SECCIONES DE ESÓFAGO DE MONO

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PORTAOBJETOS PARA
INMUNOFLUORESCENCIA SECCIONES DE ESÓFAGO DE MONO/
RIÑÓN DE RATA
Spanish
Para uso diagnóstico in vitro
Código Producto: FS400.1,
FS400.2.
RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
Las muestras de sangre deben proceder de extracciones venosas, dejadas coagular
naturalmente. Separe el suero lo más rápidamente posible para evitar la hemólisis. El suero
debe conservarse a 2-8°C si el ensayo se ejecuta dentro de las 48 horas. Para periodos más
largos, se recomienda distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C o temperatura
inferior. NO congele y descongele los sueros más de una vez. Evite el uso de sueros
lipémicos, hemolizados o contaminados por microbios, puesto que pueden dar lugar a títulos
más bajos o patrones de coloración poco claros.
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8.1
METODOLOGÍA
Materiales suministrados
8.1.2
FS400.1, FS400.2
10 x Monkey oesophagus/Rat kidney Slides – (5 well) (10x portaobjetos de 5
pocillos con esófago de mono/riñón de rata) y 25 x Monkey oesophagus/Rat
kidney - 5 well slides (25x portaobjetos de 5 pocillos con esófago de mono/
riñón de rata) respectivamente.
1 folleto de instrucciones.
8.1.1
8.2
Material necesario no suministrado
Producido por:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
8.2.1
8.2.2
8.2.3
Teléfono: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: [email protected]
8.2.4
PBS para dilución de muestras y lavados.
Recipiente para el tampón PBS.
Micropipetas y puntas desechables para dispensar las muestras de los
pacientes.
Cámara húmeda para las fases de incubación (p.ej. Cámara de Coloración
Magnética, Código BD010).
Microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 495nm y filtro de barrera
de 515nm.
Botella de plástico a presión para el lavado inicial en PBS.
Pueden adquirirse los siguientes componentes adicionales de The Binding Site:
PBS (CON 3.3), control negativo (CON 92), control positivo al pénfigo (FA115),
control positivo al penfigoide (FA116), control positivo al endomisio (FA141),
conjugado anti-IgA humanas (FA010), conjugado anti-IgA humanas adsorbido
con tejido de mono (FA010.M), solución Azul de Evans al 1% (CON 93) y
solución de montaje (CON 195).
8.2.5
8.2.6
8.2.7
1
PROPÓSITO
Las secciones de esófago de mono/riñón de rata se utilizan en los ensayos de
inmunoflorescencia indirecta, para el screening de los anticuerpos circulantes en el suero
humano ante los antígenos intraepidérmicos o las áreas de la membrana basal, como auxiliar
en el diagnóstico respectivamente del pénfigo y del penfigoide buloso. Las secciones pueden
utilizarse también para la detección de los anticuerpos endomisiales/ante la reticulina como
auxiliar en el diagnóstico de la enfermedad celíaca.
2
Los anticuerpos dirigidos contra la membrana basal se detectan tradicionalmente en el
penfigoide buloso. En esta patología, la biopsia directa revela una deposición lineal de IgG y
C3 a lo largo de la unión dermoepidérmica. Un patrón similar se encuentra cuando se utiliza
este producto en los ensayos de inmunoflorescencia indirecta en las áreas de la membrana
basal del esófago. Estos autoanticuerpos están presentes normalmente, aunque no siempre,
en el suero de los pacientes afectados por la patología. Sin embargo, el título anticorporal no
se correla con el estado patológico y durante la remisión clínica pueden todavía estar
presentes anticuerpos tanto en los tejidos como en el suero.
Se recomienda el uso del conjugado The Binding Site anti-IgG humanas (H+L) FITC
(adsorbido con tejido de mono) (FA003.M) para determinar los anticuerpos mencionados. La
ausencia de coloración tisutal no específica aumenta la sensibilidad y facilita la interpretación.
Los anticuerpos endomisiales se dirigen contra las fibras con “aspecto de reticulina” del tejido
conectivo alrededor de las fibras del músculo liso en el tracto intestinal de los primates. En la
enfermedad celíaca se notifica cerca del 100% de sensibilidad y especificidad a los
anticuerpos IgA endomisiales. Los anticuerpos endomisiales se utilizan para el screening de la
enteropatía gluten-sensible. Los anticuerpos reticulina muestran una coloración fluorescente
del tejido conectivo fibrilar alrededor de los túbulos y glomérulos del riñón.
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8.3.1
Solución de montaje: Saque la solución de montaje de la nevera para llevarla a
temperatura ambiente (18-28ºC) antes del uso.
8.3.2
PBS concentrado. Diluya el PBS con agua destilada (1 parte de PBS
concentrado + 19 partes de agua destilada) y mezcle. El PBS se utiliza para
diluir las muestras de los pacientes y como tampón de lavado.
8.3.3
Dilución de muestras de los pacientes.
Screening: Diluya las muestras 1/10 añadiendo 20µl de suero a 180µl de
tampón PBS.
Titulación: Realice diluciones seriadas de las muestras positivas con PBS (p.ej.
1/10, 1/20, 1/40, 1/80, etc.).
Por ejemplo: tome 100 µl de la dilución 1/10 y diluya con 100µl de PBS para
obtener una dilución 1/20. Repita el procedimiento para otras diluciones.
8.3.4
Portaobjetos con substrato. Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura
ambiente (18-28°C) antes de sacarlos del envase. Etiquete los portaobjetos
correctamente, colóqueles en la cámara húmeda y añada el control positivo y
negativo en los respectivos pocillos. Añada 50µl de las muestras diluidas en los
pocillos restantes.
8.3.5
Incubación de portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 30 minutos en una
cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28ºC).
8.3.6
Lavado con PBS. Saque los portaobjetos de la cámara húmeda y aclárelos
brevemente con el PBS en una botella de plástico a presión. No rociar
directamente en los pocillos. Coloque los portaobjetos en un rack, sumérjales en
el PBS, después agite durante 5-10 minutos.
8.3.7
Adición de conjugado fluorescente. Elimine el exceso de PBS y seque el
contorno de los pocillos con papeles absorbentes suministrados. Vuelva a
colocar los portaobjetos en la cámara húmeda y cubra inmediatamente cada
pocillo con una gota de conjugado fluorescente diluido. NO DEJE LOS
POCILLOS DESCUBIERTOS DURANTE MÁS DE 15 SEGUNDOS. El secado
del substrato afecta negativamente los resultados.
8.3.8
Incubación de portaobjetos. Incube los portaobjetos durante 30 minutos en una
cámara húmeda a temperatura ambiente (18-28°C) a oscuras.
8.3.9
Lavado con PBS. Vuelva a lavar, tal como se describe en el paso 8.3.6.
Coloración de contraste opcional: añada 2-3 gotas de Azul de Evans al 1% por
cada 100 ml de PBS.
8.3.10
Montaje con cubreobjetos. Quite uno a uno los portaobjetos de la solución PBS
de lavado. Seque rápidamente el contorno de los pocillos y añada una gota de
solución de montaje en cada pocillo. Coloque con cuidado el portaobjetos en el
cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de aire, pero sin intentar eliminar
las que se hayan formado. Elimine el exceso de solución de montaje del
contorno del cubreobjetos.
8.3.11
Examen de portaobjetos con el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos
pueden conservarse a 2-8ºC a oscuras durante un máximo de 3 días, sin
pérdida significativa de fluorescencia.
PRINCIPIO
Se utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta en la que las muestras de los
pacientes y los controles adecuados se incuban en los portaobjetos con las secciones. Los
anticuerpos no reactivos se eliminan mediante lavado y, a continuación, se aplican los
conjugados marcados con fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediante lavado, tal
como se ha hecho anteriormente. Los portaobjetos se examinan en un microscopio de
fluorescencia. Los portaobjetos se examinan con un microscopio de fluorescencia y las
muestras positivas producen una fluorescencia de color verde brillante que corresponde a las
áreas de la sección en las que se ha unido el autoanticuerpo (ref. 1).
REACTIVOS
Secciones de esófago de mono/riñón de rata en portaobjetos de 5 pocillos envueltos
individualmente en envases de aluminio con agente desecante.
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PRECAUCIONES
Deben establecerse métodos de manipulación y eliminación adecuados para todos los
materiales potencialmente infecciosos y los procedimientos deben permitirse sólo a personal
experto y autorizado.
6
Procedimiento
Control de calidad
Los controles negativos y positivos deben efectuarse cada vez que se dosifican
las muestras.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN
Los anticuerpos intraepidérmicos, que caracterizan diferentes formas clínicas de pénfigo,
reaccionan con los antígenos presentes en la superficie célular de los queratinocitos
epidérmicos. Si el resultado del ensayo es positivo, se encuentra un patrón típico de “enrejado
de alambre” en el epitelio estratificado del esófago. La deposición tisutal de inmunoglobulinas
occurre en casi todos los casos. En las enfermedades bulosas se recomienda analizar
siempre tanto el suero como los tejidos del paciente.
3
8.3
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Los portaobjetos no abiertos deben conservarse a 2-8°C y pueden utilizarse hasta la fecha de
caducidad indicada. Una vez extraídos los portaobjetos de los envases de aluminio deben
utilizarse inmediatamente.
Insert Code: CIN284.E, Version: 1 April 2005, Page 1 of 2
9
9.1
RESULTADOS
Control de calidad
Una muestra de suero con autoanticuerpos al pénfigo debe mostrar una fluorescencia color
verde brillante en el epitelio estratificado del esófago (aspecto “enrejado de alambre”).
Una muestra de suero con autoanticuerpos al penfigoide debe mostrar una fluorescencia color
verde brillante en la membrana basal linear del esófago.
Una muestra de suero con autoanticuerpos endomisiales debe mostrar una fluorescencia
color verde brillante en la fibras con “aspecto de reticulina” alrededor de las fibras musculares
lisas del esófago de mono. El control positivo a la reticulina debe mostrar una fluorescencia de
las fibras reticulina alrededor de los túbulos y glomérulos del riñón (ref. 2 y 3).
El control negativo debe mostrar una coloración verde oscura en todos los tejidos, sin
fluorescencia visible.
Si los controles no resultan tal como se describe arriba, el ensayo debe considerarse no válido
y, por consiguiente, deberá repetirse.
9.2
Interpretación de los resultados
Véase las referencias 4 y 5 para ejemplos fotográficos en color de este patrón. Los resultados
se notifican como positivos o negativos.
Nota: Cada laboratorio debe establecer cuándo un resultado positivo se considera
clínicamente significativo.
10
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
10.1
La fuente luminosa, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia de
diferentes marcas influirán en la sensibilidad del kit. Las prestaciones del microscopio
dependen considerablemente de un mantenimiento correcto y, en particular, del
centrado y de la sustitución de la lámpara de vapores de mercurio tras el periodo de
tiempo aconsejado.
10.2
Puesto que ciertas células ováricas muestran antígenos de los grupos sanguíneos, los
sueros con anticuerpos anti-grupos sanguíneos A y B producen una cierta
fluorescencia (ref. 6). En ciertos pacientes, el patrón de coloración puede ser similar a
aquello producido por los anticuerpos dirigidos contra el pénfigo, aunque los
anticuerpos anti-grupos sanguíneos colorarán también los capilares de la musculatura
del esófago.
10.3
No se ha evaluado la idoneidad del uso con reactivos IFA de otros fabricantes; sin
embargo, no debe excluirse su empleo.
10.4
Este ensayo por sí solo no es válido para el diagnóstico. También deben tenerse en
cuenta los demás factores, incluidos la historia clínica de los pacientes y otros
resultados serológicos o biópsicos.
FDA (USA) Advertencia: ver la primera página de la metódica en inglés.
11
BIBLIOGRAFÍA
1.
Weller T H & Coons A H (1954). Fluorescent antibody studies with agent of Varicella
and Herpes Zoster propagated in vitro: Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794.
2.
Hallstro O. (1989). Comparison of IgA class reticulin and endomysium antibodies in
coeliac disease and dermatitis herpetiformis. Gut. 30, 1225-1232.
3.
Unsworth D J. (1996). Serological diagnosis of gluten sensitive enteropathy. J. Clin.
Path. 49, 704-711.
4.
Bradwell A R et al (1997). Atlas of autoantibody patterns on tissues. Publ. The Binding
Site Ltd., Birmingham UK.
5.
Bradwell A R et al (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Publ. The Binding
Site Ltd., Birmingham UK.
6
Szulman AE. (1962): The histological distribution of blood group substances A and B in
man. J. Exp. Med. 115 977
12
12.1
12.2
12.3
12.4
12.5
12.6
12.7
12.8
12.9
12.10
12.11
12.12
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO
Deje que la solución de montaje alcance la temperatura ambiente.
Diluya el PBS con agua destilada.
Diluya los sueros de los pacientes 1/10 con PBS.
Deje que los portaobjetos alcancen la temperatura ambiente (18-28ºC).
Dispense 50µl de los controles positivos y negativos y sueros de pacientes diluidos en
los respectivos pocillos.
Incube en una cámara húmeda durante 30 minutos.
Lave durante 5-10 minutos en PBS.
Seque el contorno de cada pocillo y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota
de conjugado.
Incube como en la fase 12.6.
Lave como en la fase 12.7.
Monte.
Examine el portaobjetos con el microscopio de fluorescencia.
Insert Code: CIN284.E, Version: 1 April 2005, Page 2 of 2