vulgar.
Después de obtener el consentimiento informado por
escrito, se extrajeron de 4 mm de material mediante
biopsia por punción en todos los pacientes y se fijaron
en formalina neutral tamponada al 10% durante 12 horas. Después de realizar los procedimientos tisulares habituales, las muestras se embebieron en parafina y se
cortaron en secciones de 4-6 mm. Los tejidos se tiñeron
con hematoxilina y eosina. Cinco porciones tisulares
cortadas con el micrómetro se inmunotiñeron con el sistema amplificado biotina-estreptovidina (Chromogen:
DAB, DAKO Corporation, Carpintería, California, Estados
Unidos) para bcl-2 (ratón, anti-humano, oncoproteína
bcl-2, clon 124, DAKO Corporation, Carpintería, California, Estados Unidos). Se hizo un pretratamiento con la
solución de extracción del blanco DAKO (DAKO Corporation, Carpintería, California, Estados Unidos). El anticuerpo primario de bcl-2 se incubó durante 30 minutos
en una cámara húmeda a temperatura ambiente. Usamos diaminobencideno al 0,6% como cromógeno y las
porciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer.
Se usaron como controles muestras normales de
piel de 7 pacientes con EB sin lesiones de piel acompañantes y muestras de biopsia de piel de 23 pacien-
tes con vasculitis leucocitoclástica cutánea no relacionada con EB, que se seleccionaron de los archivos del
departamento de patología. Estas muestras de prepararon de la misma manera.
Se usó el test de χ2 para los análisis estadísticos y
se consideró significativo un valor de p<0,05.
■ Resultados
De los 23 pacientes, 14 eran hombres (60,9%) y 9
mujeres (39,1%). La edad promedio de los pacientes
fue 34 años (desviación estándar 9,38, intervalo 15-49
años). La duración media de la enfermedad fue 6,77
años (intervalo 1-20 años).
En la exploración histopatológica de las lesiones similares al eritema nodoso se encontró inflamación
neutrófila, a veces, extendida a estructuras más profundas, de los tabiques fibrosos del tejido subcutáneo. En
las lesiones acneiformes se observó inflamación aguda
en la pared de los folículos pilosos, formación de abscesos perifoliculares y vasculitis linfocítica. Además, se
detectaron numerosos macrófagos, linfocitos y células
gigantes con cuerpos extraños alrededor de los folículos pilosos. Se encontraron resultados similares en la
exploración histopatológica de las úlceras genitales y
extragenitales, como inflamación necrotizante y tejido
de granulación en la dermis y tejido subcutáneo.
La tinción bcl-2 se valoró semicuantitativamente;
se dio un valor 0 cuando no había tinción, 1 + cuando la tinción de células mononucleares era < 25%, 2
+ cuando la tinción era del 26%-50%, 3 + con tinción
del 51%-75% y 4 + por encima del 75%.
Figura 1. Expresión de bcl-2 en linfocitos perivasculares (x
200, biotina-estreptavidina, cromógeno: DAB).
85
Rev Intern Dermatol Dermocosm 2002;5:84-87
Tabla 1
Resultados de la tinción de bcl-2
en lesiones activas de piel de EB
Tipo de
lesiones
EN
EA 10
UG 1
UEG 1
Total
Número que expresan que no expresan
de pac.
bcl-2
bcl-2
11
6
1
1
23
8
4
–
–
16
3
7
EN=lesiones similares al eritema nodoso; EA=erupción
acneiforme; UG=ulceración genital; UEG=ulceración
extragenital
Tabla 2
Comparación de los resultados de
bcl-2 en los grupos de pacientes y
controles
Tipo de lesión
EB (lesiones activas)
VL
EB (piel normal)
Tinción de bcl-2*
%
16/23
8/23
0/7
69,5
34,7
0
*χ2 = 4,27, p<0,05, VL = vasculitis leucocitoclástica.
Se observaron varios grados de tinción de bcl-2 en 16
de las 23 muestras (69,56%) (Figura 1). Las biopsias tomadas de las lesiones similares al eritema nodoso tuvieron tinción positiva de grado 0 en tres, 1 + en cuatro, 2 + en tres,
3 + en uno, las lesiones acneiformes: 0 en cuatro, 1 + en
cuatro, 2 + en uno y 3 + en 1. Las lesiones genitales y extragenitales presentaban tinción de grado 1 + (Tabla 1).
Ocho de las 23 muestras de vasculitis leucocitoclástica (34,78%) presentaban tinción positiva de bcl2. Siete de ellas mostraron tinción 1 + y sólo una mostró tinción 2 +.
Las muestras de piel normal de pacientes con EB
no mostraron tinción de bcl-2 (Tabla 2).
En la valoración de la tinción de bcl-2 se halló una
diferencia estadísticamente significativa entre las lesiones de piel de los pacientes con EB y con vasculitis
leucocitoclástica cutánea (de χ2=4,27, p <0,05).
■ Discusión
La apoptosis se define como muerte celular programada, que es fundamental para el mantenimiento de los
organismos multicelulares. Se produce en el desarrollo
86
embrionario normal, en las involuciones orgánicas endocrinas, después del cese de las hormonas tróficas, en los
ataques inmunes mediados por células en tejidos y en la
regresión de las neoplasias con el tratamiento (16,17). Se
regula por diferentes mecanismos, como el sistema de ligandos Fas/Fas, algunas citocinas, como IL-4 (interleucina
4) y FNT (factor de necrosis tisular), y algunos sistemas
reguladores intracelulares, como myc y p53 (18). La
apoptosis desempeña un papel importante en el desarrollo de enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide (18).
El bcl-2 es un oncogén que protege a las células de
la apoptosis y produce proliferación clonal, este oncogén
codifica a una proteína de 25 kilodaltons. La sobreexpresión de este oncogén parece desempeñar un papel en la
transformación y desarrollo maligno de las enfermedades
autoinmunes. Las alteraciones del mecanismo apoptósico en el estadio de maduración linfocítica y diferenciación linfocítica pueden relacionarse con episodios autoinmunes debidos a la no eliminación de clones
linfocíticos auto-reactivos (19).
Steinberg (20) propuso que, en ratones lpr, la apoptosis periférica inadecuada de linfocitos CD4 produce
un aumento de la supervivencia de los linfocitos T y
aumenta la producción de autoanticuerpos.
Miret et al. (19) demostraron el aumento de la concentración de bcl-2, mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas en sangre periférica en pacientes
con lupus eritematoso sistémico (LES) activo, en comparación con los pacientes con LES inactivo y controles
normales. Propusieron que la expresión de bcl-2 se relaciona con la actividad de la enfermedad y puede desempeñar algún papel en la patogenia del LES.
En alguno de los estudios se ha demostrado que las
reducciones de los mecanismos apoptósicos desempeñan
algún papel en la EB. Honna et al. (8) encontraron cuerpos apoptósicos en todas las lesiones similares a eritema
nodoso de pacientes con EB tratados con corticosteroides,
mientras que en pacientes no tratados no los encontraron.
Nakamura et al. (6) demostraron una expresión insuficiente del antígeno Fas (otro sistema que regula la apoptosis) en linfocitos en sangre periférica de 21 pacientes
con EB y propusieron que la disfunción del sistema de ligandos Fas/Fas o su mecanismo regulador podría ser responsable de la inflamación prolongada de la EB.
Hamzaoui et al. (15) demostraron el aumento de la
expresión de bcl-2 en linfocitos T de sangre periférica,
de lavado broncoalveolar y de líquido cefalorraquídeo
de pacientes con enfermedad de Behçet. Propusieron
que la expresión de este oncogén protege a las células
de la apoptosis y produce inflamación prolongada. En
nuestro estudio anterior observamos un momento de la
expresión de bcl-2 en reacciones patérgicas de pacientes con EB y pensamos que la expresión de esta proteína puede desempeñar un papel especial en el desarrollo de las lesiones patérgicas (21).
sumario
Enfermedad de Behçet
Todos los pacientes que participaron en este estudio estaban siendo tratados con colchicina. Hay diferentes estudios respecto a los efectos de colchicina en
la apoptosis. Hu et al. (22) y Gajate et al. (23) demostraron inducción de la apoptosis con colchicina, pero
Feng y Kaplowitz (24) demostraron una protección de
la apoptosis en hepatocitos de ratones tratados con
colchicina.
En este estudio observamos la expresión de la proteína bcl-2 en lesiones activas de piel de la enfermedad de Behçet (69,5%), mientras que sólo 8 muestras
de 23 vasculitis leucocitoclásticas (34,7%) y ninguna
de las muestras de piel normal de pacientes con enfermedad de Behçet presentaban tinción positiva de bcl2.
La proteína bcl-2 de los linfocitos infiltrados puede
permitirles escapar de la apoptosis y prolongar su supervivencia. Estos linfocitos de larga vida pueden desempeñar un papel importante en la inflamación crónica y recurrente de la enfermedad de Behçet. Además, la
expresión de la proteína bcl-2 y la reducción de los mecanismos apoptósicos pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo de las lesiones de piel, que es
diferente de otras vasculitis leucocitoclásticas cutáneas.
Sin embargo, permanece sin determinarse si el aumento
de la expresión de bcl-2 es un intento para mantener la
población de linfocitos activada frente a los factores
etiológicos subyacentes o frente a la alteración primaria
(15). Son necesarios nuevos estudios para entender la
importancia biológica y la significación clínica de las alteraciones de bcl-2 en la patogenia de la enfermedad de
Behçet.
Bibliografía
1. Sakane T, Takeno M, Suzuki N, Inaba G. Behçet's Disease. N Eng J Med
1999; 341 (17): 1284-1291.
2. Kaklamani VG, Variopoulos G, Kaklamanis PG. Behçet's Disease. Semin
Arthritis Rheum 1998; 27: 197-217.
3. Chen KR, Kawahara Y, Miyakawa S,
Nishikawa T. Cutaneous vasculitis in
Behçet's Disease: a clinical and histopathologic study of 20 patients. J Am
Acad Dermatol 1997; 36: 689-696.
4. International Study Group for
Behçet's Disease. Criteria for diagnosis
of Behçet's Disease. Lancet 1990; 335:
1078—1080.
5. Nakayama K, Nakayama K, Negishi I,
et al. Disappearance of the Iymphoid
system in bcl-2 homozygous mutant
chimeric mice. Science 1993; 261
(5128): 1584-1588.
6. Nakamura S, Sagita M, Matoba H, et
al. Insufficient expression of Fas antigen
on helper T cells in Behçet's disease. Br
J Ophthalmol 1996; 80: 174-176.
7. Shi Y, Honma M, Koizumi F. Cutaneous allergic vasculitis: Clinicopathological characterization and identification
of apoptosis. Pathol Int 1998; 48: 705716.
8. Honma T, Bang D, Salto T, et al. Assesment of apoptosis of infiltrating
Iymphocytes in erythema no dosum-like
lesions of corticosteroid treated patients
with Behçet's syndrome. J Submicrosc
Cytol Pathol 1989; 21 (4): 691-701.
9. Hockenhery D, Nunez G, Milliman
C, et al. Bcl-2 is an inner mitochondrial
membrana protein that blocks programmed cell death. Nature 1990; 348
(6299): 334-336.
10. Monaghan P, Robertson D, Amos
TAS, et al. Ultrastructural localization of
bcl-2 protein. J Histochem Cytochem
I992; 40 (12): 1819-1825.
11. Chen Levy T, Nourse J, Cleary M.
The bcl-2 candidate proto-oncogene
product is a 24 kilodalton integralmembrane protein highly expressed in Iymphoid cell lines and Iymphomas carrying the (14: 18) translocation. Moll
Cell Biol 1989; 9 (2): 701-710.
12. Hockenbery DM, Zutter M, Hickey
W, et al. Bcl-2 protein is topographically restricted in tissues characterized
by apoptotic cell death. Proc Natl Acad
Sci USA 1991; 88 (16): 6961-6965.
13. Mah SP, Zhong LT, Liu Y, et al. The
protooncogene bcl-2 inkibits apoptosis
in PC 12 cells. J Neurochem 1993; 60
(3): 1183-1186.
14. Lebrun DP, Wranke RA, Cleary ML.
Expression of bcl-2 in fetal tissues suggest a role in morphogenesis. Am J Pathol 1993; 142 (3): 743-753.
17. WalLer NI, Harmon BV, Gobe GC,
Kerr JFR. Patterns of cell death. Meth
Achiev Exp Pathol 1988; 13: 18-54.
18. Mountz JD, Wu J, Cheng J, Zhou T.
Autoimmune disease: a problem of defective apoptosis. Arthritis Rheum 1994;
10: 1415-1420.
19. Miret C, Font J, Molina R, et al.
BCL-2 oncogene levels correlate with
systemic lupus erythematosus disease
activity. Anticancer Res 1999; 19: 30733076.
20. Steinberg AD. MRL-lpr/lpr disease:
Theories meet Fas. Sem Immunol 1994;
6: 55-69.
21. Sulla Y, Senturk N, Yildiz L, et al.
Bcl-2 expression in skin pathergy reaction of Behçet's Disease. Dermatology
2001; 202: 90-93.
22. Hu YL, Li S, Shyy JYJ, Chien S. Sustained JNK activation induces endothelial apoptosis: studies with colchicine
and shear stress. Am J Physiol 1999;
277: H1593-H1599.
15. Hamzaoui A, Hamzaoui K, Kooli C,
et al. High levels of bcl-2 protein in the
T Iymphocytes of patients with Behçet's
disease. Clin Exp Rheumatol 1996; 14:
106-107.
23. Gajate C, Barasoain I, Andrea JM,
Molllinedo F. Induction of apoptosis
in leflkemic cells by the reversable
microtubule-disrupting agent 2-Methoxy-5 (2', 3', 4'-trimethoxyphenyl) 2,4,6-cycloheptatrien- 1 -one: Protection by bcl-2 and bcl-X L and cell cycle arrest 1 . Cancer Res 2000; 60:
265I-2659.
16. Weedon D, Searle J, Kerr JFR.
Apoptosis. Its natura and implications
for dermatopathology. Am J Dermatopathol 1979; 1: 133-144.
24. Feng G, Kaplowitz N. Colchicine
protects mice from the lethal effect of
an agonistic anti-Fas antibody. J Clin Invest 2000; 105 (3): 329-339.
87