CARACTERIZACIÓN DEL GENOMA DEL ROEDOR TETRAPLOIDE
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Profesor Patrocinante Dr. Milton Gallardo N. Instituto de Ecología y Evolución Facultad de Ciencias CARACTERIZACIÓN DEL GENOMA DEL ROEDOR TETRAPLOIDE Pipanacoctomys aureus (OCTODONTIDAE) MEDIANTE TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA CLÁSICA Y MOLECULAR Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico JORGE EDUARDO TORRES PAZ VALDIVIA – CHILE 2009 …Si lo mantienen en un tazón pequeño, el pez dorado permanecerá pequeño. Con más espacio se volverá dos, tres, cuatro veces más grande. (El Gran Pez) AGRADECIMIENTOS Agradezco profundamente a las siguientes personas que de una u otra forma colaboraron en el tiempo en que realicé este trabajo: Al profesor Milton Gallardo por recibirme en su laboratorio y transmitirme continuamente su conocimiento científico. Con su gran aporte y sabiduría este trabajo salió adelante y he aprendido otros aspectos de la vida distintos a los de la ciencia propiamente tal. A mi familia que siempre me apoyó, en especial a mi madre por su esfuerzo y cariño que siempre he sentido. También a Tití y Pame por constante apoyo y cariño. Quizás nunca he sido muy expresivo con ellas pero las quiero mucho y saben que es así. No puedo dejar fuera a mis tíos Vivi, Hardy, Paty y Mony, y a mis primos Ponchi, Diego, Fran y Toño por todo su cariño y preocupación. Gracias a todos. A mis más grandes amigos, casi hermanos, Talo y Gogo, con quienes más he compartido y confío. También a Jarita y Salao, que pese a la distancia, aún nuestra hermandad continúa vigente. A mi amigo Elkin, por todo lo que me enseñó en el LAB de forma tan desinteresada y por su amistad. A mi amigo Rodriguín, con quien llegamos juntos al laboratorio y siempre nos hemos apoyado mutuamente. A los amigos que hice en la Enseñanza Media en especial a la Pancha, Dany, Will, Nico, Jenny y Michi con quienes aún continuamos compartiendo algunos carretes (unos cuantos). A los amigos que hice durante estuve en la carrera. En especial agradezco a Marchant, Siber, Paly, Magda, Oscarín y Agustín por apoyarme cuando estaba lejos de mi casa. A otros amigos a quienes estimo mucho y han sido importantes en algún momento de mi vida, en especial la Jo, Cristobal, Fabrito, Dannie, Francisca, Fonci, Androides, Winnie, Kata, Karen, Choto, Daryl, Pablo, Juan Diego, Pedro, Ronnie y Sambolo. Además agradezco a la gente que conocí en Hawaii por su amistad desinteresada, especialmente la Señora Martha y el niño Gallo que hicieron mi estadía muy, muy grata. Al tío Fredy por todos los conocimientos que me entregó de citogenética y otros importantes aspectos de la vida. También a la señora Nélida por enseñarme a trabajar metódicamente de forma no tan apresurada como solía hacerlo. A Fondecyt 1070217 por financiar este trabajo. i ÍNDICE GENERAL Pág. 1.- Resumen 1 1.1.- Summary 2.- Introducción 3 5 2.1.- Hipótesis de trabajo 12 2.2.- Objetivo general 13 2.3.- Objetivos específicos 13 3.- Materiales y métodos 3.1.- Materiales 14 14 3.1.1.- Material biológico 14 3.1.2.- Enzimas 14 3.1.3.- Reactivos 15 3.1.4.- Soluciones preparadas 16 ii 3.2.- Métodos 18 3.2.1.- Obtención de cromosomas de P. aureus y O.mimax 18 3.2.2.-Extracción de ADN genómico 19 3.2.3.- Electroforesis 20 3.2.4.- Cuantificación del ADN genómico 20 3.2.5.- Preparación de la sonda fluorescente 21 3.2.6.- Preparación del ADN bloqueador 21 3.2.7.- GISH 22 3.2.7.1.- Pre-hibridación 22 3.2.7.2.- Hibridación 23 3.2.7.3.- Lavados post-hibridación y montaje 24 3.2.7.4.- Análisis microscópico y procesamiento de imágenes 25 3.2.8.- Bandeo C 27 3.2.9.- Bandeo G con tripsina usando Giemsa (GTG) 27 3.2.10.- Tinción con Verde de metilo/DAPI 28 iii 4.- Resultados 30 4.1.- Cuantificación y calidad del ADN genómico 30 4.2.- Electroforesis de la sonda y del ADN bloqueador 31 4.3.- GISH 33 4.4.- Cariotipos de P. aureus y O. mimax con bandeo C 36 4.5.- Cariotipos de P. aureus y O. mimax con bandeo G 39 4.6.- Cariotipos de P. aureus y O. mimax teñidos con verde de metilo/DAPI 44 5.- Discusión 47 6.- Conclusiones 55 7.- Bibliografía 56 iv ÍNDICE DE FIGURAS Pág. Figura 1.- Modelo propuesto para explicar el origen de Pipanacoctomys 9 aureus y Tympanoctomys barrerae. Figura 2.- Metodología de GISH. 26 Figura 3.- Gel de electroforesis de los DNA extraídos. 31 Figura 4.- Gel de electroforesis de la sonda fluorescente. 32 Figura 5.- Gel de electroforesis del DNA bloqueador. 33 Figura 6.- GISH sobre placas metafásicas de P. aureus utilizando la sonda 35 de DNA genómico de O. mimax y el DNA genómico de P. aureus como bloqueador. Figura 7.- Experimentos control del GISH 36 Figura 8.- Bandeo C de P. aureus. 38 Figura 9.- Bandeo C de O. mimax. 39 Figura 10.- Bandeo G de P. aureus. 41 v Figura 11.- Bandeo G de O. mimax. 42 Figura 12.- Bloques cromosómicos sinténicos encontrados en P. aureus 43 y O. mimax mediante bandeo G. Figura 13.- Tinción con verde de metilo de P. aureus. 45 Figura 14.- Tinción con verde de metilo de O. mimax. 46 vi LISTA DE ABREVIATURAS cm Centímetros CO2 Dióxido de Carbono DAPI 4’,6-diamino-2-fenilindol dATP Desoxiadenosina trifosfato dCTP Desoxicitidina trifosfato dGTP Desoxiguanosina trifosfato DNA Ácido desoxirribonucléico dTTP Desoxitimidina trifosfato FISH Hibridación fluorescente in situ GISH Hibridación genómica in situ H0 Hipótesis nula H1 Hipotesis alternativa kb Kilobases M Molar vii mL Mililitros mM Milimolar nm Nanómetros NOR Región Organizadora del Nucleólo µL Microlitro PBS Buffer fosfato salino pb Pares de bases PSI Pounds per square inch (unidad de presión) SBF Suero bovino fetal SSC Citrato salino sódico % v/v Porcentaje volumen - volumen µg Microgramos °C Grados Celsius 1 1.- RESUMEN La poliploidía es un fenómeno muy común en plantas, invertebrados y algunos vertebrados. Sin embargo, en mamíferos ha sido considerada irrelevante, hasta el descubrimiento de tetraploidía en los roedores Tympanoctomys barrerae (2n = 102) y Pipanacoctomys aureus (2n = 92). En ambas especies la tetraploidía se ha confirmado por medio de análisis de FISH, usando genes de copia única. Este resultado concuerda con el tamaño del genoma y con el efecto gigas observado en sus células germinales. Para explicar el origen de P. aureus se ha propuesto a Octomys mimax (2n = 56) como uno de sus ancestros, mientras que el otro sería un taxón desconocido. Para validar la hipótesis de alopoliploidía se realizaron experimentos de hibridación genómica in situ (GISH) usando como sonda el DNA genómico total de O. mimax, marcado con fluoresceína, hibridándola sobre placas metafásicas de P. aureus. Como bloqueador se utilizó DNA genómico de P. aureus no marcado, el cual se contratiñó con DAPI. Las placas se examinaron bajo microscopio de epifluorescencia. Se realizaron bandeos G, C y tinción verde de metilo para evidenciar los reordenamientos que involucran secuencias repetidas y determinar las regiones de sintenia. Alrededor de 20 cromosomas de P. aureus presentaron homología completa con el DNA de O. mimax, 14 cromosomas con su propio genoma, y aproximadamente 58 cromosomas mostraron recombinación intergenómica. Aproximadamente, 17 cromosomas de O. mimax y 37 de P. aureus son ricos en AT. Las bandas G mostraron sintenia en varios segmentos cromosómicos y en algunos cromosomas completos de estas especies. 2 Nuestros resultados sugieren que el genoma de O. mimax forma parte del genoma de P. aureus, apoyando su origen híbrido. Los resultados de bandeos indican múltiples eventos de reorganización genómica que tuvieron lugar tras el origen de P. aureus. Estos eventos habrían contribuido a la viabilidad de la especie como ha sido reportado en muchos organismos que experimentan alopoliploidización. 3 1.1.- SUMMARY Polyploidy is a very common phenomenon in plants, invertebrates and in some vertebrates. Nevertheless, in mammals it has been considered irrelevant, until the discovery of tetraploidy in the rodents Tympanoctomys barrerae (2n = 102) and Pipanacoctomys aureus (2n = 92). In both species tetraploidy has been confirmed by FISH analysis, based on single copy genes. This result is consistent with the genome size and the gigas effect observed in their germinal cells. To explain the origin of P. aureus it has been proposed O. mimax (2n = 56) as one of the ancestors, while the other one is an unknown taxon. To validate the hypothesis of allopolyploidy were carried out genomic in situ hybridization (GISH) experiments using as probe the whole genomic DNA from O. mimax, labeled with fluorescein, hybridized over metaphase plates of P. aureus. As blocking, genomic DNA from P. aureus unlabeled was used, which was counterstained with DAPI. The plates were examined under epifluorescence microscope. G-, C- banding and methyl green staining were conducted to detect rearrangements involving repeated sequences and sinteny regions. About 20 chromosomes from P. aureus had complete homology with O. mimax DNA, 14 chromosomes with its own genome, and about 58 chromosomes showed intergenomic recombination. Approximately, 17 chromosomes from O. mimax and 37 from P. aureus are ATrich. The G bands detected sinteny in various chromosomal segments as well in whole chromosomes. 4 Our results suggest that O. mimax’s genome is part of the P. aureus genome, supporting its hybrid origin. Multiple genomic reorganization events took place after the origin of P. aureus, a feature that would have contributed to the viability of the specie as it has been reported in many organisms that have undergone allopolyploidization. 5 2.-INTRODUCIÓN La poliploidía es una condición genómica heredable, en la cual, los organismos que la presentan, poseen más de dos juegos cromosómicos haploides en sus células (Comai, 2005). Estos complementos cromosómicos pueden proceder de individuos de la misma especie (autopoliploidía), o por la hibridación de dos especies diferentes (alopoliploidía) (Otto, 2007). Se han descrito muchos mecanismos capaces de producir poliploidía, principalmente en plantas. Por ejemplo la endopoliploidía, que ocurre solamente en ciertos tejidos y que potencialmente es una fuente para la formación de nuevos poliploides (Ramsey y Schemske, 1998). Otra vía de gran importancia involucra la formación de gametos no reducidos, lo cual produce células germinales 2n, que contienen el número somático de cromosomas completo (Pagliarini et al., 1999; Crespel y Gudin, 2003; Ramsey, 2007). Un mecanismo menos común es conocido como poliespermia, esto es, la fecundación de un huevo por más de un espermatozoide (Ramsey y Schemske, 1998). La poliploidía produce una serie de reorganizaciones genómicas en el organismo recién formado. En algunos casos, estas reorganizaciones son visibles solamente en generaciones posteriores y son más evidentes en alopoliploides. Tales cambios incluyen rearreglos estructurales a nivel cromosómico como causa de recombinación entre cromosomas homeólogos, cambios a nivel de secuencias y en la regulación de la expresión génica. Finalmente, también se ha reportado la activación de elementos transponibles que actúan como reguladores en cis y trans en genes vecinos. También se ha observado la amplificación, redistribución y pérdida de 6 secuencias altamente repetitivas (Ozkan et al., 2001; Cheng y Ni, 2006; Ropiquet et al., 2008; Kemkemer et al., 2009). En animales la poliploidía es menos frecuente que en plantas, debido a problemas en el mecanismo de compensación de dosis y en el sistemas de determinación del sexo. (Orr, 1990; Mable, 2004). En humanos, se ha determinado que una de las causas principales de abortos espontáneos, se debe a anormalidades cariotípicas, destacándose principalmente entre ellas la poliploidía (Eiben et al., 1990). En los humanos con tetraploidía, la mayoría no logran sobrevivir más allá del primer mes, debido a un desarrollo anormal, con algunas excepciones (Guc-Scekic, 2002). El descubrimiento de alotetrapliodía en el roedor Tympanoctomys barrerae ha revocado el dogma de imposibilidad de poliploidía en mamíferos (Gallardo et al., 1999). Este roedor, situado dentro del suborden Histricognathi, pertenece a la familia Octodontidae (molares con forma de ocho) (Köhler et al., 2000). T. barrerae, altamente adaptado a la aridez desierto de Monte de Argentina, tiene un rango de distribución que se extiende desde el Parque Nacional Ichigualasto (provincia de La Rioja, Argentina 30°05’S, 68°53’O), hasta el salar de Añelo (provincia de Neuquén, 38°10’S, 68°53’ O). Sin embargo se han documentado nuevas localidades para T. barrerae en la Patagonia central de Argentina (Provincia de Chubut, Argentina 43°13’51.6’’S, 68°38’49.1’’O; Gallardo et al., 2009). T. barrerae habita principalmente en la frontera de salares y cuenca salina, donde su alimentación consiste en quenopodiáceas halofíticas, como Atriplex, Heterotachys y Soueda. 7 El contenido de DNA genómico de T. barrerae (16.8 pg de DNA) es aproximadamente el doble de la mayoría de los octodóntidos (Octomys mimax = 8.0 pg, Acoanemys fuscus = 7.5 pg, Octodontomys gliroides = 8.2 pg; Gallardo et al., 2003), y sus cromosomas son completamente bibraquiados, lo cual sugiere una duplicación genómica. Además se ha observado que las células somáticas y de la línea germinal tanto masculina como femenina poseen un gran tamaño con respecto a sus parientes diploides, usados como control (Gallardo et al., 2003; Gallardo et al., 2004). Este “Efecto gigas” tiene directa relación con el contenido de DNA, debido a que este se encuentra ligado a mecanismos regulatorios que afectan las dimensiones del núcleo y de la célula (Price et al., 1973; Gallardo et al., 1999). El descubrimiento de Pipanacoctomys aureus (2n =92), especie filogenéticamente hermana a T. barrerae (Mares et al., 2000), ha ayudado a esclarecer el pasado evolutivo de T. barrerae. P. aureus es también un roedor altamente especializado al clima desértico y salares y su distribución abarca la provincia de Catamarca en Argentina (27º 50’ S, 66º 15’ O). En P. aureus, al igual que en T. barrerae, se ha observado células somáticas y espermáticas de gran tamaño, y un contenido de DNA cercano al doble de sus parientes diploides (15.3 pg de DNA). Tiene un complemento de 92 cromosomas, todos bibraquiados a excepción del cromosoma Y, el cual es un acrocéntrico altamente conservado dentro de los octodóntidos (Gallardo et al., 2004; 2006). En la meiosis de P. aureus y T. barrerae sólo se observan bivalentes (46 y 51 respectivamente), que resultan en un patrón de apareamiento del tipo diploide. Este apareamiento proporciona una perfecta segregación de los cromosomas y sugieren poliploidía y diploidización funcional en esta especie (Gallardo et al., 2004). 8 Los análisis filogenéticos demuestran que P. aureus es la especie hermana de T. barrerae y que el diploide Octomys mimax es el grupo externo a ellos (2n=56; Gallardo et al., 2004). Se ha estimado que el tiempo de divergencia entre O. mimax y las dos especies tetraploides (P. aureus y T. barrerae) habría ocurrido alrededor 4.3 millones de años, en el Plioceno. En cambio, la separación entre P. aureus y T. barrerae habría ocurrido en el Plio-Pleistoceno, cerca de 1.74 millones de años atrás (Opazo, 2005). Debido a su meiosis diploidizada, se ha propuesto que T. barrerae habría surgido tras un evento de hibridación interespecífica de los linajes ancestrales de O. mimax y P. aureus (Gallardo et al., 2006; 2007). Esto se ha analizado mediante hibridación genómica in situ, GISH (Suárez, 2007), demostrándose que el genoma de T. barrerae tiene dos componentes, uno proveniente de O. mimax y otro de P. aureus. Una forma de establecer que los poliploides tienen origen híbrido es mediante el uso de citogenética molecular. La técnica GISH (hibridación genómica in situ) o CGH (hibridación genómica comparativa), es una modificación de hibridación fluorescente in situ (FISH) y ha sido muy útil para la detección de aberraciones cromosómicas en ciertos tumores, leucemias y linfomas (Lapierre y Tachdjian, 2005). Además, permite evidenciar la presencia de genes amplificados y mapear su localización en cromosomas (Karhu et al., 1997). Mediante GISH se han podido también diferenciar los cromosomas sexuales en algunas especies, utilizando como sonda el genoma de un individuo del sexo de interés (Traut et al., 1999). El GISH se ha utilizado también para discriminar genomas parentales en interespecíficos y híbridos alopoliploides, como por ejemplo en Iris versicolor (Lim et al., 2007), 9 Brassica juncea (Maluszynska y Hasterok, 2005), Tinopyrum ponticum (Brasileiro-Vidal et al., 2005). Para ello, se usa DNA genómico total de una especie parental como sonda, marcada con algún fluoróforo, en experimentos de hibridación in situ sobre cromosomas en metafase. Figura 1. Modelo del origen de Pipanacoctomys aureus y Octomys mimax mediante eventos de hibridación interespecífica. Dos especies ancestrales de Octomys mediante gametos no reducidos habrían dado origen a P. aureus. A su vez, P. aureus, con gametos diplides, habría hibridado con Octomys mimax, que habría producido gametos 2n, dando origen al tetraploide Tympanoctomys barrerae (Gallardo et al., 2007). 10 Se usó además DNA genómico total no marcado del otro parental, a fin de incrementar la especificidad de la sonda y discriminación de los genomas en cuestión, evitando de esta forma la hibridación cruzada debido a la presencia de secuencias repetitivas. Al visualizar en microscopio de epifluorescencia, se observan señales emitidas por la sonda debido a la hibridación DNA-DNA (Raina y Rani, 2001). También puede realizarse hibridación simultánea con dos sondas genómicas de especies distintas marcada con un fluoróforo diferente cada una de ellas (Belyayev y Raskina, 1998; Yoong Lim et al., 2008). Así se obtienen placas metafásicas que muestran los dos genomas diferenciados. En los casos que se desconoce una de las especies parentales se han realizado experimentos de GISH, como en el caso de la caracterización del genoma de la planta alotetraploide Zingeria trichopoda, realizando bloqueo con el DNA genómico de la especie cuyas placas metafásicas se analizan (Kotseruba et al., 2003). Considerando la evidencia ya presentada, la hipótesis propuesta aquí es que, P. aureus es un alotetraploide, y que O. mimax es una de las especies parentales. Para poner a prueba la hipótesis se realizó GISH sobre placas metafásicas de P. aureus, usando como sonda el DNA genómico total de O. mimax, marcado con fluoresceína. Como ya se hizo mención anteriormente, un evento de alopoliploidización, comúnmente trae consigo múltiples reordenamientos genómicos y silenciamiento epigenético, a fin de lograr una estabilidad genómica (Ozkan et al., 2001; Cheng y Ni, 2006; Ropiquet et al., 2008; Kemkemer et al., 2009). Los reordenamientos genómicos pueden ser evidenciados mediante técnicas de citogenética (Nash y O’Brien, 1982; Gallardo, 1992; Nie et al., 2002). Una de estas técnicas es el bandeo G, que permite identificar regiones con homología cromosómica (Nash y O’Brien, 1982; Graphodatsky et al., 2000; Thalhammer et al., 2001). Otro criterio importante 11 para la caracterización citogenética de un genoma reordenado es la distribución de la heterocromatina constitutiva, que puede ser visualizada mediante bandeo C (Jack et al., 1985; Tan et al., 2001). Así, con el propósito de determinar los reordenamientos más importantes ocurridos tras el origen de P. aureus a partir de O. mimax, se realizó bandeo G y bandeo C, para detectar diferencias entre estas especies. Adicionalmente, se realizaron tinciones con verde de metilo a fin de reconocer segmentos cromosómicos con secuencias ricas en adenina y timina, en ambas especies (AT) (Verma et al., 1995). Así, con este trabajo se espera contribuir a la elucidación de la composición genómica de P. aureus y de los reordenamientos que han ocurrido en su evolución. 12 2.1.- HIPÓTESIS DE TRABAJO H0: Pipanacoctomys aureus deriva solamente de un ancestro. De acuerdo a esta hipótesis, en el GISH se observará una distribución homogénea de la fluorescencia, sin una discriminación de dos genomas diferenciados en su patrón de fluorescencia. H1: Pipanacoctomys aureus es de origen alotetraploide, y una de sus especies ancestrales es Octomys mimax. De acuerdo a esta hipótesis en el GISH se detectará la composición mixta del genoma de P. aureus, identificándose ciertos cromosomas con fluorescencia (por su homología con la sonda) mientras otros (sin fluorescencia) se evidenciarán por contrateñido con DAPI. 13 2.2.- OBJETIVOS GENERALES Evidenciar, mediante hibridación genómica in situ (GISH), la contribución de O. mimax en el origen de P. aureus. 2.3.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realizar GISH, usando como sonda el genoma total de O. mimax marcado con fluoresceína, hibridando sobre placas metafásicas de P. aureus y como DNA bloqueador DNA genómico de sí mismo. Realizar bandeo C a fin de comparar la distribución y cantidad de heterocromatina constitutiva en P. aureus y O. mimax. Realizar bandeo G en P. aureus y O. mimax para evidenciar regiones de sintenia (segmentos cromosómicos conservados según patrones de bandeos) y reordenamientos genómicos. 14 3.- MATERIALES Y MÉTODOS 3.1.- MATERIALES 3.1.1.- MATERIAL BIOLÓGICO Los roedores utilizados en este estudio fueron capturados desde su hábitat natural; Pipanacoctomys aureus se recolectó en el Salar de Pipanaco (27° 50’ S, 66° 17’ W) en la Provincia de Catamarca, Argentina. Octomys mimax, se recolectó en el Parque Nacional de Ichigualasto (30° 05’ S, 67° 56’ W) en la Provincia de San Juan, Argentina. De ellos se utilizó el hígado, para la extracción de DNA y los pulmones, para realizar el cultivo de fibroblastos. 3.1.2.- ENZIMAS - RNAsa A (Roche) - Proteinasa K (Invitrogen) - Pepsina (Invitrogen) - Tripsina (Invitrogen) - Fragmento Klenow DNA polimerasa (Life Technologies) 3.1.3.- REACTIVOS - Agarosa (Invitrogen) - Agua desionizada estéril (Sigma) - Bromuro de etidio (Sigma) - DAPI (Sigma) - Dextrán sulfato (Sigma) 15 - DNA fago λ/HindIII ladder (Invitrogen) - Colcemid (Invitrogen) - Desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP; Life Technologies) - Estándar de DNA de 100 pb (Invitrogen) - Etanol absoluto (Riedel-de Häen) - Formaldehido (Winkler) -Fluoresceína 12-dUTP (Roche) - Medio DMEM (Invitrogen) - Medio de montaje para fluorescencia Vectashield (Vector Laboratories) - Rubber Cement (Ross) - Suero bobino fetal (Invitrogen) 3.1.4.- SOLUCIONES PREPARADAS - Buffer TAE - Buffer fosfato salino (PBS) - Solución de hipotonía (KCl 0.075M) - Solución Carnoy (metanol-ácido acético 3:1) - Buffer STE - SDS al 20% - Formaldehido al 1% en 2xSSC - Etanol al 50% y 70% - Formamida al 70% (100 μL de formamida, 3 μL de 20xSSC y 27 μL de agua) 16 - Buffer TAE (20mM de Tris-acetato, pH 8.0, 1mM de EDTA y 10mM de acetato de sodio) - Formamida al 50% en 2xSSC - 4xSSC con tween 20 al 0.1% - Solución DAPI (1μg/ml) - HCl 0.2 M - Hidróxido de bario al 5% - Giemsa al 4% en buffer fosfato (pH = 7.0) - Buffer fosfato pH 7.0 - Giemsa al 2% en buffer fosfato (pH = 6.8) - Solución McIlvaine pH 4.0 (2.94 g de ácido cítrico y 2.74 g de fosfato de sodio dibásico, disueltos en 500 mL de agua destilada) - Solución McIlvaine pH 7.0 (0.63 g de ácido cítrico, 6.19 g de fosfato de sodio dibásico, disueltos en 500 mL de agua destilada) - Solución stock de verde de metilo (1.76 g de Verde de metilo disuelto en 100 mL de solución McIlvaine pH 4.0) - Solución de trabajo de verde de metilo (1 mL de solución stock de verde de metilo en 50 ml de solución McIlvaine pH 7.0) 17 3.2.- MÉTODOS 3.2.1.- OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS DE P. aureus Y O mimax. Para la obtención de cromosomas se realizó cultivo primario de fibroblastos mediante la técnica de explante primario (Verma y Babu, 1995), a partir de tejido de pulmón, de P. aureus y O. mimax, cortado en pequeños trozos. Los cultivos fueron realizados en una estufa de cultivo con CO2 al 10% a 37ºC, en medio DMEM, y 10% de suero bovino fetal, hasta que las células alcanzaron 100% de confluencia. Se realizó una división de las células a 3 botellas en un volumen de 12 mL, para realizar la cosecha dos días después. Al momento de la cosecha se aplicó 0.01 µg/mL de colcemid y se dejó incubar por 4 horas. Luego se realizó un tratamiento con tripsina por 5 minutos a 37ºC, con el fin de desprender las células. Estas fueron centrifugadas, y el sedimento fue sometido a hipotonía (KCl 0.075M) a 37ºC por 20 minutos. Las células fueron centrifugadas, y se realizaron 3 lavados con solución Carnoy, para finalmente ser fijadas en solución de metanol-ácido acético 3:1 y almacenadas a 4ºC. Se sembraron 15 µL de la suspensión de células, previa homogenización. 3.2.2.- EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO Se realizó extracción de DNA a partir de muestras de hígado de P. aureus y O. mimax mediante el método de fenol-cloroformo, con algunas modificaciones (Sambrook et al., 1989). Se tomó una pequeña porción de tejido (100-200 mg) y bajo condiciones de esterilidad se picó con una tijera estéril en un tubo Eppendorf. Se añadió 500 μL de buffer STE frío, 10μL de 18 proteinasa K y 30μL de SDS al 20%. Se incubó por 3 horas a 55°C en un baño María. Luego se agregó 10μL de RNAsa y se dejó incubando a 37°C por 45 minutos. Se retiraron los tubos del baño y se agregó 500μL de la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Se mezcló en vortex y se centrifugó a 10.000 rpm por 5 minutos. Con una micropipeta P1000 se tomó cuidadosamente el sobrenadante hasta la interfase, y se traspasó a un tubo Eppendorf estéril de 1.5mL. Luego, para precipitar el DNA, se agregó etanol absoluto hasta alcanzar una proporción de 1:2.5. El tubo se giró horizontalmente de manera de obtener ovillos de DNA, y se dejó en freezer a -20°C por 15-30 minutos, a fin de ayudar a una mejor precipitación. Posteriormente se eliminó cuidadosamente el etanol, se realizaron dos lavados con etanol frío al 70% y se dejó secando la muestra por inversión durante 45 minutos. Finalmente el DNA se disolvió en agua estéril y se almacenó a -20°C hasta ser usado. 3.2.3.- ELECTROFORESIS Se realizó fraccionamiento electroforético en geles de agarosa al 0.8% a fin de verificar la calidad del DNA extraído. Para determinar la longitud de la sonda y de los fragmentos obtenidos para ser usados como DNA bloqueador, se realizó electroforesis en geles de agarosa al 1.5%. Se usó para esto un estándar de tamaño molecular. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 μg/ml) y visualizados bajo luz UV. 19 3.2.4.- CUANTIFICACIÓN DEL DNA GENÓMICO El DNA genómico extraído se cuantificó mediante un espectrofotómetro NanoDrop-1000 calibrado a 260 nm, para medir concentración de ácidos nucleídos. La razón de la absorbancia a 260nm/280nm, se usó para verificar la pureza del DNA. 3.2.5.- PREPARACIÓN DE LA SONDA FLUORESCENTE Un método para preparar sondas es mediante el uso de cortos cebadores con secuencias nucleotídicas al azar (random primers) y la actividad polimerizadora 5’-3’ del fragmento Klenow de la DNA polimerasa de Escherichia coli (Verma y Babu, 1995). Mediante este método se realizó marcaje del DNA genómico de O. mimax. Como el DNA genómico es marcado con mayor eficiencia si se encuentra en fragmentos de 500-1000 pares de bases, estos se obtuvieron mediante degradación mecánica con la ayuda de una micropipeta (Schwarzacher y HeslopHarrison, 2000). Posteriormente se realizó marcaje por medio de random primers, usando para ello desoxi-nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP) y fluoresceína-12-UTP. Este fluoróforo es un análogo de dTTP, que la polimerasa reconoce como tal e integra en la cadena que sintetiza (la sonda). Mediante este mismo método se preparó sonda de DNA genómico de P. aureus para los experimentos controles. 20 3.2.6.- PREPARACIÓN DEL DNA BLOQUEADOR A fin de bloquear eficientemente las secuencias altamente repetitivas, el DNA genómico de P. aureus, fue diluido con agua desionizada hasta una concentración aproximada de 1 µg/ µL. Posteriormente fue autoclavado durante 10 minutos a 121°C y 15 PSI para obtener fragmentos de aproximadamente 100-200 pb (Schwarzacher y Heslop-Harrison, 2000). Estos pequeños fragmentos hibridan con mayor facilidad con las secuencias homólogas del DNA cromosómico. El DNA bloqueador preparado a partir del genoma de O. mimax se obtuvo de la misma forma. 3.2.7.- GISH Una vez preparadas las sondas, el DNA bloqueador y las placas metafásicas sembradas, se realizó GISH. Este procedimiento puede ser dividido en tres pasos principales de tratamientos: Pre-hibridación, hibridación y lavados post-hibridación y montaje. 3.2.7.1.- PRE-HIBRIDACIÓN Las placas cromosómicas fueron sometidas a un proceso de envejecimiento químico. Este procedimiento denatura proteínas, remueve agua y el fijador, e incrementa la adherencia de las células al vidrio. Para ello a los portaobjetos se les agregó 200μL de etanol absoluto en la zona donde se encuentran las placas metafásicas. Luego se cubrió con cubre-objetos de plástico y se llevó a un termociclador, a fin de elevar la temperatura a 94°C por 10 segundos y luego bajarla a 21 15°C por 5 minutos. La muestra debe ser cubierta con un papel empapado con etanol al 96% durante este proceso. Luego se retira el cubre-objetos plástico y se deja secar a temperatura ambiente (Henegariu et al., 2001). Posteriormente, las placas se llevaron a un baño con ácido clorhidrico 10 mM durante 5 minutos. Luego se colocaron en un termociclador, se agregó un par de gotas de solución pepsina a la muestra (5mg/μL). Ésta fue cubierta con un cubre-objetos de plástico y se dejó por 1 minuto a 37°C. Se lavó con agua destilada por 1 minuto. Se colocaron las placas en un coplin con formaldehido al 1% y se realizaron dos lavados con 2xSSC por 5 minutos. Posteriormente las placas se pasaron por una batería de etanol al 50%, 70% y 100%, tres minutos en cada uno. A continuación las placas fueron sometidas a la acción de la formamida al 70% en 2xSSC, seguida de tres lavados en 2xSSC por 5 minutos. Finalmente se realizó deshidratación final en la batería de etanol de 50%, 70% y 100%, por tres minutos en cada una (Traut et al., 1999). 3.2.7.2.- HIBRIDACIÓN La sonda fluorescente se preparó en un “cocktail” de hibridación antes de aplicarla sobre las placas metafásicas. Esta mezcla de hibridación está constituida por: 100 ng de la sonda fluorescente, 50% v/v de formamida desionizada, 20xSSC, 10% de dextrán sulfato y 2,5 μg de DNA bloqueador. La sonda debe ser expuesta lo menos posible a la luz, ya que una exposición prolongada puede producir una pérdida total de la emisión de fluorescencia. La solución se llevó a un volumen final de 30 μL, diluyendo con agua pura. Se realizaron ensayos con distinta proporción de sonda-bloqueador (desde 1:5 hasta 1:50), de manera tal que se pueda discriminar 22 los distintos componentes genómicos en las placas de P. aureus. La proporción 1:25 produjo los mejores resultados (Zhang et al., 2004). La sonda en la mezcla de hibridación fue denaturada a 86°C por 6 minutos en un termociclador. Luego fue puesta rápidamente en hielo por 5 minutos, para luego aplicarla sobre los cromosomas. Se cubrió con un cubre-objetos plásticos y se selló por los bordes con “Rubber cement”. La hibridación se llevó a cabo en una cámara húmeda a 37°C, por tres días, en oscuridad. Como ensayos de control se realizó GISH sobre placas metafásicas de P. aureus utilizando sonda de DNA genómico de sí mismo, sin utilizar DNA bloqueador. Además se realizó GISH sobre placas metafásicas de O. mimax, utilizando sonda de P. aureus y bloqueando con DNA genómico de O. mimax (también en proporción de sonda y DNA bloqueador 1:25). 3.2.7.3.- LAVADOS POST-HIBRIDACIÓN Y MONTAJE Los cubre-objetos plásticos se retiraron cuidadosamente y se realizó un lavado en formamida al 50% en 2xSSC, seguido de un lavado en 2xSSC, ambos a 37°C por 3 minutos. Luego se realizaron tres lavados de 5 minutos cada uno en 4xSSC con Tween 20 al 0.1% (Zhang, 2004). Se realizó contratinción con DAPI, sustancia que se une al DNA emitiendo fluorescencia con un máximo de intensidad a los 488 nm. Para ello, se aplicaron 30 μL de la solución de DAPI (1μg/ml) directamente sobre los cromosomas y se cubrió con cubreobjetos plásticos durante 1 minuto. Se lavó en agua destilada por 1 minuto. Las placas fueron montadas con 25 μL de 23 Vectashield, aplicado directamente sobre las placas y se cubrió con un cubre-objetos de vidrio, cuidando de no dejar burbujas de aire. 3.2.7.4.- ANÁLISIS MICROSCÓPICO Y PROCESAMIENTO DE IMÁGENES Las placas se analizaron en un microscopio de epifluorescencia Zeiss AxioLAB HBO 50/AC con filtros específicos para los fluoróforos utilizados (DAPI y fluoresceína). El microscopio está equipado con una cámara AxioCAM MRc, acoplada a un computador. Las imágenes se obtuvieron mediante el software MRGrab 1.0 y fueron trabajadas digitalmente mediante Photoshop CS3, de manera homogénea para regular los brillos y contrastes. Las imágenes tomadas de forma independiente con cada filtro se sobrepusieron. Se realizaron gráficos de intensidad de fluorescencia mediante el software Image J 1.40g, para evaluar la intensidad de fluorescencia en los cromosomas que presentaban ambigüedad en la homología con la sonda. 24 Figura 2. Esquema de la hibridación genómica in situ. El DNA extraído de O. mimax fue marcado con fluoresceína y es utilizado como sonda, mientras que el DNA extraído de P. aureus se utilizó como DNA bloqueador. La solución de hibridación se preparó en proporción 1:25 de sonda-bloqueador y se hibridó sobre las placas metafásicas de P. aureus. 25 3.2.8.- BANDEO C El bandeo C de las placas metafásicas de P. aureus y O. mimax se realizó de acuerdo al protocolo de Verma y Babu (1995) con algunas modificaciones. Para ello los portaobjetos fueron sometidos a envejecimiento de la misma manera que en el numeral 3.7.2.1. Se trataron en HCl 0.2M por 15 minutos a temperatura ambiente. Se lavó con agua destilada y se dejó secar. Los porta-objetos se colocaron en una solución de Hidróxido de Bario al 5% a 46° C durante 4 minutos. Se lavó en varios cambios de agua destilada. Luego los portaobjetos fueron incubados en 2xSSC a 60°C por 3 horas. Se lavó con agua destilada y se tiñó con solución de Giemsa al 4% en buffer fosfato (pH = 7.0) durante 15 minutos. Las placas fueron montadas de la misma forma a la descrita en el numeral 3.2.7.3 y fotografiadas en un microscopio óptico. Las imágenes fueron convertidas a blanco y negro, y se ajustó el brillo y el contraste mediante Photoshop CS3. Los cromosomas se ordenaron en un cariotipo de acuerdo a su tamaño, posición del centrómero y homología de bandas. 3.2.9.- BANDEO G CON TRIPSINA USANDO GIEMSA (GTG) Se realizaron análisis de bandeo G a fin de comparar los cariotipos de P. aureus y O. mimax, según los patrones de bandas observados en ambas especies. Pudiendo establecer homologías de bandeos en cromosomas o segmentos de estos entre ambas especies. No existe una hipótesis clara para explicar el mecanismo que da origen a las bandas G. Sin embargo numerosos estudios indican que los cromosomas expuestos a tripsinización, y álcalis 26 a altas temperaturas producen una pérdida de su estructura cilíndrica y un “colapso” (Sahin et al., 1999). De esta forma existiría una correlación entre la estructura cromosómica y los patrones de bandeo. Se realizó bandeo G con tripsina, tiñendo con Giemsa (GTG) las placas de P. aureus y O. mimax, según el protocolo de Verma y Babu (1995) con algunas modificaciones. Para ello se trataron los portaobjetos con 2xSSC a 60°C por 10 minutos. Luego se incubaron en solución de tripsina (0.02 mg/ml) disuelta en buffer fosfato (pH = 7.0) por 5 minutos a temperatura ambiente. Se lavó en buffer fosfato (pH = 7.0) y se tiñó con Giemsa al 2% en buffer fosfato (pH = 6.8) durante 5 minutos. Luego se procedió al montaje, obtención de imágenes y cariotipificación de la misma forma que en el numeral anterior. 3.2.10.- TINCIÓN CON VERDE DE METILO/DAPI Se realizó tinción con verde de metilo/DAPI sobre las placas de P. aureus y O. mimax según el protocolo de Verma y Babu (1995), a fin de detectar segmentos cromosómicos ricos en secuencias con adenina y timina (AT). Para ello las placas se tiñeron durante 30 minutos en solución de trabajo de verde de metilo, a temperatura ambiente. Se realizaron lavados en dos cambios de solución McIlvaine (pH = 7.0) y se dejaron secar. Luego, con la menor luminosidad posible, se aplicaron 30 μL de la solución de DAPI (1μg/ml), se cubrió con un cubreobjetos plástico y se dejó teñir durante 10 minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. Se lavó con agua destilada, se montó y analizó al microscopio de epifluorescencia con el filtro para DAPI de 27 la misma forma que en el numeral 3.2.7.4. Las imágenes capturadas fueron trabajadas y los cariotipos organizados de la misma manera que el numeral 3.2.8. 4.- RESULTADOS 4.1.- CUANTIFICACIÓN Y CALIDAD DEL DNA GENÓMICO A fin de verificar la calidad del DNA genómico extraído se realizó una electroforesis en agarosa al 1.5%. Una gruesa banda de alto tamaño molecular en el gel, refleja un DNA en buen estado. El DNA utilizado se observa en la figura 3 en los carriles 2 (P. aureus) y 3 (O. mimax). Una concentración adecuada de DNA para nuestro trabajo debe ser mayor a 1000 ng/μL, y un valor de pureza óptimo, mayor a 1.8. Los valores de concentración de DNA que se utilizó fueron 1257.55 ng/μl y 1652.22 ng/μl para O. mimax y P. aureus, respectivamente. Los índices de pureza del DNA extraído fue 1.81 y 1.88 para O. mimax y P. aureus respectivamente. 28 Figura 3. Electroforesis del DNA genómico extraído de P. aureus (carril 2) y O. mimax (carril 3). El carril 1 representa el estándar de tamaño molecular, que corresponde al DNA del fago λ digerido con Hind III. El tamaño aparece indicado al costado izquierdo de cada banda. 4.2.- ELECTROFORESIS DE LA SONDA Y DNA BLOQUEADOR Los tamaños aproximados de la sonda (Figura 4) y del DNA bloqueador (Figura 5) obtenidos por comparación con el estándar de tamaño molecular (ladder de 100 pb), fluctuaron entre 50-80 pb para la sonda y entre 80-200 pb para el DNA bloqueador, respectivamente. 29 Figura 4. Gel de electroforesis de la sonda de DNA genómico de O. mimax (carril 2). En el carril 1 aparece el estándar de tamaño molecular 100 pb. 30 Figura 5. Gel de electroforesis del DNA bloqueador de P. aureus (carril 2). En el carril 1 aparece el estándar de tamaño molecular 100 pb. 4.3.- GISH Los experimentos de GISH permitieron diferenciar dos genomas dentro del cariotipo de P. aureus, se visualizan como cromosomas (o segmentos de estos) en verde o en azul (Figura 6 a). La sonda de DNA genómico de O. mimax reconoce alrededor de 20 cromosomas completos en el genoma de P. aureus (Figura 6 b arriba). Aproximadamente 14 cromosomas de P. aureus presentan mayor homología con su propio DNA (Figura 6 b centro). Se reconocen además, cerca de 58 cromosomas que presentan homología mixta. Esto significa que existe reconocimiento parcial de estos cromosomas por la sonda (Figura 6 b abajo). Los gráficos de intensidad de 31 fluorescencia (Image J 1.40g) permitieron discriminar ciertos cromosomas cuyo patrón cromático es ambigüo (Figura 6 c). Los experimentos control del GISH sobre placas de P. aureus, con sonda de DNA genómico total de sí mismo (sin DNA bloqueador), muestran señales muy intensas en regiones centroméricas y teloméricas principalmente (Figura 7 a). Además, al realizar GISH sobre placas metafásicas de O. mimax, utilizando sonda de P. aureus y bloqueando con DNA genómico de O. mimax (en proporción 1:25 entre sonda-DNA bloqueador), se observa la distribución homogénea de la fluorescencia sobre los cromosomas (Figura 7 b). 32 Figura 6. a. GISH sobre placas metafásicas de P. aureus utilizando sonda de DNA genómico de O. mimax. El bloqueador consiste de DNA genómico de P. aureus. b. Cromosomas de P. aureus con homología completa con la sonda de O. mimax (arriba), homología con su propio DNA (centro) y homología mixta (abajo). c. Ejemplos de algunos gráficos de intensidad de fluorescencia para algunos cromosomas. 33 Figura 7. Experimentos control de GISH. a.- Placa metafásica de P. aureus utilizando sonda de DNA genómico de sí mismo sin DNA bloqueador. b.- Placa metafásica de O. mimax utilizando sonda genómica de P. aureus y DNA bloqueador de O. mimax. 4.4.- CARIOTIPOS DE P. aureus Y O. mimax MEDIANTE BANDEO C El cariotipo de P.aureus se caracteriza por la presencia de bloques heterocromáticos en todos sus cromosomas a excepción del Y (Figura 8). El patrón de bandeo C muestra gran cantidad de señales heterocromáticas, muchos cromosomas presentan una banda centromérica y otra telomérica (pares 2, 5, 6, 8, 9, 10, 23, 24, 26, 28, 32, 34 y 38). Algunos cromosomas aparecen completamente heterocromáticos (pares 18, 19, 20, 21). El resto de los cromosomas presenta solo un bloque C positivo en la región centromérica. 34 A diferencia de lo observado en P. aureus, en O. mimax existen tres pares autosómicos sin bandas C o prácticamente inexistentes (pares 1, 10 y 16). El par sexual aparece completamente heterocromático, al igual que los pares 2, 18 y 27. La mayoría de los cromosomas solo presentan un bloque C positivo, (pares 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 20, 22, 23, 24, 25 y 26; Figura 9). 35 Figura 8. Bandeo C de P. aureus. Notese la presencia de bandas de heterocromatina constitutiva en todos los pares cromosómicos, a excepción del Y. Se aprecia además, bandas teloméricas en varios pares cromosómicos (ver texto). 36 Figura 9. Bandeo C de O. mimax. Nótese el cromosoma Y, el cual aparece completamente heterocromático, mientras que los pares 1, 10 y 16 prácticamente no muestran tinción. 4.5.- CARIOTIPOS DE P. aureus Y O. mimax MEDIANTE BANDEO G El patrón de bandeo G permitió reconocer bandas claras y oscuras en los cromosomas de P aureus y O. mimax. De esta forma se organizaron los cromosomas según su homología de bandas (Figuras 10 y 11 respectivamente). Esto permitió además reconocer patrones de bandas conservadas en determinados segmentos de los cromosomas 2, 4, 5, 6, 8, 20 y 23 de O. mimax y 33, 19, 36, 45, 5, 2, y 8 de P. aureus respectivamente (Figura 12 a). Se aprecia también, 37 conservación completa de los patrones de bandeo en los cromosomas 9, 10 y X de O. mimax y 34, 35 y X de P. aureus (Figura 12 b). Figura 10. Bandeo G de P. aureus. Los cromosomas sexuales son identificados por su morfología y patrón de bandas sin homología entre ellos. 38 Figura 11. Bandeo G de O. mimax. Los cromosomas sexuales son identificados por su morfología y bandeo sin homología. 39 Figura 12. Patrones de homología de bandas (indicado con flechas negras) entre O. mimax (izquierda, señalado como m) y P. aureus (derecha, señalado como a). a.- Segmentos cromosómicos conservados. b.- Cromosomas de ambas especies con homología total de bandas. 40 4.6.- CARIOTIPOS DE P. aureus Y O. mimax MEDIANTE TINCIÓN CON VERDE DE METILO/DAPI La tinción con verde de metilo en P. aureus permitió evidenciar alrededor de 34 cromosomas completos teñidos intensamente (pares 5, 6, 8, 9, 13,15, 16, 21,23, 25, 28, 29, 32, 36 y 41). Los pares 17 y 34 presentaban sus brazos largos fuertemente teñidos, pero no su brazo corto. El cromosoma X muestra el brazo corto completo rico en bases AT y una banda en el brazo largo (Figura 13). En O. mimax se observaron alrededor de 14 cromosomas completos teñidos fuertemente (pares 1, 3, 6, 9, 11, 14 y 17). Los pares 5 y 21 muestran un segmento rico en AT en sus brazos cortos (Figura 14). 41 Figura 13. Tinción con verde de metilo de P. aureus. Los segmentos oscuros en los cromosomas indican bloques con alto contenido de adenina y timina (AT). Los segmentos más claros indican regiones con escaso contenido en AT. 42 Figura 14. Tinción con Verde de metilo de O. mimax. Los segmentos cromosómicos oscuros indican bloques con alto contenido de adenina y timina (AT). Los segmentos más claros indican regiones con escaso contenido en AT. 43 5.- DISCUSIÓN Los resultados de este trabajo respaldan la hipótesis de que P. aureus es alopoliploide, ya que se pudo discriminar dos componentes genómicos en su cariotipo. En los experimentos de GISH se observan 20 cromosomas de P. aureus con homología completa con el genoma de O. mimax. Otros, 14 cromosomas, presentan mayor homología con su propio DNA, por lo que corresponderían a los cromosomas provenientes del otro taxón parental. A su vez, se observan 58 cromosomas con homología mixta, que evidencian reordenamientos cromosómicos. Este fenómeno es muy común en organismos que experimentan alopoliploidía o hibridación interespecífica (Ropiquet et al., 2008; Lim et al., 2008). Al respecto, se ha sugerido que la recombinación intergenómica entre cromosomas homeólogos es un mecanismo de mantenimiento de la estabilidad genómica en las etapas tempranas de la formación de un poliploide (Chen y Ni, 2006). Los experimentos control apoyan también los resultados anteriores. Se demuestra que el genoma de O. mimax está totalmente contenido en el de P. aureus. Al realizar el experimento inverso, esto es, usando sonda fluorescente del genoma de P. aureus y bloqueo de O. mimax, esta vez, sobre placas metafásicas de O. mimax (Figura 7b), se observa una distribución homogénea de la fluorescencia emitida por la sonda genómica. Además, al no usar DNA bloqueador, se intensifican las señales principalmente centroméricas y teloméricas, (Figura 7a). Estas señales han sido reconocidas como altamente repetitivas, según lo indican experimentos de autoGISH. Esta técnica de hibridación genómica usa como sonda el DNA genómico de la misma especie cuyas placas se analizan, y sin bloquear con DNA no marcado (Dávila et al., 2009; Pita et al., 2003; Pita et al., 2008). Investigaciones previas han logrado identificar la composición 44 mixta de genomas poliploides mediante experimentos de GISH. Por ejemplo, en las especies poliploides de Tragopogon (Lim et al., 2008), Thinopyrum intermedium (Han et al., 2004), Iris versicolor (Lim et al., 2007) Lilium rubellum (Lim et al., 2000), Zingeria trichopoda (Kotseruba et al., 2003), entre otras. Los resultados obtenidos mediante bandeo C muestran, en general, un incremento en la proporción y distribución de heterocromatina de P. aureus en relación a O mimax. En P. aureus todos los cromosomas (a excepción del Y) presentan al menos un segmento C positivo, a diferencia de O. mimax, que presenta algunos cromosomas sin bloques heterocromáticos. Estas diferencias en el contenido de la heterocromatina es evidencia de reestructuración de regiones hipermetiladas, como respuesta epigenética a la formación de los organismos poliploides. La evolución de la heterocromatina por medio de heterocromatización de eucromatina ha sido documentada en ranas (King, 1980) y en roedores (Gallardo, 1991). Además se observa distinta distribución de las bandas C entre los cromosomas de ambas especies. En O. mimax las bandas C están localizadas principalmente en regiones centroméricas, mientras que en P. aureus, existen además una gran cantidad de cromosomas con segmentos de heterocromatina teloméricos. Estos cambios en la distribución de la heterocromatina corroboran los reordenamientos genómicos detectados por el GISH. Los análisis de bandeo G muestran segmentos cromosómicos conservados entre P. aureus y O. mimax (Figura 12), apoyando la alta reorganización estructural del genoma alopoliploide de P. aureus, observado mediante GISH. Se evidencian además cromosomas completos con patrones de bandas G similares, como es el caso del cromosoma X. Estos patrones de bandas podrían corroborarse por técnicas moleculares, más que estructurales, como lo es el bandeo G 45 (Sahin et al., 1999). Una de estas técnicas es el “chromosome painting”, en la cual se procede de la misma forma que un experimento de FISH, pero utilizando como sonda, el DNA de un cromosoma aislado, marcado con algún fluoróforo (Schubert et al., 2001; Sharma y Sharma, 2001; Rambau y Robinson, 2003). Los análisis con verde de metilo señalaron la existencia de 34 cromosomas completos, intensamente teñidos, y por lo tanto, con abundancia en secuencias AT, en P. aureus (Figura 13), mientras que en O. mimax se observaron 14 cromosomas con estas características (Figura 14). Es sabido que en poliploides hay un incremento en el DNA repetitivo debido a múltiples factores (Cheng y Ni, 2006). Entre ellos la activación de transposones y elementos móviles ha sido un factor determinante en el incremento de estas secuencias en Tragopogon (Soltis et al., 2004). Teniendo en consideración los números cromosómicos y la distribución de las regiones con abundancia en AT detectadas, no se puede inferir si el mayor número de elementos ricos en estas secuencias encontrados en P. aureus, en relación a O. mimax, es solamente proporcional al número cromosómico de ambas especies, o por un mecanismo por el cual se incrementa el contenido de secuencias repetitivas. Es importante destacar, que no existe una homología de bandeo entre las regiones ricas en AT detectadas con la tinción con verde de metilo y las secuencias altamente repetitivas detectadas en el experimento de control de GISH (Figura 7 a). Esta discordancia entre ambas técnicas puede deberse a que las secuencias altamente repetitivas detectadas mediante el control de GISH no son necesariamente ricas en las bases AT. De esta forma, la tinción con verde de metilo en P. aureus y O. mimax, solamente permite una comparación cariotípica entre ambas especies. 46 Luego de formados, los poliploides sufren una serie de modificaciones en su genoma, a fin de lograr una diploidización funcional (Wendel, 2000; Wolfe, 2001), incluyéndose los reordenamientos cromosómicos evidenciados en los experimentos de GISH como cromosomas con homología mixta. Otro fenómeno que comúnmente ocurre en alopoliploides e híbridos es conocido como dominancia nucleolar. Este fenómeno resulta del silenciamiento selectivo de genes que codifican para rRNA proveniente de uno de los genomas parentales (Lawrence et al., 2004). Además existe una reprogramación de la expresión de genes ortólogos a través de mecanismos epigenéticos, como la hipermetilación de citosinas del DNA y modificaciones covalentes de histonas (Cheng, 2007). La hipermetilación es común en regiones heterocromáticas (Liu y Wendel, 2003). Los análisis filogenéticos muestran una proximidad entre ambas especies poliploides (P. aureus y T. barrerae) y O. mimax (Gallardo et al., 2004). Esto, en conjunto con la similitud de patrones de hibridación intergenómica en análisis de southern blot y la formación exclusiva de bivalentes en las meiosis en las tres especies (Gallardo et al., 2004), han llevado a proponer un modelo mediante el cual se dio origen a la poliploidía en estos octodóntidos (Figura 1). Según este modelo, el genoma duplicado de P. aureus tuvo su origen alopoliploide, por la hibridación entre dos linajes ancestrales de Octomys, con producción de gametos no reducidos. Por otro lado, para explicar el origen de T. barrerae, se ha asumido una hibridación interespecífica entre el linaje de Pipanacoctomys, produciendo gametos haploides, y el linaje de Octomys, que habría producido gametos no reducidos. De esta forma se obtiene el número cromosómico de 102 para T. barrerae (Gallardo et al., 2007). Nuestros resultados apoyan este modelo, al demostrar que el 47 genoma de O. mimax está contenido totalmente, en el genoma de P. aureus, aunque altamente reorganizado. El origen poliploide T. barrerae ha sido un tema de controversia (Svartman et al., 2005), desde el particular descubrimiento de su elevado número cromosómico en su complemento diploide y sus células germinales de gran tamaño, como efecto de su alto contenido de DNA en sus núcleos (Gallardo et al., 1999; Gallardo, 2002; Gallardo et al., 2004). Sin embargo las evidencias continúan respaldando este hecho (Gallardo et al., 2006; Gallardo et al., 2007; Bacquet et al., 2008). Se han documentado algunas ventajas selectivas que trae consigo la poliploidía en los organismos que la adquieren. Un ejemplo claro de estas ventajas es la heterosis o vigor híbrido, que poseen los poliploides en relación a sus progenitores diploides. La redundancia génica también confiere una ventaja en los organismos poliploides, en la medida que alelos silvestres pueden enmascarar a alelos deletéreos. También, existen ejemplos en algunas plantas, donde la adquisición de genomas poliploides ha permitido la reproducción asexual, por medio de la disrupción del sistema de auto-incompatibilidad (Soltis y Soltis, 2000; Comai, 2005). Otra ventaja que trae consigo la duplicación genómica, es su contribución a la eficacia biológica (DeLuna et al., 2008), tal vez como consecuencia de funciones traslapantes de genes parálogos. Esta disposición ha otorgado plasticidad adaptativa a las poblaciones, frente a cambios ambientales (Ainouche et al., 2004; DeLuna et al., 2008). Esta plasticidad habría contribuido a la amplia radiación adaptativa de los organismos poliploides, colonizando nuevos nichos, donde los progenitores no podrían residir (Barrier, 1999; Doyle, 1999; Seehausen, 2004). 48 Existe, sin embargo evidencia documentada y teórica de algunas desventajas que trae consigo la poliploidía. Por ejemplo, la tendencia en mitosis y meiosis a producir espontáneamente células aneuploides. Existe además, un cambio en las relaciones tri y bidimensionales de los componentes celulares, ocasionado por el aumento del tamaño del genoma, y por ende del núcleo y la célula. Estos cambios podrían afectar negativamente en ciertas interacciones existentes entre cromatina y superficie nuclear (Comai, 2005). La poliploidía es considerada como un mecanismo común de especiación simpátrica en plantas, mientras que en animales se ha asociado a una menor frecuencia de eventos de hibridación (Otto y Whitton, 2000). En animales, la poliploidía está restringida a ciertos grupos como invertebrados, peces, reptiles y anfibios (Otto y Whitton 2000; David et al., 2003; Evans, 2007; Liu et al., 2007; Lou et al., 2007). Entonces, podemos preguntarnos ¿Por qué la poliploidía es tan rara, o prácticamente imposible en otros grupos de animales como los mamíferos y aves? Y la respuesta más plausible involucra a los cromosomas sexuales. De acuerdo a Orr (1990), la rareza de la poliploidía en animales con cromosomas sexuales degenerados (Y o Z), se debe a una disrupción en el mecanismo de compensación de dosis necesaria para mantener el balance genético entre machos y hembras, para los genes funcionales ligados al sexo. Se ha visto que en algunas especies de anfibios poliploides, los cromosomas sexuales están en etapas iniciales de diferenciación, existiendo una mayor flexibilidad en la determinación del sexo. Esto permitiría la poliploidía sin disrupción sexual en dichos organismos (Mable, 2004). Las ideas propuestas por Susumu Ohno en 1968, sobre la trascendental importancia que tuvieron las duplicaciones génicas en las etapas iniciales de la evolución de los vertebrados, han sido corroboradas por un sinnúmero de estudios posteriores (Soltis y Soltis, 1999; Wolf, 2001; 49 Zhang, 2003; Otto, 2007). A consecuencia de las controvertidas ideas de Ohno, se ha producido un incremento exponencial en el número de publicaciones relacionadas con duplicaciones génicas o genómicas en la literatura científica desde los años 70 a la actualidad (Meyer y Van der Peer, 2003). Para Ohno, una duplicación génica puede surgir como consecuencia de un intercambio desigual entre cromátidas hermanas, crossing-over desigual entre cromosomas homólogos durante la meiosis, duplicación regional redundante en las moléculas de DNA y poliploidización. Él considera además que las duplicaciones genómicas fueron un requerimiento casi obligatorio en la evolución de los vertebrados y en la aparición de novedades evolutivas. Las duplicaciones genómicas han sido fundamentales para explicar la complejidad morfológica y el incremento en el tamaño genómico de los vertebrados, en relación a invertebrados, lo que ha servido de base para la hipótesis 2R (Robinson-Rechavi et al., 2004). Esta hipótesis propone que los vertebrados surgen como resultado de dos rondas de duplicación genómica, ocurridas antes y después de la diversificación de los peces sin mandíbulas o Agnatos, considerados los primeros vertebrados (Robinson-Rechavi et al., 2004; Panopoulou y Poustka, 2005). Esto ha sido respaldado por duplicaciones en algunas familias génicas, como los complejos Hox, que son evidencia de duplicaciones genómicas desde invertebrados a vertebrados (Dehal y Boore, 2005). Los genes Hox se caracterizan por la posesión de una secuencia “homeobox” de 180 nucleótidos, altamente conservada (Furlong y Holland, 2004), y codifican factores de transcripción asociados con la especificación del plan corporal y ejes axiales. Están altamente organizados en conglomerados con conservación del orden de genes, distancias intergénicas y secuencias no codificantes asociadas (Duboule, 2007). El incremento en la complejidad de los planes corporales que ha acompañado a la evolución de los vertebrados está 50 asociada a la duplicación de estos complejos génicos (Crow et al., 2006). Se ha detectado solo un clúster Hox se ha encontrado en amphioxus (el invertebrado más cercano filogenéticamente a los vertebrados), mientras que se han identificado cuatro en mamíferos (Panopoulou y Poustka, 2005). Respecto de los peces, se ha encontrado evidencia de una ronda de duplicación genómica adicional posterior a la divergencia de los telósteos. Esto se conoce como la hipótesis 3R, por las tres rondas de duplicación genómica ocurridas (Meyer y Van der Peer, 2005). Las duplicaciones genómicas han sido y continúan siendo una importante fuerza evolutiva y uno de los principales mecanismos de especiación y diversificación en plantas (Soltis et al., 2003, 2009; Rieseberg, 2007). Muchos estudios han demostrado múltiples rondas de poliploidización durante la evolución de angiospermas (Adams y Wendel, 2005; De Bodt et al., 2005;) y se ha determinado además, que cerca del 80% de helechos y angiospermas son poliploides (Soltis et al., 2003). Incluso plantas con genomas pequeños como Arabidopsis thaliana, son poliploides, al igual que muchas especies cultivables como maíz, tomates, papas, soya, café, tabaco y algodón (Otto y Whitton, 2000; Wendel y Cronn, 2003; Adams y Wendel, 2005). Así, basándose en la recopilación de datos anteriormente publicados y tomando en consideración, es evidente la importancia evolutiva que han tenido las duplicaciones génicas y genómicas en el aumento del contenido de DNA y en la complejización de las vías regulatorias que definen la morfología de los organismos. 51 6.- CONCLUSIONES Los análisis de GISH muestran que el genoma de Pipanacoctomys aureus tiene una composición mixta. En estos experimentos se reconocieron en el cariotipo de P. aureus, cerca de 20 cromosomas pertenecientes a Octomys mimax, uno de los ancestros propuestos. Se identificaron además 14 cromosomas provenientes de otro ancestro, desconocido hasta el momento. Además se identificaron cerca de 58 cromosomas con homología mixta, que son un indicio de recombinación intergenómica. Los análisis de bandeo confirman también, una alta tasa de reordenamientos en P. aureus. Esta reestructuración genómica es común en organismos híbridos o alopoliploides, como mecanismo de estabilización genómica y de otorgar viabilidad a la especie. Estos resultados apoyan el modelo de Gallardo (2007), el cual explica el origen de P. aureus mediante un evento de hibridación interespecífica. 52 7.- BIBLIOGRAFÍA Adams A. and Wendel J. (2005). Polyploidy and genome evolution in plants. Current Opinion in Plant Biology, 8: 135–141. Ainouche M., Baumel A. and Salmon A. (2004). Spartina anglica C. E. 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