La trombosis constituye la principal causa de morbi

PLAN DE TRABAJO PROPUESTO
Materia: Laboratorio de Química Biológica
Tema: Acción del dermatán sulfato sobre la formación y lisis de la fibrina.
Docente Responsable: Dra. Ana María Lauricella
INTRODUCCIÓN
La trombosis constituye la principal causa de morbi-mortalidad en el mundo occidental,
lo que estimula la búsqueda de una estrategia antitrombótica óptima.
Recientemente se ha demostrado que el dermatán sulfato (DS), un glicosaminoglicano
que se encuentra en la pared del vaso sanguineo, previene la trombosis venosa sin
producir eventos hemorrágicos. Aunque la función más conocida del DS es su acción
antitrombótica, algunos investigadores han sugerido que también tendría actividad
profibrinolítica.
Cuando se produce una injuria en los tejidos, la pérdida de sangre se detiene con la
formación de un tapón hemostático. Para formarlo, el Fibrinógeno (la proteína más
abundante del sistema) se polimeriza por activación de la cascada de coagulación,
formando una matriz denominada fibrina. Las proteínas que constituyen el sistema de
coagulación se llaman factores y generalmente se encuentran en circulación en forma de
precursores enzimáticos inactivos o zimógenos. Mac Farlane y Davie propusieron un
sistema de reacciones secuenciales, donde una enzima activa a un sustrato (por una
proteólisis específica), el cual se convierte a su vez en una enzima activa para el
próximo sustrato, desencadenando un sistema de activación en cascada. La trombina es
la enzima clave del proceso hemostático, cuya principal función es polimerizar al
fibrinógeno.
Mientras se produce la reconstrucción de la pared vascular afectada, la fibrina se
disuelve por acción de la plasmina, principal enzima del sistema fibrinolítico, cuyo
precursor inactivo es el plasminógeno. Ambos sistemas, el de coagulación y el
fibrinolítico están regulados por inhibidores específicos.
El objetivo de este plan es investigar el efecto del DS de alto y bajo peso molecular
sobre la red de fibrina, evaluando la cinética de formación, carácterísticas estructurales
y lisabilidad. Además se propone estudiar posibles interacciones entre el DS y el
plasminógeno.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS Y METODOLOGÍA A UTILIZAR
Impartir a los alumnos conocimientos acerca de la secuencia de reacciones involucradas
en la formación de la fibrina y su lisis.
Evaluar el efecto del DS de alto y bajo peso molecular sobre:
- la cinética de formación de la fibrina por un método espectrofotométrico.
- la estructura de redes de fibrina formadas a partir de plasma y de la fracción
euglobulínica del plasma (formada principalmente por plasminógeno,
fibrinógeno y los activadores del plasminógeno) utilizando microscopía
electrónica de barrido.
- la compresibilidad o compactación de los coágulos de fibrina plasmática y de
la fracción euglobulínica pesando en balanza analítica el líquido exudado
como resultado de fuerzas centrífugas controladas.
- la lisabilidad por el método de lisis de euglobulinas.
-
la lisabilidad con uroquinasa (UK) de fibrina plasmática y euglobulínica por
seguimiento espectrofotométrico en función del tiempo.
- posibles interacciones con el plasminógeno mediante inmunoelectroforesis
bidimensional en placas de acetato de celulosa (Titán III).
En todos los ensayos se emplean controles realizados con buffer fosfato salino (PBS).
Bioseguridad
El material biológico a utilizar será sometido previamente a los controles previstos en
las Normas de Higiene y Seguridad impartidas por la FCEyN, UBA. Del mismo modo,
los procedimientos involucrados en la realización del presente proyecto cumplirán con
las normas adecuadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de la Fracción euglobulínica
La técnica consiste en precipitar en medio ácido la fracción de euglobulinas del plasma
(formada principalmente por plasminógeno, fibrinógeno y los activadores del
plasminógeno) y luego redisolverla en medio alcalino.
Lisis de euglobulinas
La fracción euglobulínica se coagula por agregado de cloruro de calcio o trombina. Se
cuantifica el tiempo de lisis del coágulo formado desde el agregado de trombina hasta su
disolución completa.
Reactivos:
1. Citrato de sodio 3,8% p/v
2. Ácido acético 1%
3. Cloruro de calcio 0,025 M
4. Buffer borato: NaCl 0,15 M, borato de sodio 2,6 µM, pH 9.
Técnica:
1. En un tubo cónico de vidrio agregar: 9 ml de agua destilada, 0,5 ml de plasma
citratado y 0,1 ml de ácido acético 1%. Dejar 30 minutos a 4 °C.
2. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos. Descartar el sobrenadante y dejar el tubo
invertido sobre papel de filtro durante 2 minutos.
3. Agregar 0,5 ml de buffer borato y disolver el precipitado a 37°C ayudándose con
una varilla de vidrio.
4. Agregar 0,5 ml de cloruro de calcio 0,025 M (o 5 Unidades de trombina) y poner en
marcha un cronómetro.
5. Investigar la lisis del coágulo formado a intervalos de 10 minutos. En el momento
de su lisis completa detener el cronómetro, tomar la lectura correspondiente y
asignar como tiempo de lisis de euglobulinas.
Formación y lisis de redes de fibrina
El fibrinógeno forma redes de fibrina por efecto de la trombina en presencia de calcio.
A este sistema de coagulación se le agrega además uroquinasa, con el objeto de generar
plasmina en el interior del coágulo y degradar las redes de fibrina formadas.
Reactivos
1 Pool de plasma humano normal, citratado, pobre en plaquetas o su fracción
euglobulínica.
2 Trombina bovina (International Laboratories, USA) 100 U/ml.
3 Cloruro de Calcio 1M.
4 Uroquinasa: Ukidan (Serono Argentina S.A.) 50.000 U/ml.
5 Buffer Tris - HCl 50 mM, en una solución 15mM de NaCl (pH 8)
Técnica
1 En una policubeta de fondo plano se colocan volúmenes de trombina, cloruro de
calcio, uroquinasa, DS y buffer en las concentraciones adecuadas para alcanzar las
concentraciones finales deseadas en cada ensayo.
2 Los ensayos de fibrinoformación se logran reemplazando la uroquinasa por igual
volumen de buffer, de modo de no activar el plasminógeno.
3 Se colocan las policubetas en un lector de ELISA y se agregan con fuerza 100 µl de
plasma, de modo de homogeneizar los reactivos colocados en la policubeta.
4 Se registra la densidad óptica a 405 nm a intervalos regulares de tiempo.
Estructura de redes de fibrina
Se realizarán coágulos plasmáticos y de fracciones euglobulínicas sobre soportes de
vidrio. Las muestras serán procesadas y observadas en un microscopio electrónico de
barrido (MEB).
Reactivos
1 Pool de plasma humano normal, citratado, pobre en plaquetas o su fracción
euglobulínica.
2 Trombina bovina (International Laboratories, USA) 35 U/ml.
3 Cloruro de Calcio 1M.
4 Glutaraldehído 30% (p/v).
5 paraformaldehído 2,5% (p/v)
6 tetróxido de osmio 1%.
7 Acetona
Técnica
1 Sobre soportes de vidrio de 7mm de lado se forman coágulos a partir de plasma (o
su fracción euglobulínica) con trombina (concentración final 0,1U/ml) y cloruro de
calcio (concentración final 33 mM).
2 Los coágulos formados se dejan estabilizar en cámara húmeda durante 18 horas a
4°C.
Los pasos subsiguientes se realizan a temperatura ambiente.
3 Las muestras se fijan con glutaraldehído-paraformaldehído durante 2 horas.
4 Lavar con buffer cacodilato. Postfijar con tetróxido de osmio.
5 Deshidratar con soluciones de acetona en agua en concentraciones crecientes (50,
70, 85 y 100 %).
6 Las muestras se secan por punto crítico y son metalizadas para ser observadas en un
microscopio electrónico de barrido a 5 kV, donde se obtienen las fotografías
correspondientes.
7 Se realizan mediciones sobre las fotografías de las observaciones microscópicas con
el programa Imaje J. Se evalúan al menos 10 campos de igual área, aleatoriamente
seleccionados y se caracteriza cada red midiendo: número de fibras por campo, % de
red (relación porcentual entre la superficie ocupadas por las fibras respecto al área
total del campo), ancho y largo de las fibras.
Compactación de fibrina plasmática.
Se prepararon geles de fibrina por triplicado en microtubos plásticos a partir de plasma
o su fracción euglobulínica con Trb-Ca2+. Luego de centrifugar los tubos en condiciones
controladas se determina el peso de la solución exudada.
Reactivos
1 Pool de plasma humano normal, citratado, pobre en plaquetas o su fracción
euglobulínica.
2 Trombina bovina (International Laboratories, USA) 35 U/ml.
3 Cloruro de Calcio 1M.
Técnica
1 Se prepararon geles de fibrina con 650 µl de cada muestra diluida y 50 µl de
Trb-Ca2+ (c.f. Trb = 0,1 U/ml; c.f. Ca = 33 mM). Se deja gelificar a 37 ºC durante
2 hs; luego los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 2 minutos, y se
determina el peso de la solución exudada en balanza analítica.
Los resultados se expresan en porcentaje de compactación, calculado como la
relación porcentual entre el volumen exudado y el volumen original del gel de fibrina.
Interacción entre plasminógeno y DS.
Para estudiar posibles interacciones entre el plasminógeno y el DS se utilizará la técnica
de inmunoelectroforesis bidimensional en placas de acetato de celulosa deshidratado
(Titán III). En un extremo de la placa se siembra plasminógeno purificado y se realiza la
electroforesis en una dimensión donde se esparce DS. Luego se esparce sobre el resto de
la placa el anticuerpo anti-plasminógeno y se realiza otra electroforesis en la segunda
dimensión. El perfil correspondiente al complejo inmune puede poner de manifiesto
diferencias debidas a interacciones moleculares.
Reactivos
1 Plasminógeno purificado.
2 Placas de acetato de celulosa deshidratado (Titán III).
3 Buffer de desarrollo electroforético: Tris 0,05 M-Glicina 0,1 M, pH 8,3.
4 Colorante: Azul Brillante de Coomassie R-250, 0,5% en solución decolorante (p/v).
5 Solución decolorante: Metanol: Acético: Agua (45:10:45)
Técnica
1
2
3
4
5
Se aplica 50 µl de DS en buffer (o buffer sin DS como control) sobre la
porción de la placa donde se desarrollará la primer corrida electroforética.
Se siembra el plasminógeno en un extremo y se efectúa la electroforesis en la
primera dimensión a 350 V, 2,5 mA/placa durante 30 minutos.
Se esparcen 60 µl del antisuero diluido sobre el resto de la placa. Se realiza la
segunda electroforesis a 300 V, 25 mA/placa durante 2 horas.
Se lava la placa para eliminar el anticuerpo remanente.
Se colorea la placa y se lava el excedente de colorante, para poner en evidencia el
complejo inmune.