Influencia del tipo de explanto para la inducción in vitro de callo de

Influencia del tipo de explanto para la inducción in vitro de callo de
melocotón (Prunus persica L.).
M. Pérez Jiménez, A. Carrillo Navarro y J. Cos Terrer.
Hortofruticultura - IMIDA, 30150-La Alberca, Murcia.
E-mail: [email protected]
Palabras clave: melocotón, callo, inducción, 2,4D, kinetina.
Resumen
El trabajo compara la influencia que tiene el tipo de explanto y las
condiciones de iluminación en la inducción de callo de melocotón. Los explantos
usados fueron hojas adultas en posición adaxial y abaxial, secciones de hojas adultas
a las que se le habían eliminando las nervaduras principales en posición adaxial y
abaxial, hojas jóvenes recién brotadas en posición adaxial, yemas axilares y yemas
apicales aisladas, secciones de 0.4 cm de tallos herbáceos en posición polar y apolar.
El medio de cultivo usado fue el WPM con 1.2 mg·l-1 de 2,4-D y 1 mg·l-1 de Kinetina,
manteniendo los cultivos a 25ºC en condiciones de oscuridad y en presencia de luz
con un fotoperiodo 16:8. Los resultados obtenidos indican que en todos los explantos
apareció callo, siendo de tipología friable y color blanco en condiciones de oscuridad,
y compactos y amarillo-verdosos en condiciones de luz.
INTRODUCCIÓN
El melocotón (Prunus persica L. Batsch) es una de las frutas más importantes,
siendo España la cuarta productora mundial. La importancia de los programas de mejora
genética radica en la obtención de variedades con las que se pueda competir en el
mercado. El cultivo in vitro es un excelente complemento de la mejora clásica, ya que la
introducción de un determinado carácter puede ser en determinadas ocasiones inviable,
además de un proceso de larga duración. La utilización de las técnicas de transformación
genética puede permitir acortar el periodo de obtención de una nueva variedad. El género
Prunus está considerado como uno de los más recalcitrantes respecto a su
comportamiento in vitro, y para su aplicación en programas de mejora genética, es
fundamental disponer de un protocolo eficiente en cada una de las fases de organogénesis
y embriogénesis somática, de forma que nos permita obtener callos con una capacidad
organogénica y embriogénica estable.
La inducción in vitro de callo a partir de un explanto inicial es una de las fases
determinantes, ya que se ve afectada por muchos factores como el genotipo, la
composición salina del medio de cultivo, los reguladores del crecimiento, las condiciones
de cultivo, agar y el tipo y edad del explanto de partida. En esta fase las auxinas cumplen
un papel primordial induciendo la proliferación y aparición de callo (Paris et al., 2003)
que, junto a otros reguladores del crecimiento pueden ayudar a la cantidad y calidad del
callo. Al igual, los factores físicos como la ausencia o presencia de luz, pueden darnos
características diferenciales en la masa celular resultante.
Los explantos utilizados para la inducción de callo son principalmente cotiledones
maduros e inmaduros, raíces y hojas, tanto de plantas multiplicadas in vitro como de
plantas (Fillati et al., 1987; Hammerschlag et al. 1985; Bhansali et al. 1990; Scorza et al.
1990), siendo la mayor dificultad obtener buenos resultados con material adulto ex vitro
103
(Gentile et al. 2002). El trabajo compara la inducción de callo en nueve tipos de
explantos, y el efecto de la ausencia o presencia de luz.
MATERIAL Y MÉTODOS
Tipos de explantos
Se utilizaron nueve tipos de explantos: secciones de hojas adultas en posición
adaxial (1) y abaxial (2), secciones de hojas adultas a las que se le habían eliminando las
nervaduras principales en posición adaxial (3) y abaxial (4), hojas jóvenes recién brotadas
en posición adaxial (5), yemas axilares (6) y yemas apicales (7) aisladas, secciones de 0.4
cm de tallos herbáceos en posición polar (8) y apolar (9). Todos los explantos se
desinfectaron con una solución diluida de hipoclorito sódico al 2%.
El material vegetal estudiado son híbridos del programa de mejora genética que se
está realizando en el IMIDA. Estas plantas tenían una edad de 4 meses, con un porte
medio de 90 cm y se encontraban en invernadero en condiciones de cultivo controladas.
Luz/oscuridad
Se estudiaron dos tratamientos: a) oscuridad y b) iluminación bajo unas
condiciones de 45 μ mol.m-2.s-1 (Philips TLD 58W/54) y un fotoperiodo de 16 horas luz:8
horas de oscuridad. Todos los explantos se colocaron en la cámara de cultivo a 25ºC.
Medio de cultivo, y Condiciones de cultivo
El medio de cultivo utilizado fue el WPM (Woody Plant Medium) con vitaminas,
1.2 mg.l-1 de 2,4-D y 1 mg.l-1 de Kinetina. La concentración de sacarosa del medio fue de
30 g.l-1 y 7 g.l-1 de agar de ‘Propagación’ (Pronadisa).
Parámetros estudiados
Los controles realizados para cuantificar el estudio fueron: el porcentaje de
explantos que desarrollaron callo, el número de días a los que aparece, color y tipo del
callo y el tamaño relativo del callo respecto al explanto inicial al final del cultivo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos muestran la buena respuesta de todos los tipos de
explantos estudiados. El porcentaje de explantos que indujeron callo fue del 100% en
todos los materiales estudiados, en la Figura 1 podemos ver como el crecimiento relativo
del callo respecto al explanto inicial fue mayor en condiciones de oscuridad. En todos los
casos la coloración de los callos obtenidos en condiciones de oscuridad fue amarilla clara
con una tipología friable, mientras que la obtenida en condiciones de luz fue verdosa y
una textura más compacta (Figura 3). La velocidad de aparición de callo fue mayor en
condiciones de luz que en oscuridad, independientemente del tipo de explanto utilizado
como se puede observar en la Figura 2. Los resultados obtenidos nos permiten iniciar los
estudios de organogénesis y embriogénesis para disponer de un protocolo de regeneración
eficiente para esta especie.
Referencias
Bhansali R.R., Driver .JA. and Durzan D.J. 1990. Rapid multiplication of adventitious
somatic embryos in peach and nectarine by secondary embryogenesis. Plant Cell Rep.
9: 280–284.
104
Fillati, J.J., Sellmer, J., McCown, G., Haissig, B., and Comai, L. 1987. Agrobacterium
mediated transformation and regeneration of Populus. Molecular and General
Genetics. 206:192-199.
Gentile, A., Monticelli, S., Damiano, C. 2002. Adventitious shoot regeneration in peach
(Prunus persica (l.) Batsch). Cell Biology and Morphogenesis. 20:1011-1016.
Hammerschlag, F.A., Bauchan, G. and Scorza, R. 1985. Regeneration of peach plants
from callus derived from immature embryos. Theor. Appl. Genet. 70: 248–251.
Paris, R., Patresi, D., Negri, P. 2004. In vitro morphogenic ability of mature or embryonic
apricot tissues. Proceedings of the XIth Eucarpia Symposium on Fruit Breeding and
Genetics, Vols 1 and 2. Acta hortoticulturae. 663: 487-490. Part 1-2.
Scorza, R., Morgens, P.H., Cordts, J.M., Mantem, S. and Callahan, A.M. 1990.
Agrobacterium-mediated transformation of peach _Prunus persica L. Batch_ leaf
segments, immature embryos and longterm embryogenic callus. In Vitro Cell Dev.
Biol. 26: 829–834.
Crecimiento relativo de callo (%)
100
LUZ
OSC
80
60
40
20
Yema axilares
Yemas apicales
Secciones de tallo
posición polar
Secciones de tallo
posición apolar
Hojas adultas sin
nervaduras principales
abaxial
Hojas adultas sin
nervaduras principales
adaxial
Hojas jóvenes
Hoja adulta abaxial
Hoja adulta adaxial
0
Figura 1. Crecimiento relativo de callo (%) respecto al explanto inicial, en los 9 tipos de
explantos utilizados, en condiciones de luz y oscuridad.
105
100
Luz
80
%
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
15
20
25
30
Días
100
Oscuridad
80
%
60
40
20
0
0
5
10
Días
Hoja adulta adaxial
Hoja adulta abaxial
Hojas jóvenes
Hojas adultas sin nervaduras principales adaxial
Hojas adultas sin nervaduras principales abaxial
Secciones de tallo posición apolar
Secciones de tallo posición polar
Yemas apicales
Yemas axilares
Figura 2. Evolución del porcentaje de explantos que desarrollaron callo a partir de los
distintos tipos de explantos y en las dos condiciones de iluminación.
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Explantos iniciales
Oscuridad
Luz
Figura 3. Situación inicial y final de los explantos.
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