CH50 Eq Enzyme Immunoassay Kit For in

CH50 Eq
Enzyme Immunoassay Kit
For in-vitro diagnostic use only
Product code: MK095
The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK
www.bindingsite.co.uk
Telephone: +44 (0) 121 436 1000
Fax: +44 (0) 121 430 7061
e-mail: [email protected]
FDA (USA) Information
Analyte Name
Complement components immunological test system
Complexity Cat.
High
(goat) antibodies to TCC.
CH50 Eq Activator 10mL, contains human gammaglobulins and murine
monoclonal antibodies in phosphate buffered saline (PBS) with 0.035%
ProClin 300.
Tween-20® is a registered trademark of ICI Americas Inc.
ProClin® is a registered trademark of Rohm and Haas Company.
4.1.10
4.2
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
5
5.1
5.2
1
INTENDED USE
5.3
The CH50 Eq EIA measures the total classical complement pathway activity in
human serum and allows detection of a deficiency of one or more of the
complement components C1 through C9.
2
SUMMARY AND EXPLANATION
The binding of C1q component of C1 to immune complexes triggers the classical
complement pathway. This activation results in a cascade of enzymatic and nonenzymatic reactions, culminating in the formation of terminal complement complexes
(TCC). Under standard conditions the level of TCC that can be generated in a serum
is a quantitative expression of the serum’s total classical complement activity.
The traditional method for measuring the total classical complement activity in
serum is the CH50 test1. This test is a lytic assay, which uses antibody-sensitized
sheep erythrocytes (EA) as the activator of the classical complement pathway and
various dilutions of the test serum to determine the amount required to give 50%
lysis. The percent haemolysis is determined spectrophotometrically. The CH50 test
is an indirect measure of TCC, since the TCC themselves are directly responsible
for the haemolysis that is measured.
The CH50 Eq EIA provides a direct measure of the total classical complement
activity in serum by quantifying the amount of TCC generated under standard
conditions. The CH50 Eq EIA uses a monoclonal antibody to a unique neoantigen to
capture the TCC analyte. Since both the CH50 Eq EIA and the CH50 test rely on the
generation of TCC and correlate, the CH50 Eq EIA’s results are expressed in CH50
unit equivalents per millilitre.
3
5.4.
5.5.
5.6.
5.7.
5.8.
5.9.
5.10.
5.11.
5.12.
PRINCIPLE
5.13.
The CH50 Eq EIA for quantifying the total classical complement activity in human
serum involves three basic procedures: (1) complement activation; (2) sample
dilution; and (3) assay for terminal complement complexes (TCC).
To activate the classical complement pathway, undiluted human serum samples and
the controls are added to test tubes (or uncoated microassay wells) containing the
activator. During incubation the classical pathway of complement is triggered and
TCC are generated.
In the second step, the activated sera are diluted in uncoated microassay wells or
test tubes and dispensed, together with kit standards, directly into a microassay
plate. The TCC present in the activated samples bind to the monoclonal antibodies
coating the surface of the microassay wells.
In the third step, the TCC microassay plate is washed and loaded with an HRPconjugate, which will bind to the bound TCC. After washing, the TCC microplate is
loaded with a chromogenic enzyme substrate. After incubation a reagent is added to
stop colour development. The absorbencies (A450 values) generated with the
controls, kit standards, and test specimens are measured spectrophotometrically.
The colour intensity of the reaction mixture is proportional to the concentration of
TCC present and to CH50 units. Using the kit standard curve, assay results are
expressed in CH50 unit equivalents per millilitre (CH50 U Eq/mL).
4
REAGENTS
Materials provided
4.1.1
CH50 Eq Standard A, B, C, D, E 1 x 1.5mL of each standard (A-E) Each
contains human serum with assigned CH50 unit equivalents per mL, (U
Eq/mL), protein stabilizers.
CH50 Eq Normal Control 3 x 100µL, lyophilized. When reconstituted, each
contains human serum.
CH50 Eq Low Control 3 x 100µL, lyophilized. When reconstituted, each
contains human serum.
Anti-TCC Coated Wells 96-well microassay plate with retainer and holder
consisting of 12 eight-well strips coated with a mouse monoclonal antibody
in a resealable foil pouch.
CH50 Eq Stop Solution 12mL, contains 1N (4%) hydrochloric acid.
CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, 2 x 50mL, contains phosphate
buffered saline (PBS), 1.0% Tween-20®, and 0.035% ProClin® 300
CH50 Eq Sample Diluent 50mL, Contains phosphate buffered saline
(PBS), 0.05% Tween-20, 2.5% protein stabilizers, 0.035% ProClin 300
CH50 Eq TMB Substrate, 12mL, contains 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine
(TMB) and Hydrogen Peroxide (H2O2).
CH50 Eq Conjugate 7mL, Contains horseradish peroxidase-conjugated
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
4.1.6
4.1.7
4.1.8
4.1.9
5.14.
5.15.
5.16.
5.17.
5.18.
5.19.
5.20.
5.21.
5.22.
5.23.
6
4.1
Materials required but not provided
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
Timer (60 minute range)
Calculator or other computational method to validate the assay
Clean, unused microassay plates and/or test tubes and racks
Container for wash buffer dilution
Wash bottle or other immunoassay washing system
Adjustable multichannel pipette (8 or 12 channels) or repeating
micropipettes (optional)
Clean pipettes, 1 mL, 5 mL, and 10 mL
Micropipettes and pipette tips
Plate reader capable of optical density A450 readings between 0.0 and 3.0
Deionized or distilled water
Incubator or microassay plate heater (37°C)
Water bath (37°C)
WARNINGS AND PRECAUTIONS
For in-vitro diagnostic use.
Treat specimen samples as potentially biohazardous material. Follow
Universal Precautions when handling contents of this kit and any patient
samples.4
Wear suitable protective clothing, gloves, and eye/face protection when
handling contents of this kit.
Use the supplied reagents as an integral unit prior to the expiration date
indicated on the package label.
Store assay reagents as indicated.
Do not use coated strips if pouch is punctured.
ProClin® 300 is used as a preservative. Incidental contact with or ingestion of
buffers or reagents containing ProClin can cause irritation to the skin, eyes or
mouth. Use good laboratory practices to reduce exposure. Seek medical
attention if symptoms are experienced.
The stop solution is considered corrosive and can cause irritation. Do not
ingest. Avoid contact with eyes, skin, and clothing. If contact is made,
immediately rinse affected area with water. If ingested, call a physician.
Each donor unit used in the preparation of the standards and control sera of
this product was tested by an FDA-approved method for the presence of
antibody to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and to hepatitis C
virus, as well as for hepatitis B surface antigen. Since no test method can
offer complete assurance that infectious agents are absent, these reagents
should be handled at Biosafety Level 2 as recommended for any potentially
infectious human serum or blood specimen in the Centers for Disease
Control/National Institutes of Health manual “Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories,” 2007.
Use of multichannel pipettes or repeat pipettors is recommended to ensure
timely delivery of reagents.
For accurate measurement of samples, add samples and standards precisely.
Pipette carefully using only calibrated equipment.
Proper collection and storage of test specimens are essential for accurate
results (see SPECIMEN COLLECTION and STORAGE).
Avoid microbial or cross-contamination of specimens, reagents, or materials.
Incorrect results may be obtained if contaminated.
Test each sample in duplicate.
Do not use a microassay well for more than one test.
Using incubation times and temperatures other than those indicated in the
ASSAY PROCEDURE section may give erroneous results.
The TMB substrate must be protected from light during storage and
incubation. Avoid contact with eyes, skin, and clothing. If contact is made,
immediately rinse affected area with water.
Do not allow microassay wells to dry once the assay has begun.
When adding or aspirating liquids from the microassay wells, do not scrape or
touch the bottom of the wells.
Heat-inactivated, hyperlipaemic or contaminated specimens may give
erroneous results.
To avoid aerosol formation during washing, use an apparatus to aspirate the
wash fluid into a bottle containing household bleach.
A wash bottle or automated filling device should be used to wash the plate
(ASSAY PROCEDURE, Step 9). For best results, do not use a multichannel
pipette to wash the microassay plate.
Dispose of containers and unused contents in accordance with Federal, State
and local regulations.
STORAGE
Store unopened kit at 2–8°C. After the kit is opened, the 20X wash solution
concentrate may be stored at 2–30°C.
After selecting the reagents or materials to be used in the assay, return the unused
reagents immediately to their appropriate storage temperatures. Bring reagents and
materials to room temperature (15–30°C) before use.
INDICATIONS OF INSTABILITY OR DETERIORATION OF REAGENTS:
Cloudiness or discoloration of the diluted wash solution indicates a deterioration of
this reagent. If this occurs, the solution should be discarded.
The activator may contain particles. This is normal and does not affect performance
of the assay.
7
SPECIMEN COLLECTION
Use serum as the specimen in this assay. Plasma is not acceptable.
Handle and dispose of all specimens using Universal Precautions.
The proper collection, processing, storage, and shipment of specimens is essential,
since complement may be activated in improperly handled specimens. This could
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 1 of 14
lead to erroneous results.
Serum specimens should be collected aseptically and prepared using standard
techniques for clinical laboratory testing. Samples can be stored up to 2 hours at
room temperature, up to 4 hours on ice, up to 3 days at 4°C, and at -70°C or below
for long-term storage. Do not subject samples to more than 6 freeze/thaw cycles.
Frozen specimens should be tested as soon as possible after thawing or stored on
ice (for no longer than four hours) until assayed.
Specimens should be packed in excess dry ice for shipping. Specimens that arrive
thawed at the testing facility may be compromised. After receiving a shipment,
samples can be stored at -70°C or below.
8
9.10
9.11
9.12
9.13
9.14
9.15
REAGENT PREPARATION
After removing the needed reagents and materials, return the unused items to their
appropriate storage temperatures (see STORAGE). Bring all reagents and materials
for the assay to room temperature (15–30°C) before use.
9.16
8.1.
Wash solution
Mix the 20X wash solution concentrate by inverting the bottle several times. If the
20X wash solution concentrate has been stored at 2–8°C, crystals may have
formed. To dissolve the crystals, warm the bottle in a 37-50°C water bath until all
crystals have dissolved and follow by mixing thoroughly. Prepare the wash solution
by diluting the entire contents of one of the bottles of 20X wash solution concentrate
up to one litre with distilled or deionized water. Mix thoroughly. The wash solution is
stable for 30 days when stored in a clean container at 2–8°C. If discoloration or
cloudiness occurs, discard the reagent.
9.17
10
8.3.
Specimen dilution
Caution: Treat all specimens as if potentially infectious. Do not use heatinactivated, contaminated specimens, or improperly stored specimens. Serum
specimens are required for this assay.
Serum samples should be thawed quickly by placing them briefly in a 37°C water
bath. Immediately upon thawing, place the samples on ice until the activation step
(see ASSAY PROCEDURE). Do not dilute the test samples prior to activation.
10.2
Interpretation of results
Use of the Standard Curve: The standard curve for the CH50 Eq EIA is generated
using the blank-subtracted A450 values for each standard (on the y axis) and the
assigned concentration for each standard (along the x axis). The standard curve
must meet the validation requirements. Most computers and calculators are capable
of performing this calculation. An example of a typical standard curve is shown in
Figure 1.
Calculation of Actual CH50 U Eq Level in Patient Specimens: Sample values
are calculated from the standard curve using linear regression analysis. For test
samples that were activated and diluted 1:200 prior to testing, the CH50 U Eq/mL
can be read directly from the standard curve. The values (U Eq/mL) for the normal
and low controls can also be read directly from the standard curve, since you have
also diluted them 1:200.
In order to obtain accurate CH50 determinations for test specimens that yield A450
values greater than that of the CH50 Eq EIA Standard E (or that yield A450 values
less than that obtained with Standard A), the test specimens may be re-assayed at a
different dilution so that their new A450 values will be within these limits. In all repeat
assays the standards and controls must also be tested.
If a sample is run in the assay at a dilution other than 200-fold, the CH50 level of the
sample is determined by correcting for the difference between the dilution examined
and the usual 200-fold dilution. For example, if a sample is diluted 100-fold rather
than the usual 200-fold, and the linear regression curve yields a concentration of
100 CH50 U Eq/mL, then the actual CH50 U Eq/mL in the sample is 50 (i.e., 100
CH50 U Eq/mL divided by 2).
Example of standard curve
Figure 1
8.4.
Preparation of normal and low controls
To one vial each of the lyophilized normal and low control add 100µL of deionized or
distilled water. Mix briefly to ensure reconstitution and let sit for fifteen (15) minutes
at room temperature. Vortex again and place on ice until ready for the activation
step.
ASSAY PROCEDURE
Read entire product insert before beginning the assay.
See REAGENT PREPARATION and WARNINGS AND PRECAUTIONS before
proceeding.
9.1.
9.2.
9.3
a.
b.
c.
d.
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
RESULTS AND QUALITY CONTROL
10.1
Quality control
Good laboratory practice recommends the use of controls to ensure that the assay
is performing properly. Each CH50 Eq EIA kit contains normal and low controls that
can be used for this purpose. These controls should be tested at least once for each
batch of specimens, i.e., for each separate activation run. The controls, when used
as instructed, should give CH50 unit equivalent values within the ranges specified
on their vial labels. Since these controls are to be activated, diluted, and tested
exactly like a typical specimen, they serve as both controls and reference standards
for each activation and CH50 Eq EIA run. External controls, prepared by your
laboratory, may also be used to help ensure that the assay is performing properly.
In addition, the product insert requires that the standard curve generated with the kit
A-E standards meet stringent validation requirements (see INTERPRETATION OF
RESULTS). Standards should be tested in duplicate for each assay run. If the assay
does not meet these requirements, repeat the assay or contact your local Binding
Site representative for technical assistance.
8.2.
Selecting the microassay strips
Determine the number of wells required for the assay. It is recommended that the
blank wells, controls, and standards be tested in duplicate. Remove the strip retainer
from the assembled plate. Remove the unneeded strips and place them in the
storage bag, reseal the bag and return it to storage at 2-8°C. Secure the strips to be
used in the assay.
9
absorbent paper repeatedly to remove any remaining fluid.
Using a multichannel or repeating pipette, dispense 50µL of conjugate
into each washed test well, including the blank well(s).
Incubate the microassay strips at room temperature (15–30°C) for 60
±1 minutes.
Wash the microassay wells after the 60-minute incubation, as described
in step 9.9.
Immediately following the wash procedure, dispense 100µL of the TMB
substrate solution into each well, including the blank(s).
Incubate the microassay strips at room temperature (15–30°C) for 15±1
minutes.
Add 100µL of stop solution to each well to stop the enzymatic reaction.
The stop solution should be added to the wells in the same order and at
the same rate as was the substrate solution. Gently tap the plate to
disperse the colour development evenly.
Determine the absorbance reading at 450nm (A450 value) for each test
well within one hour after the addition of the stop solution, making the
necessary blank correction. No reference filter is required.
Dispose of the remaining diluted specimens, activator, controls, and the
used microassay strips (see WARNINGS AND PRECAUTIONS, step
23) Keep the strip holder and strip retainer for future use.
Activation of samples and controls
Mix the activator, which contains readily suspendable particles, by
swirling the bottle before use. Swirl frequently during this step to ensure
suspension of the particles. Add 86µL of activator to the appropriate
number of test tubes or microassay wells.* Next add 14µL of undiluted
serum specimen, normal control, or low control to individual test tubes
or microassay wells containing the activator. Mix carefully. Cover to
minimize evaporation. Incubate at 37°C for sixty (60) minutes. (FOR
YOUR CONVENIENCE: If you wish to batch samples, after activation
you may store the undiluted, activated samples at -20°C or colder for up
to 14 days before proceeding to the next steps.)
* The number of test tubes or microassay wells required for activation
equals the number of test samples plus two (2) additional ones for
activation of the two controls.
Dilution of activated samples and controls
After activation, dilute the activated samples and activated controls
1:200 in specimen diluent in clean, unused microassay wells or in test
tubes.
Prepare the microassay strips as follows:
Rehydrate microassay wells by filling each with wash solution (250300µL/well) to each well using a wash bottle or an automated device.
Incubate at room temperature (15–30°C) for two minutes.
Remove the liquid from each well.
Invert the plate and tap firmly on absorbent paper repeatedly to remove
any remaining liquid.
Add 100µL of specimen diluent to the duplicate wells that will be used
to blank the plate reader.
Add 100µL of each ready-to-use standard (A-E) to duplicate wells. Note
that the standards have already been diluted and are ready to use.
Add 100µL of the diluted, activated normal and low controls to duplicate
wells.
Add 100µL of each diluted specimen in duplicate to its assigned
microassay wells.
Incubate at room temperature (15–30°C) for 60 ±1 minutes.
Wash the microassay wells as follows: Note: A multi-channel pipette
is not recommended for this step.
After the incubation in step 8 (or in step 12 below) remove the liquid
from each well.
Using a wash bottle, automated plate washer, or other washing device,
fill each well with the wash solution (250-300µL/well).
Incubate the wells for 1 minute at room temperature (15-30°C).
Remove the liquid from each well.
Fill each well with wash solution (250–300µL/well).
Remove the liquid from each well.
Repeat steps e-f five additional times.
After the seventh wash cycle, invert the plate and tap firmly on
10.3
Validation
Calculate the CH50 U Eq/mL for the normal and low controls. Also determine the
correlation coefficient (r) and the y-intercept (b) of the derived best fit Iinear curve for
the values obtained with the A-E Standards. To validate the assay, the r, b, and
control values must be within the ranges shown below:
Correlation coefficient (r):
> 0.96
y-intercept (b):
(–) 0.090 to (+) 0.068
Slope (m)
0.0033 – 0.0089
Normal & low control values:
Within ranges indicated on their
respective vial labels.
10.4
Limitations of the procedure
The CH50 Eq EIA has been used to test specimens collected as serum. The clinical
st
Insert Code: E095, Version: 21 September 2009, Page 2 of 14
CH50 Eq Enzyme Immunoassay Summary
Reagents, Standards, Controls and sample preparation
performance of plasma samples prepared with different anticoagulants has not been
determined.
11
EXPECTED VALUES
12.1
Precision:
Within-run and between-run precision was determined by assaying 16 replicates of
4 serum samples in 10 different runs.
Serum
1
13
1.
2.
3.
4.
CH50 U Eq/mL
Within-run1 C.V.
(%)
Between-run2
C.V. (%)
150.4
3.2
6.0
59.96
4.5
5.4
98.84
3.6
8.7
48.86
3.9
6.2
n = 16 replicates
2
Continuously mix activator by swirling during use
Pipette 86µL of activator to dilution tubes or dilution wells
Pipette 14µL of controls and specimen into dilution tubes
or dilution wells and mix carefully
Cover dilution tubes or dilution wells and incubate 60 ± 1 min at 37°C
(store up to 14 days at -20°C)
‰
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Sample
(let sit for 15 minutes at room temperature. Vortex, then place on ice)
Assay Procedure
Two hundred thirty-four (234) normal and abnormal serum samples were tested
using the CH50 Eq EIA. The average value obtained with the normal sample
population was 133 ± 54 CH50 U Eq/mL. As a guideline, the cutoff obtained using
Receiver Operator Characteristics (ROC) analysis2 with these normal and abnormal
serum specimens was 70 CH50 U Eq/mL. Each laboratory should define its own
normal ranges.
Using the CH50 Eq EIA, two hundred twenty-one (221) patient samples were tested
at a major clinical reference laboratory in the United States. Employing the cutoff of
70 CH50 Eq U/mL and ROC analysis, the overall accuracy of the CH50 Eq ElA,
when compared to the combined results from three haemolytic and one EIA-based
assay, was greater than 97%.
Using traditional measurements of clinical performance, the CH50 Eq EIA also
gave a clinical accuracy of greater than 97% with a sensitivity of 93.2% and a
specificity of 99.4%. Using the Passing Bablok Algorithm method3, the CH50 U Eq
values obtained with the CH50 Eq EIA correlated closely with the CH50 values
obtained by the traditional haemolytic assay reported by the clinic laboratory, giving
a level of significance of p < 0.001.
12
‰ Dilute wash solution concentrate 1:20 with deionized water
‰ Reconstitute each control with 100µL deionized or distilled water
n = 10 runs
Dilute activated controls and specimen 1:200 with complement specimen diluent
into new tubes or dilution wells
Add ~ 300 µL of wash solution into assay wells
Incubate 2 min at 15 – 30°C
Remove liquid from each well (Blot dry)
REFERENCES
Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer,
M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C
Thomas, 1961:133-71.
“Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver
Operating Characteristic (ROC) Plots.” Tentative Guideline, Dec. 1993. NCCLS
Document GP109-T, Vol. 13, No 28.
Passing, H. And W. Bablok. “A new biometrical procedure for testing the
equality of measurements from two different analytical methods. Application of
linear regression procedures for method comparison studies in clinical
chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): 709-720 (1983).
Centers for Disease Control.
Recommendations for prevention of HIV
transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001.
Pipette 100 µL of specimen diluent (blank), standards,
activated controls, and activated specimens into assay wells
Incubate 60 ± 1 min at 15 – 30°C
Wash 7 times with wash buffer
(Incubate first wash 1 minute)
Pipette 50µL conjugate
Manufactured for The Binding Site Group Ltd. by Quidel® Corp. San Diego, USA.
Incubate 60 ± 1 min at 15 – 30°C
Wash 7 times with wash buffer
(Incubate first wash 1 minute)
Pipette 100µL substrate solution
Incubate 15 ± 1 min at 15 – 30°C
Pipette 100µL stop solution
Read the optical density at 450 nm
Analyse the assay results using a linear curve fit
(y = mx +b)
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 3 of 14
Enthalten nach Wiederherstellung Humanserum.
Anti-TCC Coated Wells (Mikroassay-Platte) Platte mit 96 Vertiefungen,
einschließlich Feststelleinrichtung und Halterung. Setzt sich aus 12
Teststreifen mit jeweils 8 Vertiefungen zusammen, die mit einem
monoklonalen Antikörper von Mäusen beschichtet sind und sich in
einem wiederverschließbaren Kunststoffbeutel befinden.
CH50 Eq Stop Solution (Stopplösung) 12mL, Enthält 1N (4%) Salzsäure
4.1.5
contains 1N (4%) Hydrochloric acid.
CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, (20-fach konzentrierte
4.1.6
Waschlösung) 2 x 50mL, Enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung,
1,0% Tween-20® und 0,035% ProClin® 300
CH50 Eq Sample Diluent (Probenverdünnungsmittel) 50mL, Enthält
4.1.7
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05% Tween-20, 2,5%
Proteinstabilisatoren und 0,035% ProClin 300
CH50 Eq TMB Substrate, (TMB Substrat) 12mL, Enthält 3,3’, 5,5’
4.1.8
tetramethylbenzidine (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2).
4.1.9
CH50 Eq Conjugate (Konjugat) 7mL, Enthält an Meerrettichperoxidase
(HRP) konjugierte Antikörper (Ziege) gegen TCC
CH50 Eq Activator (Aktivator) 10mL, Enthält humanes Gammaglobulin
4.1.10
und monoklonale Antikörper von Mäusen in phosphatgepufferter
Kochsalz-lösung mit 0,035% ProClin 300
Tween-20® ist ein Warenzeichen von ICI Americas Inc.
ProClin® ist ein eingetragenes Warenzeichen von Rohm and Haas Company.
4.1.4
CH50 Eq
Enzym Immunassay Kit
Nur zur in-vitro Diagnostik
Bestell-Nr.:MK095
The Binding Site Group Ltd., P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
www.bindingsite.co.uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A,
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
e-mail: [email protected]
1
VORGESEHENER VERWENDUNGSZWECK
ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNGEN
Der klassische Komplementweg wird durch die Bindung der Untereinheit C1q des
C1-Faktors an Immunkomplexe ausgelöst. Durch diese Aktivierung wird eine Vielfalt
enzymatischer und nicht enzymatischer Reaktionen gestartet, die schließlich in die
Bildung terminaler Komplementkomplexe (TCC) mündet. Die Menge an TCC, die
unter Standardbedingungen in einem Serum gebildet werden kann, ist eine
quantitative Funktion der hämolytischen Gesamtaktivität des klassischen
Komplementwegs im Serum. Traditionell wird die hämolytische Gesamtaktivität des
klassischen Komplementwegs mit dem CH50-Test bestimmt1. Bei dieser Methode
handelt es sich um ein lytisches Verfahren, bei dem der klassische Komplementweg
durch Antikörper-sensitivierte Erythrozyten (EA) von Schafen aktiviert wird. Die
Menge, die für eine Lyse von 50 % erforderlich ist, wird mittels verschiedener
Verdünnungen des Testserums bestimmt. Die prozentuale Hämolyseaktivität wird
spektrophotometrisch bestimmt. Das Ergebnis des CH50-Tests dient als ein direktes
Maß für TCC, sind die terminalen Komplementkomplexe doch selbst direkt
verantwortlich für die gemessene Hämolyseaktivität. Der CH50 Eq EIA ermöglicht
durch die quantitative Bestimmung von TCC, das unter Standardbedingungen
gebildet wurde, die direkte Messung der hämolytischen Gesamtaktivität des
klassischen
Komplementwegs.
Für
den
Nachweis
der
terminalen
Komplementkomplexe wird dabei ein monoklonaler Antikörper gegen ein
einzigartiges Neoantigen eingesetzt. Da sowohl der CH50 Eq EIA als auch der
CH50-Test auf der Bildung von TCC beruhen und miteinander korrelieren, werden
die Testergebnisse des CH50 Eq EIA in Äquivalenten von CH50-Einheiten pro
Milliliter angegeben.
3
Mitgelieferte Materialien
4.1.1
CH50 Eq Standard A, B, C, D, E (Standardlösungen A-E)
Enthalten Humanserum mit festgelegten Äquivalenten
Einheiten pro Milliliter (E Äq/mL), Proteinstabilisatoren.
CH50 Eq Normal Control (Normale Kontrolle) 3 x 100µL,
Enthalten nach Wiederherstellung Humanserum.
CH50 Eq Low Control (Niedrige Kontrolle) 3 x 100µL,
4.1.3
Stoppuhr (über einen Bereich von 60 Minuten)
Taschenrechner oder anderes Rechenverfahren zum Validieren der
Testergebnisse
Saubere, unbenutzte Mikroassay-Platten und/oder Teströhrchen und
Ständer
Behälter für die Waschpufferverdünnung
Waschflasche
oder
anderes
für
Immunassays
geeignetes
Waschsystem
Einstellbare Mehrkanalpipette (8 oder 12 Kanäle) Mehrfachmikropipetten (optional)
Saubere Pipetten, 1mL, 5mL und 10mL
Mikropipetten und Pipettenspitzen
Plattenlesegerät für Extinktionsmessungen (E450) über den Bereich von
0,0 bis 3,0
Vollentsalztes oder destilliertes Wasser
Inkubator oder Heizung (37°C) für Mikroassay-Platte
Wasserbad (37°C)
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
5
5.1
5.2.
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
5.11
5.12
5.13
5.14
5.15
REAGENZIEN
4.1
4.1.2
4.2.1
4.2.2
FUNKTIONSPRINZIP
Die mit dem CH50 Eq EIA durchgeführte quantitative Bestimmung der
gesamthämolytischen Aktivität des klassischen Komplementwegs lässt sich in
Humanserum grundsätzlich in drei Verfahrensschritte unterteilen: (1)
Komplementaktivierung, (2) Verdünnung der Proben und (3) Bestimmung der
terminalen Komplementkomplexe (TCC).
Zum Aktivieren des klassischen Komplementwegs werden unverdünnte
Humanserumproben und Kontrollen in Teströhrchen oder unbeschichtete
Mikroassay-Vertiefungen, die den Aktivator enthalten, gegeben. Während der
Inkubation wird der klassische Komplementweg ausgelöst und die TCC-Bildung
gestartet.
Im zweiten Schritt werden die aktivierten Seren in unbeschichtete MikroassayVertiefungen oder Teströhrchen verdünnt und zusammen mit den Standardlösungen
des Kits direkt auf eine Mikroassay-Platte gegeben. Die in den aktivierten Proben
vorliegenden TCCs werden an die monoklonalen Antikörper gebunden, mit denen
die Mikroassay-Vertiefungen beschichtet sind. Im dritten Verfahrensschritt wird die
Mikroassay-Platte gewaschen und dann mit einem HRP-Konjugat gefüllt, das mit
dem bereits gebundenen TCC eine Bindung eingeht. Nach dem Waschschritt wird
ein chromogenes Enzymsubstrat auf die TCC-Mikroplatte gegeben. Nach der
Inkubation wird dann zum Stoppen der Farbentwicklung ein Reagenz
hinzugegeben. Die Extinktion (E450-Werte) der Kontrollen, Kit-Standardlösungen und
Proben wird spektrophotometrisch gemessen. Die Farbintensität
der
Reaktionsmischung ist proportional zur TCC-Konzentration und den CH50Einheiten. Die Testergebnisse der Kit-Standardlösungen werden auf einer
Eichgeraden in Äquivalenten von CH50-Einheiten pro Milliliter (CH50 E Äq/mL)
dargestellt.
4
Benötigte Materialien (nicht im Lieferumfang)
4.2.3
Mit dem CH50 Eq EIA kann die gesamthämolytische Aktivität des klassischen
Komplementwegs in Humanserum gemessen werden. Auch ein Mangel der
Komplementfaktoren C1 bis C9 kann mit ihm erkannt werden.
2
4.2
5.16
je 1 x 1.5mL
von CH50(lyophilisiert)
(lyophilisiert)
5.17
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Zur in-vitro-Diagnostik.
Proben als potenziell gefährliches biologisches Material behandeln.
Beim Arbeiten mit diesem Kit und den Proben allgemein gültige
Vorsichtsmaßnahmen befolgen4.
Geeignete Schutzkleidung, Handschuhe und Augen-/Gesichtsschutz
tragen beim Arbeiten mit diesem Kit.
Die mitgelieferten Reagenzien als eine zusammengehörende Einheit
vor dem auf der Verpackung angegebenen Verfallsdatum verwenden.
Die Reagenzien des Assays wie angegeben lagern.
Die beschichteten Teststreifen nicht verwenden, wenn der Beutel
beschädigt ist.
ProClin 300 wird als Konservierungsstoff verwendet. Der
unbeabsichtigte Kontakt mit Pufferlösungen oder Reagenzien, die
ProClin enthalten, bzw. deren Einnahme kann zu Reizungen der Haut,
der Augen oder des Mundes führen. Die Anforderungen guter
Laborpraxis beachten, um die Exposition möglichst gering zu halten.
Beim Auftreten der ersten Symptome einen Arzt aufsuchen.
Stopplösung ist ätzend und kann zu Reizungen der Haut. Nicht
einnehmen. Berührung mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Bei
Berührung mit Wasser abwaschen. Bei Einnahme einen Arzt
konsultieren.
Alle Spendereinheiten, die für die Standardlösungen und Kontrollseren
dieses Produkts verwendet werden, wurden mit einer vom FDA
zugelassenen Methode auf Antikörper gegen HIV (HIV1 und HIV2),
Hepatitis-C-Viren und HBsAg untersucht. Da keine Testmethode mit
100% iger Sicherheit garantieren kann, dass keine infektiösen
Substanzen vorliegen, sollten diese Reagenzien wie alle potenziell
infektiösen Humanserum- oder Blutproben gemäß Biosafety Level 2
behandelt werden. Dementsprechende Empfehlungen sind im
Handbuch „Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,”
2007, Centers for Disease Control/National Institutes of Health,
beschrieben.
Für ein zügiges und effizientes Dosieren von Flüssigkeiten wird der
Gebrauch von Mehrkanal- oder Mehrfachpipetten empfohlen.
Zum Gewährleisten genauer Messungen bei der Zugabe der Proben
und Standardlösungen genau arbeiten. Beim Pipettieren vorsichtig
vorgehen und nur kalibrierte Geräte verwenden.
Für den Erhalt genauer Ergebnisse müssen die Proben fachgerecht
entnommen und aufbewahrt werden (siehe ENTNAHME UND
LAGERUNG DER PROBEN).
Eine mikrobielle Kontamination bzw. Kreuzkontamination von Proben,
Reagenzien oder Materialien vermeiden. Eine Kontaminationen kann
zu falschen Ergebnissen führen.
Jede Probe mit Doppelbestimmung testen.
Die Mikroassay-Vertiefungen jeweils nur für eine Bestimmung
verwenden.
Durch die Verwendung von Inkubationszeiten und - temperaturen, die
von den unter TESTVERFAHREN gegebenen Werten abweichen,
können falsche Ergebnisse erhalten werden.
Das TMB-Substrat muss während der Lagerung und Inkubation vor
Licht geschützt werden. Kontakt mit Augen, Haut und Kleidung
vermeiden. Bei Kontakt den betroffenen Bereich sofort mit Wasser
spülen.
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 4 of 14
5.18
5.19
5.20
5.21
5.22
5.23
6
Die Mikroassay-Vertiefungen nach dem Start des Tests nicht
austrocknen lassen.
Beim Hinzufügen oder Ansaugen von Flüssigkeiten zu bzw. von den
Mikroassay-Vertiefungen nicht den Boden der Vertiefungen ankratzen
oder berühren.
Hitzeinaktivierte, hyperlipämische oder kontaminierte Proben können zu
falschen Ergebnissen führen.
Um beim Waschen die Bildung von Aerosolen zu vermeiden, eine
Vorrichtung verwenden, mit der die Waschflüssigkeit in eine Flasche
mit haushaltsüblichem Bleichmittel gesaugt wird.
Zum Waschen der Platte eine Waschflasche oder ein automatisiertes
Dosiergerät verwenden (siehe TESTVERFAHREN, Schritt 9). Für
optimale Ergebnisse keine Mehrkanalpipette zum Waschen der
Mikroassay-Platte verwenden.
Behälter und ungenutzte Inhaltsstoffe gemäß den Anforderungen
bundesweit, landesweit und örtlich geltender Bestimmungen entsorgen.
LAGERUNG
Ungeöffnetes Kit bei 2–8°C aufbewahren. Nach dem Öffnen des Kits kann die
20fach konzentrierte Waschlösung bei 2–30°C aufbewahrt werden.
Nach der Entnahme der Reagenzien und Materialien, die für den Test verwendet
werden sollen, nicht benötigte Reagenzien sofort wieder auf die erforderliche
Lagertemperatur bringen. Die Reagenzien und Materialien vor dem Test auf
Raumtemperatur (15–30°C) bringen.
ANZEICHEN FÜR INSTABILITÄTEN ODER ZERSETZUNGSVORGÄNGE DER
REAGENZIEN
Eine Trübung oder Verfärbung der verdünnten Waschlösung weist auf eine
Zersetzung dieses Reagenzes hin. Die Lösung sollte in diesem Fall entsorgt
werden. Der Aktivator enthält u.A. Schwebstoffteilchen. Dies ist normal und
beeinträchtigt die Leistungsfähigkeit des Tests nicht.
7
ENTHAHME UND LAGERUNG DER PROBEN
9.3
a.
b.
c.
d.
9.4
9.6
9.7
9.8
9.9
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
VORBEREITUNG VON REAGENZIEN
Nach der Entnahme der erforderlichen Reagenzien und Materialien die nicht mehr
benötigten Komponenten wieder auf die erforderliche Lagertemperatur bringen (siehe
LAGERUNG). Alle Reagenzien und Materialien vor dem Test auf Raumtemperatur
(15–30°C) bringen.
8.1
Waschlösung
Die 20-fach konzentrierte Waschlösung durch mehrfaches Umdrehen der Flasche
mischen. Wird die 20-fach konzentrierte Waschlösung bei 2–8°C gelagert, haben
sich u. U. Kristalle gebildet. Zum Auflösen der Kristalle die Flasche in ein 37–50°C
warmes Wasserbad stellen, bis sich alle Kristalle aufgelöst haben und den Inhalt der
Flasche dann gründlich mischen. Die Waschlösung vorbereiten, indem der gesamte
Inhalt einer 20fach konzentrierten Waschlösungsflasche mit vollentsalztem oder
destilliertem Wasser auf 1 Liter verdünnt wird. Gründlich mischen. Die Waschlösung
ist bei Aufbewahrung in einem sauberen Behälter bei 2–8°C für 30 Tage haltbar.
Das Reagenz beim Auftreten von Verfärbungen oder Trübungen entsorgen.
8.2
Entnehmen der Mikroassay-Teststreifen
Die für den Test erforderliche Anzahl der Teststreifen bestimmen. Blindwerte,
Kontrollen und Standardlösungen sollten in Doppelbestimmungen getestet werden.
Die Teststreifen-Feststelleinrichtung von der Platte entfernen. Die nicht benötigten
Teststreifen entnehmen und in den Beutel legen. Den Beutel wieder verschließen
und bei 2–8°C aufbewahren. Die für den Test zu verwendenden Teststreifen
befestigen.
8.3
Probenverdünnung
Vorsicht: Alle Proben als potenziell infektiöses Material behandeln.
Hitzeinaktivierte, kontaminierte oder falsch gelagerte Proben dürfen nicht
verwendet werden. Für diesen Test werden Serumproben benötigt.
Serumproben sollten aufgetaut werden, indem sie bei 37°C kurz in ein Wasserbad
gelegt werden. Die Proben unmittelbar nach dem Auftauen bis zur Aktivierung auf
Eis legen (siehe TESTVERFAHREN). Die Proben vor der Aktivierung nicht
verdünnen.
8.4
Vorbereiten der normalen und niedrigen Kontrollen
Zu einem Fläschchen der lyophilisierten normalen und niedrigen Kontrolle 100µL
vollentsalztes oder destilliertes Wasser geben. Kurz mischen und dann bei
Raumtemperatur fünfzehn (15) Minuten ruhen lassen. Erneut im Vortex-Mixer
mischen und bis zur Aktivierung auf Eis legen.
9
9.2
9.5
Für diesen Test müssen Serumproben verwendet werden. Plasma ist nicht zulässig.
Beim Arbeiten und Entsorgen der Proben die allgemein üblichen
Vorsichtsmaßnahmen beachten.
Entnahme, Bearbeitung, Aufbewahrung und Transport der Proben müssen
fachgerecht durchgeführt werden, da die Komplementfaktoren bei einer
unsachgemäßen Handhabung der Proben aktiviert werden können. Ungenaue
Testergebnisse sind eine mögliche Folge.
Die Serumproben sollten unter keimfreien Bedingungen entnommen und gemäß
Standardverfahren für die klinische Laborpraxis getestet werden. Proben können bis
zu 2 Stunden bei Raumtemperatur, bis zu 4 Stunden auf Eis, bis zu 3 Tage bei 4°C
und über längere Zeiträume bei –70 °C oder tieferen Temperaturen eingefroren
werden. Die Proben dürfen nicht mehr als sechsmal eingefroren/ aufgetaut werden.
Eingefrorene Proben sollten unmittelbar nach dem Auftauen getestet oder bis zum
Testen auf Eis (nicht länger als vier Stunden) gelagert werden. Für den Transport
sollten die Proben auf Trockeneis gelegt werden. Proben, die das Labor im
aufgetauten Zustand erreichen, sind u.U. beschädigt. Im Labor neu eingetroffene
Proben können bei –70 °C oder tieferen Temperaturen gelagert werden.
8
9.1
TESTVERFAHREN
Vor der Durchführung des Tests die gesamte Packungsbeilage lesen.
Vor dem Fortfahren die unter VORBEREITUNG VON REAGENZIEN und
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN gegebenen Informationen
einsehen.
9.10
9.11
9.12
9.13
9.14
9.15
9.16
9.17
10
Aktivieren von Proben und Kontrollen.
Den Aktivator, der einfach zu suspendierende Teilchen enthält, durch
Schwenken der Flasche mischen. Die Flasche in diesem Schritt
wiederholt schwenken, um zu gewährleisten, dass die Teilchen gut
suspendiert sind. Je 86µL Aktivator in die erforderliche Anzahl an
Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen geben.*
Je 14µL unverdünnte Serumprobe, normale Kontrolle oder niedrige
Kontrolle in die Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen mit dem
Aktivator geben. Gründlich mischen. Abdecken, um die Verdampfung/
Verdunstung auf ein Minimum zu reduzieren. Bei 37°C für sechzig (60)
Minuten inkubieren. (TIPP: Sollen die Proben in Chargen getestet
werden, können die unverdünnten, aktivierten Proben nach der
Aktivierung bei –20 °C oder tieferen Temperaturen bis zum nächsten
Verfahrensschritt maximal 14 Tage aufbewahrt werden.)
* Die für die Aktivierung erforderliche Anzahl an Teströhrchen oder
Mikroassay-Vertiefungen entspricht der Anzahl der Proben zuzüglich
zwei (2) zusätzlicher Röhrchen/Vertiefungen für die beiden Kontrollen.
Verdünnen der aktivierten Proben und Kontrollen.
Die aktivierten Proben und Kontrollen nach der Aktivierung mit
Probenverdünnungsmittel im Verhältnis 1:200 verdünnen. Dazu
unbenutzte, saubere Mikroassay-Vertiefungen oder Teströhrchen
verwenden.
Die Mikroassay-Teststreifen wie folgt vorbereiten:
Die
Mikroassay-Vertiefungen
rehydrieren,
indem
mit
einer
Waschflasche oder einem automatisierten Dosiergerät in jede
Vertiefung 250–300µL Waschlösung gegeben wird.
Bei Raumtemperatur (15–30°C) für 2 Minuten inkubieren.
Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen.
Die Platte umdrehen und wiederholt vorsichtig auf absorbierendem
Papier ausklopfen, um Restflüssigkeiten zu entfernen.
100µL
des
Probenverdünnungsmittels
in
diejenige(n)
Duplikatvertiefung(en) geben, die zur Bestimmung des Nullwertes des
Plattenlesegeräts verwendet werden sollen (die sog. Blindwerte).
Je 100µL der gebrauchsfertigen Standardlösungen (A–E) in die
Duplikatvertiefungen geben. Die Standardlösungen sind bereits
verdünnt und können ohne weitere Vorbereitungen eingesetzt
werden.
Je 100µL der verdünnten, aktivierten normalen und niedrigen Kontrollen
in die Duplikatvertiefungen geben.
Je 100µL der verdünnten Probe (als Duplikate) in die entsprechenden
Mikroassay-Vertiefungen geben.
Bei Raumtemperatur (15–30°C) für 60 ± 1 Minuten inkubieren.
Die Mikroassay-Vertiefungen wie folgt waschen: Hinweis: Für
diesen Schritt sollte keine Mehrkanalpipette eingesetzt werden.
Nach der Inkubation von Schritt 8 (und Schritt 12 - siehe unten) die
Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen.
Die Vertiefungen mit einer Waschflasche, einem automatisierten
Plattenwaschgerät oder einer anderen Wascheinrichtung mit jeweils
250–300µL Waschlösung füllen.
Die Vertiefungen bei Raumtemperatur (15–30°C) für 1 Minute
inkubieren.
Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen.
Alle Vertiefungen mit jeweils 250–300µL Waschlösung füllen.
Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen entfernen.
Die Schritte e-f weitere fünfmal wiederholen.
Die Platte nach dem siebenten Waschschritt umdrehen und wiederholt
vorsichtig auf absorbierendem Papier ausklopfen, um Restflüssigkeiten
zu entfernen.
Mit einer Mehrkanal- oder Mehrfachpipette jeweils 50µL des Konjugats
in die gewaschenen Testvertiefungen und die Blindvertiefungen geben.
Die Mikroassay-Teststreifen bei Raumtemperatur (15-30°C) für 60 ± 1
Minuten inkubieren.
Die Mikroassay-Vertiefungen nach der 60 Minuten dauernden
Inkubation wie in Schritt 9.9 beschrieben waschen.
Unmittelbar nach dem Waschschritt je 100µL der TMB Substrat in die
Vertiefungen und Blindvertiefung(en) geben.
Die Mikroassay-Teststreifen bei Raumtemperatur (15-30°C) für 15 ± 1
Minuten inkubieren.
Zum Stoppen der enzymatischen Reaktion je 100µL Stopplösung in die
Vertiefungen geben. Die Zugab der Stopplösung in die Vertiefungen
sollte in der gleichen Reihenfolge und mit der gleichen Geschwindigkeit
erfolgen wie bei der Zugabe der Substratlösung. Die Platte vorsichtig
antippen, damit sich die Farbentwicklung gleichmäßig verteilt.
Innerhalb von einer Stunde nach der Zugabe der Stopplösung die
Extinktion der Testvertiefungen bei 450nm bestimmen (E450-Wert) und
eine Blindwertkorrektur vornehmen. Die Verwendung eines
Referenzfilters ist nicht erforderlich.
Die verbleibenden verdünnten Proben, Kontrollen, Aktivator und
benutzten Mikroassay-Teststreifen entsorgen (siehe Schritt 23 unter
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN). Den Halter und
die Feststelleinrichtung für Teststreifen für zukünftige Bestimmungen
aufbewahren.
QUALITÄTSKONTROLLE
10.1
Qualitätskontrolle
Gemäß guter Laborpraxis sollten Kontrollen verwendet werden, um die Richtigkeit
der Testergebnisse zu gewährleisten. Zu diesem Zweck enthält das CH50 Eq EIA
Kit normale und niedrige Kontrollen. Diese Kontrollen sollten mindestens einmal pro
Probensatz, d.h. einmal Aktivierungsserie, getestet werden. Die Befolgung der
Anleitungen vorausgesetzt, sollten die Kontrollen CH50 Äq/mL-Werte ergeben, die
innerhalb der auf den Flaschenetiketten angegebenen Bereiche liegen. Da diese
Kontrollen genau auf die gleiche Weise aktiviert, verdünnt und getestet werden wie
die Proben, dienen sie zum einen als Kontrolle und zum anderen als
Referenzstands für die Aktivierung und die CH50 Eq EIA Testserie. Darüber hinaus
können externe, vom Anwender angesetzte Kontrollen eingesetzt werden, um die
Richtigkeit der Testergebnisse zu gewährleisten. Zudem wird auf der
Packungsbeilage angegeben, dass Eichgerade, die mit den Standardlösungen A–E
des Testkits erstellt wurde, strengen Validierungsanforderungen gerecht werden
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 5 of 14
muss (siehe AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE). Die Standardlösungen sollten
für jede Testserie als Duplikate gestestet werden. Erfüllt der Test diese
Anforderungen nicht, den Test wiederholen oder den technischen Service von
Binding Site verständigen.
10.2
Auswertung der Ergebnisse
Eichgerade: Die Eichgerade des CH50_Eq_EIA wird mit den Blindwert-korrigierten
E450-Werten der verschiedenen Standardlösungen (auf der y-Achse) und den
entsprechenden Standardkonzentrationen (auf der x-Achse) erstellt. Die Eichgerade
muss den Validierungsanforderungen gerecht werden. Diese Berechnung wird von
den meisten Rechnern und Taschenrechnern unterstützt. Ein Beispiel einer
typischen Eichgerade ist in Abb. 1 dargestellt.
Berechnen der CH50 E Äq/mL-Werte in den Proben der Patienten: Die
Testergebnisse der Proben werden mit Hilfe einer linearen Regression von der
Eichgerade berechnet. Für Proben, die vor dem Testen aktiviert und im Verhältnis
1:200 verdünnt wurden, kann der CH50 E Äq/mL-Wert direkt von der Eichgerade
abgelesen werden. Auch die Werte (E Äq/mL) der normalen und niedrigen
Kontrollen können direkt von der Eichgerade abgelesen werden, da auch sie im
Verhältnis 1:200 verdünnt wurden. Um für Proben mit E450-Werten, die über dem
E450-Wert von CH50 Eq EIA Standardlösung E (oder unter dem E450-Wert von
Standardlösung A) liegen, genaue CH50-Bestimmungen zu erhalten, müssen die
Proben u.U. mit einem anderen Verdünnungsverhältnis erneut getestet werden, so
dass ihre neuen E450-Werte innerhalb dieser Grenzwerte liegen. Bei allen
Testwiederholungen müssen auch Standardlösungen und Kontrollen gemessen
werden. Wird eine Probe in einem anderen Verdünnungsverhältnis als 1:200
gemessen, müssen die CH50-Werte der Probe für diese Abweichung entsprechend
korrigiert werden. Wird eine Probe z. B. nicht 200fach, sondern 100fach verdünnt
und beträgt die anhand der linearen Regression berechnete Konzentration 100
CH50 E Äq/mL, so lautet die tatsächliche Konzentration der Probe 50 CH50 E
Äq/mL (d.h. 100 CH50 E Äq/mL geteilt durch 2).
Beispiel einer Eichgeraden
12
LEISTUNGDATEN
12.1
Präzision
Die Präzision „in der Serie“ und „von Serie zu Serie“ wurde für 16 Replikate von 4
Serumproben in 10 verschiedenen Testserien ermittelt.
Probe
Serum
1
n = 16
13
1.
2.
3.
4.
CH50
(E Äq/mL)
In der Serie1
C.V. (%)
150,4
3,2
6,0
59,96
4,5
5,4
98,84
3,6
8,7
48,86
3,9
6,2
2
Von Serie zu Serie2
C.V. (%)
n = 10 Testserien
LITERATURVERWEISE
Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer,
M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C
Thomas, 1961:133-71.
“Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver
Operating Characteristic (ROC) Plots.” Tentative Guideline, Dec. 1993. NCCLS
Document GP109-T, Vol. 13, No 28.
Passing, H. And W. Bablok. “A new biometrical procedure for testing the
equality of measurements from two different analytical methods. Application of
linear regression procedures for method comparison studies in clinical
chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): 709-720 (1983).
Centers for Disease Control.
Recommendations for prevention of HIV
transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001.
Hergestellt von Quidel® Corp. San Diego, USA für The Binding Site Group Ltd.
10.3
Validierung
Für die normalen und niedrigen Kontrollen den Wert CH50 E Äq/mL berechnen.
Darüber hinaus für die Regressionsgerade, die mit den Werten der
Standardlösungen A–E erstellt wurde, den Korrelationskoeffizienten (r) und den
Schnittpunkt mit der y-Achse (b) bestimmen. Für die erfolgreiche Validierung des
Tests müssen die Werte von r, b und der Kontrollen innerhalb der im Folgenden
aufgeführten Bereiche liegen:
Korrelationskoeffizient (r):
y-Schnittpunkt (b):
Hang (m):
Normale und niedrige Kontrolle:
> 0,96
(–)0,090 bis (+)0,068
0,0033 bis 0,0089
siehe Bereiche auf dem Etikett
des entsprechenden Fläschchens
10.4
Grenzen der Methode
Der CH50 Eq EIA wurde zum Testen von Serumproben verwendet. Die Eignung des
Tests für mit verschiedenen Antikoagulanzien versetzten Plasmaproben wurde nicht
untersucht.
11
ERWARTETE WERTE
Es wurden 234 normale und anormale Serumproben mit dem CH50 Eq EIA
getestet. Der für die Gruppe der normalen Proben erhaltene Mittelwert betrug 133 ±
54 CH50 E Äq/mL. Als Richtlinie wurde der Grenzwert von 70 CH50 E Äq/mL, der
für diese normalen und anormalen Serumproben mittels ROC (Receiver Operator
Characteristics)-Analyse2 erhalten wurde, festgelegt. Es wird empfohlen, daß jedes
Labor seine eigenen Normalbereiche ermittelt.
Mit dem CH50 Eq EIA wurden 221 Patientenproben in einem großen Referenzlabor
aus den USA getestet. Im Vergleich zu drei hämolytischen Tests und einem EnzymImmunassay wurde auf Grundlage des Grenzwertes von 70 CH50 E Äq/mL und der
ROC-Analyse eine Gesamtgenauigkeit von über 97% erhalten.
Auf konventionellen Messungen der klinischen Leistungsfähigkeit beruhend,
wurde mit dem CH50 Eq EIA eine klinische Genauigkeit von über 97%
erhalten. Die Sensitivität betrug dabei 93,2% und die Spezifität 99,4%. Nach
dem Passing-Bablok Test3 wurde zwischen den CH50 E Äq-Werten des CH50 Eq
EIA und den CH50-Werten des konventionellen hämolytischen Tests des klinischen
Labors ein Signifikanzniveau von (p < 0,001) gefunden.
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 6 of 14
CH50 Eq Essai Immunoenzymatique
CH50 Eq EIA Zusammenfassung
Vorbereitung von Reagenzien, Kontrollen und Proben
‰ Konzentrierte Waschlösung 1:20 mit deion. Wasser verdünnen
‰ Rekonstituieren Sie die Kontrolle mit 100µL deion. Wasser
Pour un usage en diagnostic in-vitro
(15 Minuten stehen lassen. Mischen, dann auf Eis setzen)
Code Produit : MK095
Testverfahren
Den Aktivator während des Gebrauchs kontinuierlich Schwenken
Je 86µL Aktivator in die Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen geben
Je 14µL der Kontrollen und Proben in die Teströhrchen oder MikroassayVertiefungen geben und gründlich mischen
Teströhrchen oder Mikroassay-Vertiefungen abdecken
und bei 37°C 60 ± 1 min inkubieren
(Aufbewahrung bis zu 14 Tage bei -20°C )
‰
Die aktivierten Proben und Kontrollen nach der Aktivierung mit
Probenverdünnungsmittel im Verhältnis 1:200 verdünnen
Je ~ 300µL Waschlösung in die Testvertiefungen geben
The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
www.bindingsite.co.uk
Distribué en France par la société :
The Binding Site France, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève
Cedex.
Téléphone: 04.38.02.19.19
Fax: 04.38.02.19.20
e-mail: [email protected]
1
Le test immunoenzymatique CH50 Eq quantifie l’activité totale du complément de la
voie classique dans le sérum humain et permet de détecter un déficit en un ou
plusieurs des composants C1 à C9 du complément.
2
Bei 15 – 30°C 2 min inkubieren
Die Flüssigkeiten aus den Vertiefungen durch Ausklopfen auf einer absorbierenden
Unterlage komplett entfernen
Je 100µL Komplement-Probenverdünngsmittel (Blindwert),
Standardlösungen, aktivierte Kontrollen und aktivierte Proben in die Testvertiefungen
geben
Bei 15 – 30°C 60 ± 1 mininkubieren
7 Wäschezyklen mit Waschlösung
(Erster Waschzyklus 1 min inkubieren)
Je 50µL Konjugat pipettieren
7 Wäschezyklen mit Waschlösung
(Erster Waschzyklus 1 min inkubieren)
Je 100µL Substratlösung pipettieren
Bei 15 – 30°C 15 ± 1 min inkubieren
Je 100µL Stopplösung pipettieren
Optische Dichte bei 450nm ablesen
Analysieren Sie die Proben-Resultate mittels linearer Kurvenanpassung
(y = mx + b)
RÉSUMÉ ET EXPLICATION
Le fait que le composant C1q du C1 se lie aux complexes immuns active la voie
classique du complément. Cette activation entraîne une cascade de réactions
enzymatiques et non enzymatiques aboutissant à la formation de complexes
terminaux du complément (TCC). En conditions normales, le taux de TCC qui peut
être observé dans un échantillon de sérum est une indication quantitative de
l’activité totale du complément de la voie classique de cet échantillon. On mesure
habituellement l’activité totale du complément de la voie classique par le test CH501.
Ce test est un essai lytique, qui utilise des érythrocytes de mouton sensibilisés avec
des anticorps pour activer le complément de la voie classique, ainsi que différentes
dilutions du sérum à analyser afin de déterminer la quantité nécessaire pour
provoquer une lyse à 50%. Le pourcentage d’hémolyse est déterminé à l’aide d’un
spectrophotomètre. Le test CH50 mesure indirectement le taux de TCC, puisque
ces derniers sont à l’origine de l’hémolyse qui est mesurée.
En revanche, le test immunoenzymatique CH50 Eq permet de mesurer directement
l’activité totale du complément de la voie classique dans le sérum en quantifiant les
TCC formés dans des conditions normales. Le test CH50 Eq utilise un anticorps
monoclonal anti-néoantigène unique pour capturer l’analyte des TCC. Étant donné
que les tests CH50 Eq et CH50 reposent tous deux sur la formation de TCC et sont
étroitement liés, les résultats de le test immunoenzymatique CH50 Eq sont exprimés
en équivalents d’unités CH50 par millilitre.
3
Bei 15 – 30°C 60 ± 1 Minute inkubieren
APPLICATION
PRINCIPE DU PROCEDE
Le test immunoenzymatique CH50 Eq portant sur la quantification de l’activité totale
du complément de la voie classique dans le sérum humain comprend trois étapes
de base: (1) l’activation du complément; (2) la dilution de l’échantillon; et (3) la
mesure des complexes terminaux du complément (TCC).
Pour activer le complément de la voie classique, on ajoute des échantillons de
sérum humain non dilués et des échantillons de contrôle dans des tubes à essais
(ou des puits de microplaque vierges) contenant de l’activateur. Pendant
l’incubation, la voie classique du complément est activée et des TCC se forment.
Au cours de la deuxième étape, les échantillons de sérums activés sont dilués dans
des puits de microplaque vierge ou des tubes à essais, et déposés, en même temps
que les étalons du coffret, directement dans une microplaque. Les TCC présents
dans l’échantillon activé se lient aux anticorps monoclonaux recouvrant les parois
des puits de microplaqye.
Lors de la troisième étape, on lave la microplaque pour les TCC et on la remplit de
conjugué-HRP qui se lie aux TCC fixés. Après ce lavage, on verse un substrat
enzymatique chromogénique sur la plaque. Après l’incubation, on ajoute un réactif
pour arrêter la réaction et stopper la coloration. Les valeurs d’absorbance (valeurs
A450) obtenues pour les contrôles, les étalons du coffret et les échantillons à
analyser, sont mesurées à l’aide d’un spectrophotomètre. L’intensité de la coloration
du mélange est proportionnelle à sa concentration en TCC et au nombre d’unités
CH50. Les résultats de du test sont exprimés en équivalents d’unités CH50 par
millilitre (U Eq de CH50/mL) à l’aide de la courbe étalon du test.
4
REACTIFS ET MATERIAUX FOURNIS
4.1
Materiaux Fournis
4.1.1
CH50 Eq Standard A, B, C, D, E (Échantillons étalon A-E) 1 x 1.5mL,
Chacun contient du sérum humain avec le nombre d’unités équivalentes
CH50 par mL (U Eq/mL) attribué, des conservateurs de protéines.
CH50 Eq Normal Control (Contrôle normal) 3 x 100µL, (lyophilisés). A
reconstituer. Contient du sérum humain.
CH50 Eq Low Control (Contrôle bas) 3 x 100µL, (lyophilisés) A
reconstituer. Contient du sérum humain.
Anti-TCC Coated Wells (Plaque de microtitration) Plaque de 96 puits avec
portoir et support composée de 12 barettes de huit puits recouverts
d’anticorps monoclonal de souris, dans une sachet d’aluminium
refermable.
4.1.2
4.1.3
4.1.4
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 7 of 14
4.1.5
CH50 Eq Stop Solution (Solution d’arrêt) 12mL, Contient 1N (4 %) d’acide
chlorhydrique
4.1.6
CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, (Solution de lavage 20x) 2 x
50mL, Chacun contient une solution saline de tampon phosphate (PBS),
1,0 % de Tween-20®, et 0,035% de ProClin® 300.
4.1.7
CH50 Eq Sample Diluent (Diluant de l’échantillon de complément) 50mL,
Contient du PBS, 0,05% de Tween-20, 2,5% de conservateurs de
protéines, et 0,035 % de ProClin 300
4.1.8
CH50 Eq TMB Substrate, (Substrat TMB) 12mL, Contient 3,3’,5,5’
tetramethylbenzidine (TMB) et peroxyde d'hydrogène (H2O2)
4.1.9
CH50 Eq Conjugate (Conjugué) 7mL, Contient des anticorps (de chèvre)
anti-TCC conjugués à de la peroxydase de raifort.
4.1.10 CH50 Eq Activator (Activateur) 10mL, Contient des gammaglobulines
humaines et des anticorps monoclonaux murins dans une solution saline
de tampon phosphate (PBS) avec 0,035 % de ProClin 300.
Tween-20® est une marque d’ICI Americas Inc.
ProClin® est une marque de Rohm and Haas Company.
4.2
Matériaux nécessaires non fournis
4.2.1
4.2.2
Minuterie (60 minutes)
Calculateur ou tout autre équipement informatique permettant de valider le
test.
Microplaques et/ou tubes à essais et supports de tests propres et non
utilisés
Récipient pour dilution de tampon de lavage
Flacon de lavage ou tout autre système de lavage adapté aux dosages
immunologiques
Pipettes multi-canaux réglables (8 ou 12 canaux) ou micropipettes
automatisées (en option)
Pipettes propres de 1mL, 5mL, et 10mL
Embouts de micropipettes et de pipettes
Lecteur de plaque capable de mesurer la densité optique A450 entre 0,0 et
3,0
Eau déionisée ou distillée
Incubateur ou réchauffeur de plaque de microtitration (37°C)
Bain-marie (37°C)
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.2.6
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
5
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
5.10
5.11
5.12
5.13
5.14
5.15
5.16
5.17
5.18
5.19
5.20
AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS
Pour utilisation en diagnostic in vitro.
Traiter les échantillons comme du materiel potentiellement
contaminant. Suivre les precautions standard lors de la manipulation du
contenu de ce coffret et de tous les échantillons de patients.4
Porter des vêtements, des gants et un appareil de protection des yeux
/du visage appropriés lors de la manipulation du contenu de ce coffret.
Utiliser les réactifs fournis ensemble avant la date de péremption
indiquée sur l’étiquette.
Stocker les réactifs du coffret selon les indications.
Ne pas utiliser les microplaques si la sache perçé.
Le ProClin 300 est utilisé comme conservateur. Tout contact ou toute
ingestion accidentelle de tampons ou de réactifs contenant du Proclin
peut provoquer une irritation de la peau, des yeux ou de la bouche. Le
respect des bonnes pratiques de laboratoire permet de réduire
l’exposition. Consulter un médecin en cas d’observation de ces
symptômes.
La solution d’arrêt est considéré corrosive et peut provoquer une
irritation de la peau. Ne pas ingérer. Eviter le contact avec la peau, les
yeux ou les vêtements. En cas de contact, laver à l’eau. En cas
d’ingestion, appeler un médecin.
Chacun des prélèvements de donneurs utilisés pour préparer les
sérums étalons et témoins (contrôles) de ce produit a été testé selon
une méthode agréée par la FDA pour détecter la présence d’anticorps
dirigés contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH1 et VIH2) et
le virus de l’hépatite C, ainsi que l’antigène de surface du virus de
l’hépatite B. Aucune méthode de test ne pouvant garantir totalement
l’absence d’agents infectieux, ces réactifs doivent être manipulés selon
le niveau 2 de sécurité biologique comme le recommande, pour tout
prélèvement sérique ou sanguin humain potentiellement infectieux, le
manuel des Centers for Disease Control/National Institutes of Health
intitulé « Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories »,
2007.
L’utilisation de pipettes multi-canaux ou de robots pipetteurs est
recommandée pour assurer la distribution rapide des réactifs.
Pour une mesure exacte des échantillons, ajouter les échantillons et les
solutions étalon avec précision. Pipetter avec soin, en utilisant
uniquement un équipement étalonné.
Il est essentiel de prélever et de conserver les échantillons avec soin
pour obtenir des resultats corrects (voir la section PRÉLÈVEMENT ET
CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS).
Éviter toute contamination microbienne ou croisée des échantillons, des
réactifs et du matériel. En cas de contamination, des résultats inexacts
pourraient être obtenus.
Tester chaque échantillon en double.
Ne pas réutiliser un puits de la microplaque pour un deuxième test.
Le fait de ne pas appliquer les durées et températures d’incubation
indiquées dans PROCÉDURE DE L’ESSAI est susceptible de conduire
à des résultats erronés.
Le substrat TMB doit être protégé de toute exposition à la lumière lors
de la conservation et de l’incubation. Éviter le contact avec les yeux, la
peau et les vêtements. En cas de contact, rincer immédiatement la
zone concernée à l’eau.
Ne pas laisser sécher les puits de la microplaque une fois que le test a
commencé.
Ne pas effleurer ni toucher le fond des puits en ajoutant ou en aspirant
des liquides.
Des échantillons inactivés par la chaleur, hyperlipémiques ou
contaminés, peuvent entraîner des résultats erronés.
5.21
5.22
5.23
6
Afin d’éviter la production d’aérosols pendant le lavage, utiliser un
appareil pour aspirer le liquide de lavage et le déverser directement
dans un flacon contenant de l’eau de Javel.
Utiliser un flacon de lavage ou un dispositif de remplissage automatique
pour laver la plaque (PROCÉDURE DE L’ESSAI, étape 9). Pour obtenir
des résultats optimaux, ne pas utiliser de pipette multicanaux pour laver
la microplaque.
Éliminer les récipients et leur contenu inutilisé conformément aux
dispositions réglementaires nationales et locales.
CONSERVATION
Conserver les coffrets non ouverts entre 2 et 8°C. Après ouverture du coffret
la solution de lavage concentrée 20x peut être conservée entre 2 et 30°C.
Après avoir choisi les réactifs ou les produits à utiliser pour l’essai, replacer
immédiatement les réactifs non utilisés à une température de conservation
appropriée. Amener les réactifs et produits du test à température ambiante (entre 15
à 30 °C) avant utilisation.
SIGNES D’INSTABILITÉ ET DE DÉTÉRIORATION DES RÉACTIFS
Toute turbidité ou décoloration de la solution de lavage indique une détérioration du
réactif. Le cas échéant, la solution doit être jetée. Il arrive que l’activateur contienne
des particules. Cela est tout à fait normal et n’influence en rien la performance de
l’essai.
7
PRELEVEMENT ET CONSERVATION DES ECHANTILLONS
Pour ce test, utiliser du sérum comme échantillon. Il n’est pas possible d’utiliser du
plasma.
Manipuler et éliminer tous les échantillons en suivant la précaution standard.
Il est très important de prélever, traiter, conserver et transporter les échantillons
avec soin, étant donné qu’une manipulation inappropriée de ces derniers peut
activer le complément. Cela peut entraîner des résultats erronés.
Les échantillons doivent être prélevés dans des conditions d’asepsie et préparés
suivant la technique standard pour les tests en laboratoire d’analyse. On peut
conserver les échantillons 2 heures à température ambiante, 4 heures sur de la
glace, 3 jours à 4°C, ou bien à -70°C ou moins pour une conservation plus longue.
Ne pas congeler/décongeler à plus de 6 reprises. Les échantillons congelés doivent
être testés dès que possible après avoir été décongelés ou bien conservés sur de la
glace (pendant quatre heures maximum) avant d’être testés.
Les échantillons doivent être emballés dans de la glace sèche pour le transport. Les
résultats des échantillons parvenant décongelés sur les lieux du test risque d’être
altérés. Une fois livrés, les échantillons peuvent être conservés à -70°C ou moins.
8
PREPARATION DES REACTIFS
Après avoir choisi les réactifs et les matériaux nécessaires, replacer immédiatement
les produits inutilisés dans un environnement aux températures de conservation
adaptées (voir la partie CONSERVATION). Amener tous les réactifs et matériaux de
l’essai à température ambiante (de 15 à 30°C) avant utilisation.
8.1
Solution de lavage
Mélanger la solution de lavage 20x en retournant plusieurs fois le flacon. Si la
solution de lavage 20x a été conservée entre 2 et 8°C, il est possible que des
cristaux se soient formés. Pour les dissoudre, réchauffer le flacon au bain-marie
entre 37°C et 50°C jusqu’à dissolution complète, puis bien mélanger. Préparer la
solution de lavage en diluant tout le contenu d’un flacon de solution de lavage 20x
avec de l’eau distillée ou déionisée jusqu’à obtention d’un litre de produit. Bien
mélanger. La solution de lavage reste stable pendant 30 jours quand elle est
conservée dans un récipient propre entre 2 et 8°C. Si le réactif devient trouble ou se
décolore, il doit être jeté.
8.2
Sélection des barettes de microtitration
Déterminer le nombre de puits nécessaire pour le test. Il est recommandé de tester
les puits blanc et les échantillons de contrôle et étalon en double. Retirer le support
pour barettes de la plaque assemblée. Remettre les barettes inutilisées dans le sac
de conservation refermé, et le stocker entre 2 et 8 °C. Fixer solidement les barettes
utilisées pour le test.
8.3
Dilution de l’échantillon
Avertissement: Manipuler tous les échantillons comme s’ils étaient
potentiellement infectieux. Ne pas utiliser d’échantillons inactivés par la
chaleur, contaminés, ou conservés dans des conditions inappropriées. Des
échantillons de sérum sont nécessaires pour ce essai.
Les échantillons de sérum doivent être décongelés rapidement dans un bain-marie
à 37°C. Dès que l’échantillon est décongelé, le déposer sur de la glace jusqu’à
l’étape d’activation (voir la partie PROCÉDÉ DU TEST). Ne pas diluer l’échantillon à
analyser avant l’activation.
8.4
Préparation des contrôles normaux et bas
Ajouter 100µL d’eau déionisée ou distillée dans un flacon de contrôle normal et
dans un autre de contrôle bas lyophilisés. Mélanger brièvement de manière à
assurer la reconstitution, et laisser reposer pendant quinze (15) minutes à
température ambiante. Mélanger de nouveau, puis poser sur de la glace jusqu’à la
phase d’activation.
9
PROCEDE DU TEST
Lire la notice produit dans son intégralité avant de commencer l’essai.
Voir les parties PRÉPARATION DES RÉACTIFS et AVERTISSEMENTS ET
PRÉCAUTIONS avant de poursuivre.
9.1
Activation des échantillons et des contrôles.
Mélanger l’activateur, qui contient des particules en suspension, en
remuant le flacon avant utilisation. Le remuer fréquemment pendant
cette étape afin que les particules restent en suspension. Ajouter 86µL
d’activateur dans le nombre requis de tubes à essais ou de puits de
microplaque.* Ajouter ensuite 14µL d’échantillon de sérum non dilué et
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 8 of 14
9.2
9.3
a.
b.
c.
d.
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
9.10
9.11
9.12
9.13
9.14
9.15
9.16
9.17
10
de contrôle normal ou bas dans chaque tube à essai ou puits de
microplaque contenant de l’activateur. Mélanger doucement. Couvrir
afin de limiter l’évaporation. Incuber à 37°C pendant soixante (60)
minutes. (PRATIQUE : Si vous souhaitez faire des lots d’échantillons,
vous pouvez conserver les échantillons non dilués et activés à –20°C
minimum pendant 14 jours maximum, juste après l’activation, et avant
de passer aux étapes suivantes.)
*Le nombre de tubes à essais ou de puits de microplaque nécessaires
pour l’activation correspond au nombre d’échantillons à analyser plus
deux (2), pour l’activation des deux échantillons de contrôle.
Dilution des échantillons et des contrôles activés.
Après l’activation, diluer les échantillons et les contrôles activés à 1:200
avec du diluant échantillon dans des tubes à essais ou des puits de
microplaque propres et non utilisés.
Préparer les barettes comme indiqué ci-après:
Réhydrater les puits de microplaque en les remplissant de solution de
lavage (250 à 300µl/puits) dans chaque puits à l’aide d’un flacon de
lavage ou d’un équipement de lavage automatique.
Incuber à température ambiante (15–30°C) pendant deux minutes.
Vider chaque puits.
Retourner la plaque et la taper sur du papier absorbant à plusieurs
reprises afin d’éliminer toute trace de liquide.
Ajouter 100µL de diluant de l’échantillon dans les puits en double qui
seront utilisés pour pour faire le blanc du lecteur de plaque.
Ajouter 100µL de chaque échantillon étalon prêt à l’emploi (A–E) dans
les puits en double. Remarque: les échantillons étalon ont déjà été
dilués et sont prêts à l’emploi.
Ajouter 100µl des contrôles normaux et bas dilués et activés dans les
puits en double.
Ajouter 100µl de chaque échantillon dilué dans le puits la microplaque
qui lui a été attribué.
Incuber à température ambiante (15–30°C) pendant 60 minutes ± 1
minute.
Laver les puits de microplaque comme suit: Remarque: Il n’est pas
recommandé de se servir d’une pipette multicanaux pour cette étape
Après l’incubation de l’étape 8 (ou de l’étape 12 ci-après), vider chaque
puits.
Remplir chaque puits de solution de lavage (250-300µl/puits) à l’aide
d’un flacon de lavage, d’un lave-plaques automatique ou de tout autre
équipement de lavage.
Incuber les puits pendant 1 minute à temperature ambiante (15-30°C).
Vider chaque puits.
Remplir tous les puits de solution de lavage (250-300µL/puits).
Vider chaque puits.
Répéter les étapes e à f cinq fois supplémentaires.
Après le septième cycle de lavage, retourner la plaque et la taper sur
du papier absorbant à plusieurs reprises afin d’éliminer toute trace de
liquide.
Verser 50µL de conjugué dans chaque puits lavé, y compris dans le(s)
puits blanc(s), à l’aide d’une pipette multi-canaux ou automatisée.
Incuber la barette de à temperature ambiante (15–30°C) pendant 60
minutes ± 1 minute.
Laver les puits de microplaque après l’incubation de 60 minutes,
comme décrit dans l’étape 9.9.
Immédiatement après le lavage, verser 100µL de la solution de substrat
TMB dans chaque puits, y compris dans le(s) puits blanc(s).
Incuber la barette de à temperature ambiante (15–30°C) pendant 15
minutes ± 1 minute.
Ajouter 100µL de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la
réaction enzymatique. La solution d’arrêt doit être ajoutée dans les
puits dans le même ordre et au même rythme que l’a été la solution de
substrat. Taper doucement la plaque pour que la couleur se propage
régulièrement.
Déterminer le degré d’absorbance à 450nm (valeur A450) pour chaque
puits dans l’heure suivant l’ajout de la solution d’arrêt, en corrigeant à
l’aide du puits. Aucun filtre de référence n’est nécessaire.
Jeter les échantillons, l’activateur et les contrôles dilués restants, ainsi
que les barettes de utilises (voir la partie AVERTISSEMENTS ET
PRÉCAUTIONS, étape 23). Garder le portoir et le support pour barettes
en vue d’une réutilisation.
RESULTATS ET CONTROLE QUALITE
10.1
Contrôle qualité
Les bonnes pratiques de laboratoire recommandent l’utilisation d’échantillons de
contrôle afin de garantir le bon fonctionnement du test. Chaque coffret EIA CH50 Eq
contient des contrôles normaux et bas qui peuvent être utilisés à cet effet. Ces
contrôles doivent être testés au moins une fois pour chaque lot d’échantillons, c’està-dire pour chaque procédure d’activation. Les contrôles, si utilisés comme indiqué,
doivent donner des valeurs en unités équivalentes CH50 dans les limites précisées
sur les étiquettes des flacons. Puisque ces contrôles doivent être activés, dilués et
testés exactement comme un échantillon type, ils servent de contrôles et
d’échantillons étalon de référence pour chaque activation et pour chaque série de
tests immunoenzymatiques CH50 Eq. Des contrôles externes, préparés par votre
laboratoire, peuvent également être utilisés afin de s’assurer du bon fonctionnement
du test.
En outre, la notice du produit exige que la courbe étalon générée à l’aide des
échantillons étalon A à E du coffret corresponde à des critères de validation
rigoureux (voir la partie INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS). Les échantillons
étalon doivent être analysés en double lors de chaque série de tests. Si le test ne
remplit pas ces critères, le renouveler, ou contacter l’assistance technique Binding
Site.
10.2
Interpretation des résultats
Utilisation de la courbe étalon: On obtient la courbe étalon pour le test EIA CH50
Eq en utilisant les valeurs A450 pour chaque échantillon étalon, auxquelles on
soustrait le blanc échantillon à blanc (en ordonnée), et la concentration
correspondant à chaque échantillon étalon (en abscisse). La courbe étalon doit
remplir les critères de validation. La plupart des ordinateurs et des calculateurs sont
capables d’exécuter ces calculs. La Figure 1 est un exemple de courbe étalon type.
Calcul du taux réel d’U Eq de CH50 dans les échantillons de patients: Les
valeurs pour chaque échantillon sont calculées à partir de la courbe étalon, grâce à
l’analyse par régression linéaire. Si les échantillons à analyser ont été activés et
dilués à 1:200 avant d’être testés, on peut lire le taux en U Eq de CH50/mL
directement sur la courbe étalon. On peut également lire les valeurs (U Eq/mL) pour
les contrôles normaux et bas directement sur la courbe étalon, si ceux-ci ont
également été dilués à 1:200.
Afin d’obtenir des résultats CH50 exacts pour les échantillons à analyser qui
donnent des valeurs A450 supérieures à celles de l’échantillon étalon E du test
immunoenzymatique CH50 Eq (ou des valeurs A450 inférieures à celles obtenues
pour l’échantillon étalon A), les échantillons à analyser peuvent être testés à
nouveau avec une dilution différente. Leurs nouvelles valeurs A450 peuvent alors se
situer entre ces limites. Lors de tous ces nouveaux tests, les échantillons étalon et
les contrôles doivent aussi être testés.
Si un échantillon est testé à une dilution autre que 1:200, le taux de CH50 de
l’échantillon est calculé en tenant compte de la différence entre la dilution testée et
la dilution à 1:200 habituelle. Par exemple, si un échantillon est dilué à 1:100 au lieu
de la dilution habituelle de 1:200, et que la courbe de régression linéaire indique une
concentration de 100 U Eq de CH50/mL, alors le taux reel de U Eq de CH50/mL
dans l’échantillon est de 50 (soit 100 U Eq de CH50/mL divisé par 2).
Exemple de courbe etalon
10.3
Validation
Calculer le taux en U Eq de CH50/mL pour les contrôles normaux et bas.
Déterminer également le coefficient de corrélation (r) et le point d’intersection sur
l’axe des ordonnées (b) de la meilleure courbe linéaire obtenue pour les valeurs des
échantillons étalon A à E. Pour que le test soit validé, les valeurs r et b, et celles du
contrôle, doivent se situer entre les limites indiquées ci-dessous:
Coefficient de corrélation (r):
Y - intercepter (b):
pente (m):
Valeurs du contrôle normal et bas:
> 0,96
de (–)0,090 à (+)0,068
0,0033 – 0,0089
Entre les limites indiquées sur l’étiquette de
leur flacon respectif.
10.4
Limites du procédé
Le test immunoenzymatique CH50 Eq est utilisé pour analyser les échantillons de
sérum. La performance clinique des échantillons de plasma préparés avec différents
anticoagulants n’a pas été déterminée.
11
VALEURS ATTENDUES
Deux cent trente-quatre (234) échantillons de sérums normaux ont été testés avec
le test CH50 Eq. La valeur moyenne obtenue avec les échantillons normaux était de
133 U Eq de CH50/mL ± 54. À titre indicatif, le seuil obtenu à l’aide de l’analyse de
fonction d’efficacité de l’observateur 2 avec ces échantillons de sérums était de 70 U
Eq de CH50/mL. Chaque laboratoire doit établir sa propre plage de références.
Deux cent vingt-et-un (221) échantillons prélevés sur des patients ont été testés à
l’aide du test CH50 Eq dans l’un des principaux laboratoires de référence des ÉtatsUnis. À partir du seuil établi de 70 U Eq de CH50/mL et de l’analyse de fonction
d’efficacité de l’observateur, l’exactitude du test EIA CH50 Eq, en comparaison avec
les résultats obtenus par trois tests d’hémolyse et un test immunoenzymatique, était
supérieure à 97%.
Selon les méthodes classiques de mesure de la performance clinique, le test
EIA CH50 Eq présente également un degré de précision clinique supérieur à
97% avec une sensibilité de 93,2% et une spécificité de 99,4%. Le test de
régression par les moindres carrés3 indique que les valeurs U Eq de CH50 obtenues
avec le test immunoenzymatique CH50 Eq étaient très proches des valeurs CH50
obtenues avec le test de l’hémolyse classique réalisé par le laboratoire clinique,
obtenant un seuil de signification de p < 0,001.
12
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE
12.1
Précision
On a dosé à 16 reprises 4 échantillons de sérums (Précision intra essai) et on a
dosé ces mêmes échantillons dans 10 dosages différents (Précision inter-essais).
Echantillon
Sérum
1
CV Intra-essai1
(%)
150.4
3.2
6.0
59.96
4.5
5.4
98.84
3.6
8.7
48.86
3.9
6.2
2
n = 16
13
CV Inter-essais2
(%)
CH50
(U Eq/mL)
n = 10 dosages
REFERENCES
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 9 of 14
Sommaire CH50 Eq EIA
1.
2.
3.
4.
Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer,
M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C
Thomas, 1961:133-71.
“Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver
Operating Characteristic (ROC) Plots.” Tentative Guideline, Dec. 1993. NCCLS
Document GP109-T, Vol. 13, No 28.
Passing, H. And W. Bablok. “A new biometrical procedure for testing the
equality of measurements from two different analytical methods. Application of
linear regression procedures for method comparison studies in clinical
chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): 709-720 (1983).
Centers for Disease Control.
Recommendations for prevention of HIV
transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001.
Préparation des réactifs, des contrôles, des standards et des
échantillons
‰ Diluer la solution de lavage concentrée au 1:20 avec de l’eau désionisée
‰ Reconstituez chaque Contrôle avec 100µL d’eau désionisée
(Laisser reposer pendant 15 minutes. Mélanger. Puis poser sur de la glace).
Procédure de test
Melanger sans interruption en remuant pendant l’utilisation
Ajouter 86µL d’activateur dans les tubes à essais ou des puits de la microplaque
Fabriqué pour The Binding Site Group Ltd par Quidel® Corp. San Diego, USA.
Ajouter 14µL d'échantillon ou de contrôle dans chaque tube
à essai ou puits de microplaque et mélanger doucement
Couvrir chaque tube à essai ou puits
et incuber pendant 60 ± 1 minute à 37°C
(conserver à -20 °C pendant 14 jours maximum)
Diluer les échantillons et les contrôle activés au 1:200 avec du diluant échantillon dans
des tubes à essais ou des puits de microplaque propres et non utilisés
Ajouter ~ 300µL de solution de lavage dans puits à tester
Incuber pendant 2 minutes entre 15 et 30°C
Vider chaque puits (Tache séche)
Ajouter 100µL de diluant échantillon (puits blanc), Étalons prêts à l'emploi, contrôles
dilués et activés et échantillons dilués et activés dans les puits tester
Incuber pendant 60 ± 1 minute entre 15 et 30°C
Laver 7x avec Solution de Lavage
(Incuber le premier lavage 1 minute)
Ajouter 50µL de Conjugué
Incuber pendant 60 ± 1 minute entre 15 et 30°C
Laver 7x avec Solution de Lavage
(Incuber le premier lavage 1 minute)
Ajouter 100µL de Solution de Substrat
Incuber pendant 15 ± 1 minute entre 15 et 30°C
Ajouter 100µL de Solution d’Arrêt
Lire la densité optique à 450 nm. Analysez les résultats
en utilisant un ajustement linéaire de courbe
(y = mx + b)
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 10 of 14
4.1.6
CH50 Eq
ENZIMOINMUNOENSAYO
4.1.7
4.1.8
Para uso diagnóstico in-vitro
4.1.9
4.1.10
Código de producto: MK095
The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK.
www.bindingsite.co.uk
The Binding Site Spain S.L.U.,
C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona
Teléfono 902027750
Fax: 902027752
e-mail: [email protected]
web: www.bindingsite.es
1
El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq mide la actividad total de la vía clásica del
complemento en suero humano y permite la detección de deficiencias en uno o más
de los componentes del complemento C1 a C9.
2
RESUMEN Y EXPLICACION
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
Materiales necesarios pero no suministrados
4.2.1
4.2.2
4.2.3
Cronómetro (de 60 minutos)
Calculadora u otro método de cálculo para validar el ensayo
Placas de microensayo limpias y sin usar y/o tubos de ensayo y
portatubos
Recipiente para dilución del tampón de lavado
Botella para lavado u otro sistema de lavado para inmunoensayo
Pipeta multicanal ajustable (8 ó 12 canales) o micropipetas de
repetición (opcionales)
Pipetas limpias, 1mL, 5mL y 10mL
Micropipetas y puntas de pipeta
Lector de placas apto para valores A450 de densidad óptica de 0,0 a 3,0
Agua desionizada o destilada
Incubador o calentador de placas de microensayo (37°C)
Baño de agua (37 °C)
4.2.7
4.2.8
4.2.9
4.2.10
4.2.11
4.2.12
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
5.9
PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO
El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq para cuantificar la actividad total de la vía
clásica del complemento en suero humano se divide en tres procedimientos
básicos: (1) activación del complemento, (2) dilución de la muestra y (3) ensayo de
los complejos de complemento terminales (CCT).
Para activar la vía clásica del complemento, muestras de suero humano sin diluir y
los controles a los tubos de ensayo (o pocillos de microensayo sin fijar) que
contienen el activador. Durante la incubación, se activa la vía clásica del
complemento y se generan los CCT.
En el segundo paso, se diluyen los sueros activados en pocillos de microensayo sin
fijar o tubos de ensayo y se aplican, junto con los patrones del kit, directamente a
una placa de microensayo. Los CCT presentes en las muestras activadas se unen a
los anticuerpos monoclonales que recubren la superficie de los pocillos de
microensayo.
En el tercer paso, la placa de microensayo de CCT se lava y se carga con un
conjugado con peroxidasa de rábano, que se unirá a los CCT unidos. Después de
lavarla, la microplaca de CCT se carga con un sustrato de enzima cromogénico.
Después de la incubación, se añade un reactivo para detener la formación de color.
Las absorbancias (valores A450) generadas con los controles, patrones del kit y
muestras del ensayo se miden mediante una espectrofotometría. La intensidad del
color de la mezcla de reacción es proporcional a la concentración de CCT
presentes y a unidades de CH50. Utilizando la curva estándar del kit, los resultados
del ensayo se expresan en equivalentes de unidades de CH50 por mililitro (CH50 U
Eq/mL).
4
4.2
5
La unión del componente C1q de C1 a complejos immunes activa la vía clásica del
complemento. Esta activación da como resultado una cascada de reacciones
enzimáticas y no enzimáticas, que culminan en la formación de complejos de
complemento terminales (CCT). Bajo condiciones normales, el nivel de CCT que
puede generarse en un suero es una expresión cuantitativa de la actividad total de
la vía clásica del complemento en el suero.
El método tradicional para medir la actividad total de la vía clásica del complemento
en el suero es el ensayo CH501. Este ensayo es un análisis lítico, que utiliza
eritrocitos de oveja sensibilizados a anticuerpos (EA) como activador de la vía
clásica del complemento y varias diluciones del suero del ensayo para determinar la
cantidad requerida para producir una lisis del 50 %. La hemólisis porcentual se
determina mediante espectrofotometría. El ensayo CH50 es una medida indirecta
de los CCT, ya que los CCT son directamente responsables de la hemólisis que se
mide.
El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq proporciona una medida directa de la
actividad total de la vía clásica del complemento en el suero cuantificando la
cantidad de CCT generados bajo condiciones normales. El enzimoinmunoensayo
CH50 Eq utiliza un anticuerpo monoclonal contra un neoantígeno único para
capturar el analito de los CCT. Debido a que tanto el enzimoinmunoensayo de
CH50 Eq como la prueba CH50 dependen de la generación de CCT y parecidos,
los resultados del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq se expresan en unidades
CH50 equivalentes por mililitro.
3
Tween-20® es una marca de ICI Americas Inc.
ProClin® es una marca registrada de Rohm and Haas Company.
4.2.4
4.2.5
4.2.6
USO PREVISTO
REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS
CH50 Eq Standard A, B, C, D, E (Patrones A-E) 1 x 1,5mL Cada uno
contiene suero humano con equivalentes a unidades de CH50 por mL
asignados (U Eq/mL), estabilizadores de proteínas
CH50 Eq Normal Control (Control normal) 3 x 100µL, (liofilizado) Una vez
reconstituido, cada uno contiene suero humano
CH50 Eq Low Control (Control bajo) 3 x 100µL, (liofilizado) Una vez
reconstituido, cada uno contiene suero humano
Anti-TCC Coated Wells (Placa de microensayo) 96 pocillos con retén y
soporte, en doce tiras de ocho pocillos recubiertas con un anticuerpo
monoclonal de ratón en una bolsa de papel de aluminio resellable
CH50 Eq Stop Solution (Solución de parada) 12mL, Contiene Ácido
Clorhídrico 1N (4%)
CH50 Eq Wash Buffer 20x concentrate, (Concentrado de solución de
lavado) 2 x 50mL, Cada uno contiene solución salina tamponada de
fosfato (PBS), Tween-20® al 1,0% y ProClin® 300 al 0,035%
CH50 Eq Sample Diluent (Diluyente de muestras de complemento) 50mL,
Contiene PBS, Tween-20 al 0,05 %, estabilizadores al 2,5%, ProClin 300
al 0,035%
CH50 Eq TMB Substrate, (Sustrato TMB) 12mL, Contiene 3,3’, 5,5’
tetramethylbenzidine (TMB) y Peróxido de Hidrógeno (H2O2).
CH50 Eq Conjugate (Conjugado) 7mL, Contiene anticuerpos anti-CCT (de
cabra) conjugados en peroxidasa de rábano
CH50 Eq Activator (Activador) 10mL, Contiene gammaglobulinas humanas
y anticuerpos monoclonales murinos en solución salina tamponada de
fosfato (PBS) con ProClin 300 al 0,035%
5.10
5.11
5.12
5.13
5.14
5.15
5.16
5.17
5.18
5.19
5.20
5.21
5.22
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Para uso diagnóstico in vitro.
Respete las precauciones universales al manipular el contenido de este
kit y las muestras de los pacientes.4
Use ropa protectora adecuada, guantes y protección ocular/facial al
manipular el contenido de este kit.
Use los reactivos suministrados como una unidad integral antes de la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta del envase.
Guarde los reactivos de ensayo según lo indicado.
No emplee las tiras recubiertas si la bolsa está pinchada.
El ProClin 300 se utiliza como conservante. El contacto o la ingestión
accidentales de tampones que contienen ProClin pueden provocar
irritación en la piel, los ojos o la boca. Utilice buenas prácticas de
laboratorio para reducir la exposición. Busque atención médica en caso
de experimentar estos síntomas.
El Solución de parada se considera corrosivo y puede provocar
irritación en la piel. No lo ingiera. Evite el contacto con la piel, los ojos y
la ropa. En caso de contacto, lave con agua. En caso de ingestión,
solicite asistencia médica.
Cada unidad donante utilizada en la preparación de las muestras y
sueros de control de este producto fue analizada con un método
aprobado por la FDA para detectar la presencia de anticuerpos contra
el virus de inmunodeficiencia humana (VIH1 y VIH2) y contra el virus
de la hepatitis C y antígenos de superficie de la hepatitis B. Debido a
que ningún método puede garantizar totalmente que no hay agentes
infecciosos, estos reactivos deben manipularse a un nivel de
bioseguridad 2, como cualquier suero humano o muestra de sangre
potencialmente infecciosos, según se recomienda en el manual de los
Centers for Disease Control/National Institutes of Health “Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories,” 2007.
Se recomienda utilizar pipetas multicanal o dosificadores de repetición
para garantizar la administración de los reactivos en el momento
adecuado.
Para una medición exacta de las muestras, añada las muestras y los
patrones con precisión. Pipetee cuidadosamente utilizando sólo equipo
calibrado.
Es fundamental recoger y almacenar de forma adecuada las muestras
de ensayo para obtener resultados precisos (vea la sección
RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS).
Evite la contaminación microbiana o cruzada de las muestras, reactivos
o materiales. Su contaminación puede llevar a la obtención de
resultados incorrectos.
Analice cada muestra por duplicado.
No utilice un pocillo de microensayo para más de un ensayo.
El uso de tiempos y temperaturas de incubación que no sean los
indicados en la sección PROCEDIMIENTO DE ENSAYO puede dar
resultados erróneos.
El sustrato de TMB debe protegerse de la luz durante su
almacenamiento e incubación. Evite el contacto con los ojos, la piel y la
ropa. En caso de contacto, lave inmediatamente el área afectada con
agua.
No permita que los pocillos de microensayo se sequen una vez iniciado
el ensayo.
Al añadir o aspirar líquidos de los pocillos de microensayo, no raspe ni
toque el fondo de los pocillos.
Las muestras inactivadas por calor, hiperlipémicas o contaminadas
pueden dar resultados erróneos.
Para evitar la formación de aerosoles durante el lavado, utilice un
aparato para aspirar el líquido de lavado al interior de un frasco que
contenga lejía de uso doméstico.
Utilice una botella para lavado o un dispositivo de llenado automático
para lavar la placa (PROCEDIMIENTO DE ENSAYO, Paso 9). Para
obtener los mejores resultados, no utilice una pipeta multicanal para
lavar la placa de microensayo.
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 11 of 14
5.23
6
Deseche los recipientes y el contenido no utilizado de acuerdo con la
normativa internacional, nacional y local.
CONSERVACIÓN
Conserve el kit no abierto a 2–8°C. Una vez abierto, el concentrado de
solución de lavado 20X puede guardarse a 2-30°C. Después de seleccionar los
reactivos o materiales que se utilizarán en el ensayo, vuelva a guardar
inmediatamente los reactivos no utilizados a las temperaturas de conservación
adecuadas. Deje que los reactivos y los materiales para el ensayo se estabilicen a
temperatura ambiente (15–30°C) antes de su uso.
INDICACIONES DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE REACTIVOS
Si la solución de lavado diluida se vuelve turbia o se decolora significa que el
reactivo se ha echado a perder y debe desecharse.
El activador puede contener partículas. Esto es normal y no afecta el buen
funcionamiento del ensayo.
7
RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS
Utilice suero como muestra en este ensayo. El plasma no es aceptable.
Manipule y deseche todas las muestras utilizando las precauciones
universales.
Es fundamental recoger, procesar, almacenar y enviar las muestras de forma
adecuada ya que las muestras mal manipuladas pueden activar el complemento y
llevar a resultados erróneos.
Las muestras de suero deben recogerse utilizando técnicas asépticas y prepararse
según las técnicas habituales para el análisis clínico en laboratorio. Las muestras
pueden ser almacenadas hasta 2 horas a temperatura ambiente, hasta 4 horas en
hielo, hasta 3 días a 4°C, y a –70 °C o menos para almacenamiento a largo plazo.
Se recomienda no someter las muestras a más de seis ciclos de
congelación/descongelación. Las muestras congeladas deben analizarse lo antes
posible después de descongelarlas o guardarse en hielo (no más de cuatro horas)
hasta su ensayo.
Las muestras deben guardarse en una gran cantidad de hielo seco para su
transporte. Las muestras que llegan descongeladas al centro de ensayo pueden
estar comprometidas. Después de recibirlas, las muestras pueden conservarse a
-70°C o a una temperatura inferior.
8
8.1.
Solución de lavado
Mezcle el concentrado de solución de lavado 20x invirtiendo el frasco varias veces.
Si el concentrado de solución de lavado 20x se ha guardado a una temperatura de
2–8°C, es posible que se hayan formado cristales. Para disolver los cristales,
caliente el frasco en un baño de agua de 37–50°C hasta que todos los cristales se
hayan disuelto y, a continuación, mézclelo bien. Prepare la solución de lavado
diluyendo todo el contenido de uno de los frascos de concentrado de solución de
lavado 20X, hasta un litro, con agua destilada o desionizada. Mezcle bien. La
solución de lavado es estable durante 30 días si se conserva en un recipiente limpio
a 2–8 °C. En caso de decoloración o turbiedad, deseche el reactivo.
8.2.
Selección de las tiras de microensayo
Determine la cantidad de pocillos requeridos para el ensayo. Se recomienda
realizar el ensayo de los pocillos testigo, controles y patrones por duplicado. Retire
el retén de la tira de la placa montada. Retire las tiras que no necesita y colóquelas
en la bolsa de conservación. Vuelva a sellar la bolsa y guárdela a 2-8°C. Fije las
tiras que utilizará en el ensayo.
8.3.
Dilución de muestras
Atención: trate todas las muestras como si fueran potencialmente
infecciosas. No utilice muestras inactivadas por calor o contaminadas ni
muestras mal conservadas. Se requieren muestras de suero para este ensayo
Las muestras de suero deben descongelarse rápidamente colocándolas
brevemente en un baño de agua de 37°C. Inmediatamente después de
descongelarlas, coloque las muestras en hielo hasta el paso de activación (vea la
sección PROCEDIMIENTO DE ENSAYO). No diluya las muestras de ensayo antes
de la activación.
8.4.
Preparación de los controles normal y bajo
Añada 100µL de agua desionizada o destilada a un vial de control normal y a un vial
de control bajo liofilizados. Mezcle brevemente para asegurar su reconstitución y
deje reposar durante quince (15) minutos a temperatura ambiente. Vuelva a agitar
en el vórtex y coloque en hielo hasta que esté listo para el paso de activación.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
Lea el prospecto del producto en su totalidad antes de iniciar el ensayo.
Vea las secciones PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS y ADVERTENCIAS Y
PRECAUCIONES antes de continuar.
9.1
9.3
a.
b.
c.
d.
9.4
9.5
9.6
9.7
9.8
9.9
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Tras retirar los reactivos y materiales necesarios, vuelva a guardar los elementos no
utilizados a la temperatura correspondiente indicada (vea la sección
CONSERVACIÓN). Deje que todos los reactivos y materiales para el ensayo se
estabilicen a temperatura ambiente (15–30°C) antes de su uso.
9
9.2
Activación de muestras y controles.
Mezcle el activador, que contiene partículas de fácil suspensión,
haciendo girar el frasco antes de usarlo. Hágalo girar varias veces
durante este paso para asegurar la suspensión de las partículas.
Añada 86µL de activador a la cantidad adecuada de tubos de ensayo o
pocillos de microensayo.* A continuación, añada 14µL de muestra de
suero sin diluir, control normal o control bajo a los tubos de ensayo
individuales o pocillos de microensayo que contienen el activador.
Mezcle con cuidado. Cubra para reducir al mínimo la evaporación.
Incube a 37°C durante sesenta (60) minutos. (PARA SU
CONVENIENCIA: si desea agrupar las muestras en lotes, después de
la activación puede guardar las muestras activadas sin diluir a –20°C o
9.10
9.11
9.12
9.13
9.14
9.15
9.16
9.17
10
a una temperatura inferior hasta 14 días antes de continuar con los
siguientes pasos.)
* La cantidad de tubos de ensayo o pocillos de microensayo requeridos
para la activación es igual a la cantidad de muestras de ensayo más
dos (2) para la activación de los dos controles.
Dilución de las muestras activadas y controles
Después de la activación, diluya las muestras activadas y los controles
activados en 1:200 con diluyente de muestras en pocillos de
microensayo limpios no usados o en tubos de ensayo.
Prepare las tiras de microensayo de la siguiente forma:
Rehidrate los pocillos de microensayo llenándolos con solución de
lavado (250–300µL/pocillo) utilizando una botella para lavado o un
dispositivo automático.
Incube a temperatura ambiente (15-30°C) durante dos minutos.
Elimine el líquido de cada pocillo.
Invierta la placa y golpéela con fuerza sobre papel absorbente varias
veces para eliminar todo el líquido restante.
Añada 100µL de diluyente de muestras a los pocillos duplicados que se
utilizarán como pocillos testigo con el lector de placa.
Añada 100µL de cada patrón listo para usar (A–E) a los pocillos
duplicados. Tenga en cuenta que los patrones ya se han diluido y
están listos para usar.
Añada 100µL de los controles normal y bajo activados y diluidos a los
pocillos duplicados.
Añada 100µL de cada muestra diluida por duplicado a los pocillos de
microensayo asignados.
Incube a temperatura ambiente (15–30°C) durante 60 ± 1 minutos.
Lave los pocillos de microensayo como se indica a continuación:
Nota: no se recomienda utilizar una pipeta multicanal para este paso.
Después de la incubación del paso 8 (o del paso 12 a continuación),
elimine el líquido de cada pocillo.
Utilizando una botella para lavado, un lavador de placas automático u
otro dispositivo de lavado, llene cada pocillo con la solución de lavado
(250-300µL/pocillo).
Incube los pocillos durante 1 minuto a temperature ambiente (1530°C).
Elimine el líquido de cada pocillo.
Llene cada pocillo con solución de lavado (250–300µL/pocillo).
Elimine el líquido de cada pocillo.
Repita los pasos e–f cinco veces más.
Después del séptimo ciclo de lavado, invierta la placa y golpéela con
fuerza sobre papel absorbent varias veces para eliminar todo el líquido
restante.
Utilizando una pipeta multicanal o de repetición, aplique 50µL de
conjugado en cada pocillo de ensayo lavado, incluyendo los pocillos
testigo.
Incube las tiras de microensayo a temperature ambiente (15–30°C)
durante 60 ± 1 minutos.
Lave los pocillos de microensayo después de la incubación de 60
minutos, tal como se describe en el paso 9.9.
Inmediatamente después del procedimiento de lavado, aplique 100µL
de la solución de TMB sustrato a cada pocillo, incluyendo los pocillos
testigo.
Incube las tiras de microensayo a temperature ambiente (15–30°C)
durante 15 ± 1 minutos.
Añada 100µL de solución de parada a cada pocillo para detener la
reacción enzimática. La solución de parada debe añadirse a los
pocillos en el mismo orden y a la misma velocidad que la solución de
sustrato. Golpee suavemente la placa para que la formación de color
sea uniforme.
Determine el valor de absorbancia a 450nm (valor A450) para cada
pocillo de ensayo dentro de una hora después de añadir la solución de
parada, realizando una corrección en blanco según el sistema
espectrofotométrico en uso. No se requiere filtro de referencia.
Deseche las muestras diluidas restantes, el activador, los controles y
las tiras de microensayo usadas (vea la sección ADVERTENCIAS Y
PRECAUCIONES, punto 23). Conserve el soporte y el retén de la tira
para su uso futuro.
RESULTADOS Y CONTROL DE CALIDAD
10.1
Control de calidad
Las buenas prácticas de laboratorio recomiendan el uso de controles para
asegurarse de que el ensayo funciona correctamente. Cada kit de
enzimoinmunoensayo de CH50 Eq de Quidel contiene controles normales y bajos
que pueden utilizarse para este propósito. Estos controles deben analizarse al
menos una vez por cada lote de muestras, es decir, una vez por ciclo de activación.
Los controles, cuando se los utiliza según las instrucciones, deberían dar valores
equivalentes a unidades CH50 dentro de los intervalos especificados en las
etiquetas de sus viales. Debido a que estos controles deben activarse, diluirse y
analizarse exactamente como una muestra típica, sirven como controles y muestras
de referencia para cada activación y ciclo del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq.
También pueden utilizarse controles externos, preparados por su laboratorio, para
asegurarse de que el ensayo está funcionando correctamente.
Asimismo, el prospecto del producto requiere que la curva estándar generada con
los patrones A–E del kit cumplan con estrictos requisitos de validación (vea la
sección INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS). Los patrones deben
analizarse por duplicado para cada ciclo de ensayo. Si el ensayo no cumple con
estos requisitos, repítalo o póngase en contacto con el Servicio técnico de Binding
Site.
10.2
Interpretación de los resultados
Uso de la curva estándar: la curva estándar del enzimoinmunoensayo de CH50
Eq se genera utilizando el valor A450 sustraído del testigo de cada patrón (en el eje
Y) en función de la concentración asignada a cada patrón (en el eje X). La curva
estándar generada debe cumplir con los requisitos de validación. La mayoría de los
ordenadores y calculadoras es capaz de realizar este cálculo. En la Figura 1 se
muestra un ejemplo de una curva estándar típica.
Cálculo del nivel de CH50 U Eq real en muestras del paciente: los valores de las
muestras se calculan a partir de la curva estándar utilizando análisis de regresión
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 12 of 14
lineal. Para las muestras de ensayo activadas y diluidas en 1:200 antes del ensayo,
el valor CH50 U Eq/mL puede leers directamente de la curva estándar. Los valores
(UEq/mL) de los controles normal y bajo también pueden leerse directamente de la
curva estándar, ya que también se diluyeron en 1:200. A fin de obtener
determinaciones de CH50 precisas para muestras de ensayo que dan valores A450
superiores a los del patrón E del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq (o que dan
valores A450 inferiores a los obtenidos con el patrón A), las muestras de ensayo
pueden volver a analizarse a una dilución diferente para que sus nuevos valores
A450 se encuentren dentro de estos límites. En todos los ensayos repetidos también
deben analizarse los patrones y los controles. Si una muestra se analiza a una
dilución distinta de 1:200, el nivel de CH50 de la muestra se determina corrigiéndolo
según la diferencia entre la dilución examinada y la dilución de 1:200 habitual. Por
ejemplo, si una muestra se diluye a 1:100 en lugar de a 1:200 como es habitual y la
curva de regresión lineal da una concentración de 100 CH50 U Eq/mL, el valor de
CH50 U Eq/mL real de la muestra es de 50 (es decir, 100 CH50 U Eq/mL dividido
por 2).
Ejemplo de curva estándar
12
1.
2.
3.
4.
REFERENCIAS
Mayer, M.M. Complement and Complement Fixation. In: Kabat E.A., Mayer,
M.M., eds. Experimental Immunochemistry. 2nd ed. Springfield: Charles C
Thomas, 1961:133-71.
“Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver
Operating Characteristic (ROC) Plots.” Tentative Guideline, Dec. 1993. NCCLS
Document GP109-T, Vol. 13, No 28.
Passing, H. And W. Bablok. “A new biometrical procedure for testing the
equality of measurements from two different analytical methods. Application of
linear regression procedures for method comparison studies in clinical
chemistry, Part I J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 21(1): 709-720 (1983).
Centers for Disease Control.
Recommendations for prevention of HIV
transmission in health-care settings. MMWR 1987;36 (suppl no. 2S):001.
Producido por Quidel® Corp. San Diego, USA para The Binding Site Group Ltd.
.
10.3
Validación
Calcule el valor CH50 U Eq/mL para los controles normal y bajo. Determine también
el coeficiente de correlación (r) y la intersección Y (b) de la curva lineal de ajuste
óptimo derivada para los valores obtenidos con los patrones A–E. Para validar el
ensayo, los valores r, b y de control deben encontrarse dentro de los siguientes
intervalos:
coeficiente de correlación (r):
> 0,96
intersección Y (b):
entre (–)0,090 y (+)0,068
pendiente (m):
entre 0,0033 y 0,0089
valores de controles normal y bajo: Dentro de los intervalos indicados en
las etiquetas de sus respectivos
viales.
10.4
Limitaciones del procedimiento
El enzimoinmunoensayo de CH50 Eq se ha utilizado para analizar muestras
recogidas como suero. Aún no se ha determinado el comportamiento clínico de las
muestras de plasma preparadas con otros coagulantes.
11
VALORES ESPERADOS
Se analizaron doscientas treinta y cuatro (234) muestras de suero normales y
anormales con en enzimoinmunoensayo de CH50 Eq. El valor promedio obtenido
con la población de muestra normal fue de 133 ± 54 CH50 U Eq/mL. A modo de
orientación, el valor de corte obtenido mediante la técnica de análisis ROC
(características operativas del receptor)2 con estas muestras de suero normales y
anormales de suero fue de 70 CH50 U Eq/mL. Cada laboratorio debe establecer su
propio intervalo de referencia normal.
Utilizando el enzimoinmunoensayo de CH50 Eq, se analizaron doscientas veintiuna
(221) muestras de pacientes en un laboratorio clínico de referencia importante de
los Estados Unidos. Utilizando un valor de corte de 70 CH50 Eq U/mL y la técnica
de análisis ROC, la exactitud general del enzimoinmunoensayo de CH50 Eq,
comparada con los resultados combinados de tres ensayos hemolíticos y un
enzimoinmunoensayo, fue superior al 97%.
Utilizando mediciones tradicionales de comportamiento clínico, el
enzimoinmunoensayo de CH50 Eq también dio una exactitud clínica superior
al 97% con una sensibilidad del 93,2% y una especificidad del 99,4%.
Utilizando el método algorítmico de Passing y Bablok3, los valores de CH50 U Eq
obtenidos con el enzimoinmunoensayo de CH50 Eq mostraron una estrecha
correlación con los valores de CH50 obtenidos con el ensayo hemolítico tradicional
informado por el laboratorio clínico, con un nivel de significancia de p < 0,001.
12
CARACTERÍSTICAS DE COMPORTAMIENTO
12.1
Precisión
La precisión Intra-ensayo y Inter-ensayo fue determinada con 16 réplicas de 4
muestras de suero en 10 ciclos diferentes.
Muestra
Suero
1
n = 16 réplicas
CH50 U Eq/mL
Intra-ensayo1
C.V. (%)
Inter-ensayo2
C.V. (%)
150.4
3.2
6.0
59.96
4.5
5.4
98.84
3.6
8.7
48.86
3.9
6.2
2
n = 10 ciclos
Insert Code: E095, Version: 21st September 2009, Page 13 of 14
CH50 Eq EIA Resumen
Preparación del Reactivo, Control y de la Muestra
‰ Diluya la concentrado de solución de Lavado 1:20 con agua desionizada
‰ Reconstituya cada control con 100µL agua desionizada
(Déjelo durante 15 minutos. Agitar en el vórtex y coloque en hielo).
Procedimiento de ensayo
Agite continuamente el activador durante su uso.
Añada 86µL de Activador a los tubos de ensayo o pocillos de microensayo
Añada 14µL de muestras y controles a los tubos de ensayo individuales o
pocillos de microensayo y mezcle con cuidado
Cubra los tubos de ensayo individuales o pocillos de microensayo
e incubar 60 ± 1 min a 37°C
(puede guardar a ≤ -20 °C hasta 14 días)
‰
Diluya las muestras y los controles a 1:200 con diluyente de muestras en pocillos
de microensayo limpios
Añada ~ 300µL de Solución de Lavado a pocillos de ensayo
Incubar 2 minutos a 15-30°C
Elimine el líquido de cada pocillo (Mancha seca)
Añadir 100µL de: diluyente de muestra (blanco), de estándares, controles y muestras
activaos en los pocillos de ensayo
Incubar 60 ± 1 min a 15-30°C
Lave 7x con la Solución de Lavado
(Incube el primer lavado durante 1 min)
Añada 50µL de Conjugado
Incubar 60 ± 1 min a 15-30°C
Lave 7x con la Solución de Lavado
(Incube el primer lavado durante 1 min)
Añada 100µL de Solución de Sustrato
Incubar 15 ± 1 min a 15-30°C
Añada 100µL de Solución de Parada
Leer densidad optica a 450nm
Analice los resultados del análisis usando un ajuste linear de la curva
(y = mx + b)
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