NOVA Lite™ Adrenal (Primate) IFA Slides

NOVA Lite™ Adrenal (Primate) IFA Slides
Per uso diagnostico In Vitro
Solo para exportación. No comercializable en Estados Unidos.
Codice Prodotto: 508370, 508375, 508375.10
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
Las secciones de glándula suprarrenal de mono se utilizan en ensayos de inmunofluorescencia indirecta (IFA), para el
cribado de anticuerpos circulantes séricos humanos dirigidos contra la corteza suprarrenal, a modo de ayuda en el
diagnóstico de la enfermedad de Addison.
Sumario y Explicación de la prueba
Los anticuerpos dirigidos contra las células esteroideas de la corteza suprarrenal se encuentran con frecuencia en el
suero de pacientes con la enfermedad de Addison. La técnica empleada para detectar estos anticuerpos
citoplasmáticos es la inmunofluorescencia en secciones de glándula suprarrenal de mono.
Un 60% de pacientes con enfermedad de Addison presentarán anticuerpos dirigidos contra la corteza suprarrenal en el
suero. Los pacientes con enfermedad de Addison también presentan con frecuencia otros trastornos autoinmunes,
como tirotoxicosis, tiroiditis de Hashimoto e insuficiencia ovárica. En caso de insuficiencia suprarrenal aislada, la
presencia de anticuerpos positivos disminuye aproximadamente a un 20%. Prácticamente nunca se detectan
anticuerpos antisuprarrenales en el suero de personas sanas1.
Procedimiento de trabajo
Estos portaobjetos se utilizan en una técnica de inmunofluorescencia indirecta, en la que las muestras de paciente y los
controles adecuados se incuban con las secciones. Los anticuerpos no reactivos se eliminan mediante lavado y, a
continuación, se aplica un conjugado adecuado marcado con fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediante
lavado, tal como se ha hecho anteriormente. Los portaobjetos se examinan en un microscopio de fluorescencia. Las
muestras positivas producen una fluorescencia de color verde brillante que corresponde a las áreas de la sección a las
que se ha unido el autoanticuerpo2.
Reactivos
Secciones suprarrenales de mono en portaobjetos de 5 pocillos, envueltas individualmente en una bolsa de aluminio
que contiene desecante.
Advertencias/Precauciones
Deben establecerse métodos de manipulación y eliminación adecuados para todas las muestras potencialmente
infecciosas analizadas con este producto. Sólo personal debidamente formado puede llevar a cabo estos
procedimientos.
Condiciones de almacenamiento
Los portaobjetos no abiertos deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8°C y pueden utilizarse hasta la fecha
de caducidad indicada. NO CONGELAR. Tras extraer los portaobjetos de la bolsa de aluminio, deben utilizarse
inmediatamente.
Recolección de Muestras
Las muestras de sangre deben obtenerse mediante venipunción, dejando que se coagulen de forma natural, y el suero
debe separarse lo antes posible para evitar hemólisis. El suero puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 7
días antes del ensayo4, o para periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura
inferior. NO congelar y descongelar el suero más de una vez. Evitar el uso de sueros lipémicos, hemolizados o
contaminados con microbios, puesto que puede dar lugar a títulos reducidos o patrones de tinción poco claros.
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Procedimiento
Materiales Suministrados
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508370 – Adrenal (Primate) – 1 x 8-well slide (Portaobjetos con glándula suprarrenal de mono – 8 pocillos o
bien glándula suprarrenal de mono
508375 – Adrenal (Primate) – 1 x 4-well slide (Portaobjetos con glándula suprarrenal de mono – 4 pocillos o
bien glándula suprarrenal de mono
508375.10 – Adrenal (Primate) – 10 x 4-well slide (Portaobjetos con glándula suprarrenal de mono – 10 x 4
pocillos o bien glándula suprarrenal de mono
1 x folleto de instrucciones
Material necesario no incluido
1.
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5.
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Agua destilada para diluir el PBS concentrado.
Contenedor para el tampón PBS.
Micropipetas y puntas desechables para aplicar las muestras.
Cámara húmeda para las incubaciones
Microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 495nm y filtro barrera de 515nm.
Botella lavadora para los lavados iniciales con PBS.
Los componentes adicionales pueden obtenerse de INOVA Diagnostics, Inc.: PBS (508002), control
negativo IFA Sistema (508186), conjugado (H&L) adsorbida para mono FITC (504011, 504071), azul de
Evans (504049) y medio de montaje PVA (504046, 504047).
Procedimiento del test
Control de calidad
Deben utilizarse controles positivos y negativos cada vez que se ensayen las muestras.
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10.
Medio de montaje: Retirar el medio de montaje del refrigerador para que alcance la temperatura ambiente (1828°C) antes de su uso.
Dilución de muestras de paciente
Cribado: Diluir las muestras de paciente 1/5 añadiendo 20μL de suero a 80μL de tampón PBS.
Titulación: Realizar diluciones seriadas de las muestras cribadas positivas con el tampón PBS (p.ej. 1/10,
1/20, 1/40 y 1/80, etc.). Por ejemplo: tomar 100μL de la dilución 1/5, mezclar con 100μL de PBS para obtener
una dilución 1/10. Repetir la operación para otras diluciones.
Portaobjetos de sustrato. Dejar que los portaobjetos de sustrato alcancen la temperatura ambiente (18-28°C)
antes de retirarlos de las bolsas.
Etiquetar los portaobjetos adecuadamente. Colocarlos en la cámara húmeda y añadir 50-100μL de los controles
positivos y negativos a los pocillos correspondientes. Añadir 50-100μL de muestras de paciente diluidas a los
pocillos restantes.
Incubación de portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda a temperatura
ambiente (18-28°C).
Lavado con PBS. Retirar los portaobjetos de la cámara húmeda y aclararlos brevemente con un frasco
comprimible de PBS. No dirigir directamente el chorro a los pocillos. Colocar los portaobjetos en una bandeja,
sumergirlos en PBS y agitar durante 5-10 minutos.
Adición de conjugado fluorescente. Eliminar el exceso de PBS y secar con material absorbente el contorno de
los pocillos. Volver a colocar los portaobjetos en la cámara húmeda y cubrir inmediatamente cada pocillo con
una gota de conjugado fluorescente adecuadamente diluido. NO DEJAR LOS POCILLOS DESCUBIERTOS
DURANTE MÁS DE 15 SEGUNDOS. El secado del sustrato afecta negativamente a los resultados. La
utilización de conjugado adsorbido de mono permitirá obtener mejores resultados (p.ej. 504011).
Incubación de portaobjetos. Incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una cámara húmeda y oscura a
temperatura ambiente (18-28°C).
Lavado con PBS. Volver a lavar, tal como se describe en el paso 5. CONTRATINCIÓN OPCIONAL: añadir 2-3
gotas de azul de Evans al 1% por cada 100mL de PBS antes de proceder a la inmersión de los portaobjetos.
Montaje con cubreobjetos. Retirar uno a uno los portaobjetos de la solución PBS de lavado. Secar rápidamente
el contorno de los pocillos y añadir una gota de medio de montaje a cada pocillo. Colocar con cuidado el
portaobjetos en el cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de aire. No intentar eliminar las burbujas que
se hayan podido formar. Eliminar el exceso de medio de montaje del borde del cubreobjetos.
Examen de portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Los portaobjetos pueden almacenarse un máximo
de 3 días a 2-8°C, en un lugar oscuro, sin que se produzca una pérdida de fluorescencia significativa.
2
Resultados
Control de calidad
Una muestra de suero que contenga autoanticuerpos de células esteroideas debe mostrar una tinción de color verde
brillante fluorescente del citoplasma de los portaobjetos de corteza suprarrenal.
Un control negativo debe mostrar una tinción de color verde pálido en todos los tejidos, pero sin fluorescencia
perceptible.
Si el aspecto de los controles no es el que se describe, el ensayo debe considerarse inválido y, por consiguiente,
deberá repetirse.
Interpretación de los resultados
Consultar las referencias 3 para ver ejemplos de imágenes en color de este patrón. Los resultados se notifican como
positivos o negativos.
N.B.: cada laboratorio debe establecer el valor límite en el que se considera que un resultado positivo es clínicamente
significativo.
Limitaciones del Procedimiento
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4.
La calidad de la fuente de luz, los filtros y la óptica de los microscopios de fluorescencia influirá en la
sensibilidad del kit. El funcionamiento del microscopio depende de un correcto mantenimiento, especialmente
del enfoque de la lámpara de vapor de mercurio y el reemplazo de la misma una vez transcurrido el período de
tiempo recomendado.
Otros autoanticuerpos, especialmente los antimitocondriales, pueden estar ocultos o confundirse con
anticuerpos antisuprarrenales. Por este motivo, el suero que produzca tinción de las secciones suprarrenales
también debe analizarse en secciones de hígado, riñón y estómago.
No se ha evaluado la idoneidad del uso con reactivos IFA de otros fabricantes, sin embargo, no debe excluirse
su empleo.
Este ensayo por sí solo no es válido para el diagnóstico. También deben tenerse en cuenta los demás factores,
incluidos la historia clínica de los pacientes y otros resultados serológicos o biópsicos.
Resumen del procedimiento
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Dejar que el medio de montaje alcance la temperatura ambiente.
Diluir PBS con agua destilada.
Diluir el suero de paciente 1/5 con PBS.
Dejar que los portaobjetos de sustrato alcancen la temperatura ambiente (18-28°C).
Aplicar 50-100μL de controles positivos y negativos y suero de paciente diluido a los pocillos correspondientes.
Incubar en una cámara húmeda durante 30 minutos.
Lavar durante 5-10 minutos en PBS.
Secar con material absorbente el contorno de los pocillos y cubrirlos inmediatamente con una gota de
conjugado.
Incubar tal como se describe en el paso 6.
Lavar tal como se describe en el paso 7.
Montar.
Examinar el portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.
Referencias
1.
2.
3.
4.
Irvine W.J. Adrenalitis, hypoparathyroidism and associated diseases, in Samter M. (ed) Immunological
Diseases, ed 2. Boston, Little, Brown & Co. pp. 1278-1295, 1978.
Weller T.H. Coons A.H. (1954). Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster
propagated in vitro. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86, 789-794.
Bradwell A.R. et al (2008). Atlas of Tissue Autoantibodies (Third Edition). Publ. The Binding Site Ltd.,
Birmingham, UK
Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A. Milford Ward, G.D. Wild. Publ. PRU
Publications, Sheffield. 14.
NOVA Lite es una marca de
INOVA Diagnostics, Inc.
3
Fabricante:
INOVA Diagnostics, Inc.
9900 Old Grove Road
San Diego, CA 92131
United States of America
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628375ESP
October 2010
Revision 0
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