Pruebas básicas de Coagulación
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Pruebas básicas de Coagulación Departamento de Hemostasia y Trombosis. IIHEMA Academia Nacional de Medicina Vía Intrínseca de la coagulación Bioq. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis IIHEMA Academia Nacional de Medicina VIA INTRÍNSECA DE LA COAGULACION PK XII XIIa QAPM XI XIa Ca2+ IX IXa VIIIa FL Ca2+ X Xa Va FL Ca2+ FT VIIa Ca2+ II IIa Fibrinógeno M. Fibrina IIHEMA XIIIa Fibrina ¿QUÉ PRUEBAS EVALÚAN LA VIA INTRÍNSECA DE LA COAGULACION? IIHEMA XII FC VIA INTRINSECA XIIa XI Activador + FL IX APTT KCT SCT XIa Ca2+ IXa VIIIa FL Ca2+ X Xa Va FL Ca2+ II IIa Fibrinógeno Fibrina APTT o KPTT • Prueba de elección para la evaluación de la vía intrínseca IIHEMA APTT ¿CUALES SON LOS COMPONENTES Y/O REACTIVOS NECESARIOS PARA REALIZAR LA DETERMINACIÓN? IIHEMA Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada • Fosfolípidos de distinto origen y concentración • Activador (Kaolín, Ac. Elágico, Sílice) • Cloruro de calcio 0,025 M IIHEMA APTT ¿Qué sensibilidad debería poseer el reactivo de elección ? IIHEMA APTT 9 Déficit de factores de la vía 9 Presencia de heparina 9 Inhibidores de la vía IIHEMA ¿ DE QUÉ VARIABLES VA A DEPENDER LA SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA? IIHEMA APTT Sensibilidad Activador Naturaleza y concentración de FL IIHEMA ¿ CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA ? IIHEMA APTT o KPTT • • 100 µl plasma paciente 100 µl cefalina + activador 2 minutos 37 ºC •100 µl cloruro de calcio 0,025M •V.N.: 37-48 segundos IIHEMA ¿ES IMPORTANTE RESPETAR EL TIEMPO DE INCUBACIÓN? IIHEMA VIA EXTRINSECA VIA INTRINSECA XIIa QAPM PK XI FASE DE CONTACTO VIIa FT PL Ca 2+ XIa IXa IX VIIIa PL Ca 2+ II fibrinógeno Xa Va PL Ca 2+ X IIa fibrina XIIIa Fibrina insoluble IIHEMA X ¿ EN QUÉ SITUACIONES PENSARIAMOS AL OBTENER UN APTT PROLONGADO ? IIHEMA APTT prolongado • Déficit de factores : VIII, IX, XI, XII, QAPM, PK • Pacientes bajo tratamiento anticoagulante oral • Fibrinógeno < 100 mg/dl IIHEMA APTT prolongado • Heparina no fraccionada • Inhibidores • P. Politransfundido ↓ VIII, V IIHEMA APTT prolongado • Déficit de vitamina K • Hepatopatías • CID IIHEMA ANTE UN APTT PROLONGADO, ¿ QUÉ PRUEBA DEBEMOS REALIZAR ? IIHEMA Corrección con plasma normal ( relación 1:1) IIHEMA APTT prolongado APTT mezcla plasma del paciente con plasma normal (1:1) Corrige Déficit de factores No corrige o prolonga Inhibidor IIHEMA APTT Corregir con plasma normal (1:1) Indice de Rosner APTT (P+N) – APTT N APTT P > Valor de corte (0,1)⇒ No Corrige ≤ Valor de corte ⇒ Corrige IIHEMA APTT P = 80 seg 46 seg Corrige P+N N = 40 seg 55 seg No Corrige APTT (P+N) – APTT N APTT P = 0,10 Valor de corte ¿ QUÉ HACER SI TENEMOS UN APTT PROLONGADO, QUE CORRIGE Y FACTORES VIII, IX, XI, XII NORMALES ? IIHEMA APTT c/incubación prolongada (10 min. a 37°C) Corrige Posible déficit Precalicreínas IIHEMA ¿ CÓMO REALIZAMOS LA DETERMINACIÓN DE LOS FACTORES DE LA VÍA ? IIHEMA Determinación de factores • Modificación del APTT • Reactivos: - fosfolípidos de distinto origen y concentración - activador - cloruro de calcio 0,025 M - plasma deficiente en factor a estudiar, (diluido ?) IIHEMA Determinación de factores • Muestra: plasma diluido 1/5, 1/10, 1/20 • Curva del factor : -diluciones del estándar: 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 • Diluyente Fluido II (buffer Owren modificado, pH 7,35) IIHEMA Determinación de factores • • • 50 µl dilución paciente 50 µl dilución plasma deficiente 50 µl cefalina + activador 2 minutos 37 ºC • 50 µl cloruro de calcio 0,025M IIHEMA Determinación de factores • V.N.: 50%-150% • Valores : 9déficit del factor 9 inhibidor IIHEMA Determinación de factores Tiempo (seg) inhibidor específico o déficit normal Factor (U/dl) IIHEMA DEFICIENCIA DE FACTORES DEFICIENCIA Fibrinógeno Factor II Factor V Factor VII Factor VIII Factor IX Factor XI Factor XIII INCIDENCIA 1:1 millón 1:2 millones 1:1 millón 1:500.000 1:10.000 1:60.000 1:100.000 1:2 millones HERENCIA AR AR AR AR XLR XLR AR AR IIHEMA Vía final o común Bioq. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis IIHEMA Academia Nacional de Medicina VIA EXTRINSECA VIA INTRINSECA XIIa HMK PK XIa XI IX IXa VIIIa PL Ca 2+ VIIa FT PL Ca 2+ Xa Va PL Ca 2+ X II fibrinógeno X IIa fibrina XIIIa Fibrina insoluble IIHEMA ¿ QUÉ PRUEBAS PODEMOS UTILIZAR PARA EVALUAR ESTA VÍA ? IIHEMA Tiempo de Trombina (TT) Fibrinógeno (I) IIHEMA Tiempo de Trombina (TT) Tiempo de Trombina • Mide el tiempo de coagulación del plasma en presencia de trombina. • Evalúa la transformación de fibrinógeno a fibrina, pero excluye la participación del factor XIII. IIHEMA Tiempo de Trombina • Reactivo: - solución de trombina de 10 unidades/ml • Muestra: - plasma citratado IIHEMA ¿ CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA ? IIHEMA Tiempo de Trombina • 100 µl de plasma 30 segundos 37ºC 100 µl de trombina • Se debe informar su valor en relación con el normal del día. - valores normales entre 16-22 segundos. IIHEMA ¿ EN QUÉ SITUACIONES TENDRÍAMOS UN TT PROLONGADO ? IIHEMA T T prolongado •Fibrinógeno disminuido (<100mg%) •Fibrinógeno anómalo •Heparina •PDF-DD •Paraproteínas •Heparinoides IIHEMA T. TROMBINA Corregir con plasma normal (1:1) P= 25seg N/2= 20seg < N/2 Corrige P+N N= 16seg P+N= ¿? ≥ N/2 No Corrige Fibrinógeno (I) IIHEMA Determinación de Fibrinógeno • Modificación Tiempo de Trombina (método de Clauss) • Reactivos: solución de trombina (concentración de 100 ó 75 U/ml) IIHEMA Determinación de Fibrinógeno • Muestras : - diluidas 1/10 en buffer veronal Owren pH=7,35 • Curva de calibración: - diluciones 1/5, 1/10, 1/20 y 1/40 del estándard. IIHEMA ¿ CÓMO REALIZAMOS LA PRUEBA ? IIHEMA 100 µl Trombina + 100 µl de dilució diluci n de plasma Tiempo de coagulación Tiempo de coagulación es inversamente proporcional a la concentración de Fibrinógeno IIHEMA Determinación de Fibrinógeno • Los resultados se expresan en mg/dl. • V.N.: 200-400 mg/dl IIHEMA Resultados : TT alterado,TP normal,APTT normal Corrige Dosaje de Fibrinógeno Disminuido Hipo o afibrinogenemia mezcla del plasma del paciente c/normal (1:1) No corrige T de Reptilasa Alterado Disfibrinogenemia congénita o adquirida Normal Inhibición tipo heparina IIHEMA ¿ Qué hacer ante un paciente con antecedentes de sangrado tardío, que presenta APTT, PT y TT normales ? IIHEMA Determinar Factor XIII IIHEMA Factor XIII Alterado Normal Determinación de α-2 antiplasmina Déficit congénito o adquirido del FXIII o inhibidor del FXIII Disminuído: déficit congénito o adquirido IIHEMA ESTRUCTURA DEL FACTOR XIII Subunidad A (XIIIA): B A B A Tetrámero (A2B2) 2 Cromosoma 6 2 globular 2 Sitio activo 2 Monocitos, megacariocitos, placenta, hígado Subunidad B (XIIIB) 2 Cromosoma 1 2 Filamentosa 2 Transportador XIIIA 2 Hígado IIHEMA ¿ CUALES SON LAS FUNCIONES DEL FXIII? IIHEMA • Estabilizar el coágulo (transamidasa) • Produce la unión entre la fibrina y la α2 antiplasmina. IIHEMA Funciones del F XIII • Entrecruzamiento (uniones covalentes) entre: 9 monómeros de fibrina 9 malla de fibrina 9 fibronectina 9 colágeno (matriz para proliferación de fibroblastos) 9 α2- antiplasmina IIHEMA VIA INTRINSECA XIIa HMK PK VIA EXTRINSECA XIa XI IX IXa VIIIa PL Ca 2+ VIIa FT PL Ca 2+ X Xa Va PL Ca 2+ II fibrinógeno X IIa fibrina Fibrina insoluble XIIIa IIHEMA B A A B E FIBRINOGENO D 2FpA + 2FpB D trombina MONOMERO DE FIBRINA E E D D D D D E D DIMERO DE FIBRINA F XIIIa D D D E D E E E D D D D POLIMERO DE FIBRINA D D D E IIHEMA D Manifestaciones clínicas • Diátesis hemorrágicas tardías: - caída del cordón umbilical - traumas o cirugías - hemorragias intracraneales (SNC, ¼ pacientes deficitarios) • Cicatrización tardía y anómala de heridas • Abortos espontáneos y recurrentes IIHEMA ¿Cómo evaluar la deficiencia de FXIII? ¿Sensibilidad? Prueba de solubilidad Ca2+ o IIa Urea o Ac.Acético plasma IIHEMA SOLUBILIDAD Plasmas deficientes (artificiales) Tiempo (min) 300 3000 IIa/Aa 250 Ca/Aa 200 2000 Ca/Urea 150 100 1000 50 50 0 1% NP 5% NP 10% NP Concentración de plasma (%) IIHEMA PRUEBA DE SOLUBILIDAD DEL COAGULO Trombina/Ac.Acético mayor sensibilidad 9 tiempos más cortos 9 EQAS, 2003 IIHEMA Prueba de solubilidad en urea 5M • 200 µl de PPP • 100 µl buffer Owren • 200 µl Cl2Ca 30 minutos a 37º C 3 ml de urea 5 M Valor normal: insoluble > 24 horas IIHEMA Solubilidad en Trombina-Acético • 200µl fisiológica • 200 µl plasma • 100 µl trombina (30UI/ml) 30min 37 3ml Ac. Acético al 2% IIHEMA Laboratorio (Cuantificación) • Inmunoelectroforesis específica (Laurell) para subunidades A y B. • Elisa para subunidades A y B. IIHEMA Sistema Fibrinolítico Bioq. Luis Bastos Dpto. Hemostasia y Trombosis IIHEMA Academia Nacional de Medicina Sistema Fibrinolítico PAI Plasminógeno PAI u-PA/u-PAR t-PA Plasmina α2 - Antiplasmina Fibrina PDF IIHEMA Sistema Fibrinolítico Test Globales •Lisis de Euglobulinas Inhibidores •Lisis en Sangre Entera PAI α2 -PI •PDF/f. Sustrato y activador • Plasminógeno • t-PA Marcadores de Fibrinolisis •D-Dímero IIHEMA Evaluación Fibrinolítica Dosaje de plasminógeno Método funcional cromogénico Electroinmunoensayo Método funcional Dosaje de α2-antiplasmina cromogénico Electroinmunoensayo Lisis de Euglobulinas IIHEMA Evaluación Fibrinolítica Lisis de Euglobulinas TPA PAI Dímero D PDF Pre y post isquemia por oclusión venosa Método funcional cromogénico Aglutinación en látex IIHEMA Puntos a tener en cuenta: • Reposo previo : - 20 minutos (el estrés y ejercicio la liberación endotelial de tPA) • Ayuno previo: - Cafeína: la actividad fibrinolítica. - Carbohidratos ricos en calorías: la actividad del PAI-1 IIHEMA Puntos a tener en cuenta: • Evitar : - Alcohol: - Tabaco: la actividad fibrinolítica por la liberación del PAI-1 el antígeno del tPA IIHEMA PAI Biológico (UI/m l) 15 RITMO CIRCADIANO 10 5 0 9 12 15 18 21 24 3 6 9 1 tPA inm unológico (ng/m l) tPA Biológico (UI/m l) Hora Normales 0,8 0,6 0,4 0,2 0 9 12 15 18 21 24 Hora AE Wallnöfer et al, 1993 3 6 9 8 6 4 2 0 9 12 15 18 21 24 3 6 Hora IIHEMA 9 Lisis del coágulo • Evalúa globalmente la actividad fibrinolítica • Afectada por los niveles de Plg/Plm, fibrinógeno, activadores e inhibidores de la fibrinolisis (α2-PI) IIHEMA Lisis del coágulo • Sangre recién extraída en tubo de vidrio limpio y seco. • Baño a 37ºC, tomar la hora cuando coagula. • Tomar el tiempo de lisis completa del coágulo IIHEMA Lisis de Euglobulinas • Precipitación de fracción proteica (“Euglobulinas”) en medio ácido 9Fibrinógeno 9Plg 9Activadores del Plasminógeno 9Plasmina 9PAI Sobrenadante: - Inhibidores de la Plasmina (α2-PI) IIHEMA Lisis de euglobulinas • 250 µl PPP* • 4 ml agua destilada • 70µl ácido acético (1%) 30 min. en heladera 4-8ºC • Centrifugar a 1000 rpm, 5 min (*) PPP obtenido de sangre anticoagulada (9:1) con citrato ácido de sodio. IIHEMA Lisis de euglobulinas • Descartar el sobrenadante • 250µl de borato de sodio • 250µl de CaCl2 0,025M IIHEMA FIBRINOLISIS Respuesta a la isquemia • Muestra basal (pre) • Muestra luego de 10 min. de compresión (post) • Esfingomanómetro: presión media entre la mínima y la máxima (del paciente) IIHEMA Respuesta a la isquemia • Tanto la muestra basal como la post oclusión se deben recoger en tubos con citrato ácido y mantener refrigeradas • Índice post/pre: < 0,70 buena respuesta 0,70-0,75 pobre respuesta > 0,75 mala respuesta IIHEMA
