MÉTODO CITOQUÍMICO PARA EVALUAR ADHERENCIA EN

Rev Cubana Med Milit 2002;31(1):37-40
Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto"
MÉTODO CITOQUÍMICO PARA EVALUAR ADHERENCIA
EN LEUCOCITOS POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS
Lic. Tatiana Vázquez González, 1 Lic. José de la Paz Naranjo, 2 Lic. Adriana Sin Mayor,3 Dra. Edelis Castellanos
Puerto4 y Téc. Ana Rojas Moya5
RESUMEN
Se desarrolló un método citoquímico cuantitativo y sencillo para evaluar adherencia en
leucocitos polimorfonucleares neutrófilos. Las células fueron aisladas por gradiente de
densidad a partir de sangre periférica de 47 donantes voluntarios que acudieron al Servicio
de Transfusiones del Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto”. La
cualidad adhesiva se amplificó mediante la determinación de proteínas totales por el
método de Lowry, luego de incubar los fagocitos en placas plásticas de cultivo de 24 pozos.
El mayor número de valores se encontró entre 6 y 10 mg/dL, lo que representó el 70 % de
los sujetos evaluados. La combinación de la placa de cultivo como superficie de adhesión
y la determinación de proteínas como forma de amplificar esta cualidad, constituye una
novedad del método propuesto.
DeCS: ADHERENCIA CELULAR; TEST DE INHIBICION DE ADHERENCIA
LEUCOCITICA/métodos; TRANSFUSION SANGUINEA; FAGOCITOSIS;
HISTOCITOQUIMICA.
El ser humano está expuesto a disímiles
microorganismos patógenos, cuya invasión
y colonización originan múltiples enfermedades, aunque no siempre logran este acometido gracias a la acción del sistema
inmunológico.
Entre estos mecanismos efectores o de
respuesta inespecíficos se encuentra la
fagocitosis, la cual consiste en el reconoci1
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miento, englobamiento, ingestión y destrucción del agente extraño, por células especializadas llamadas fagocitos.
La adherencia de estos fagocitos a través de las moléculas de adhesión expresadas en su superficie, al endotelio vascular,
después de una señal quimiotáxica constituye el primer evento de este proceso
fagocítico. Por lo que cualquier alteración
Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora.
Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado.
Licenciada en Biología. Aspirante a Investigadora.
Especialista del I Grado en Inmunología Básica y Clínica.
Técnica en Investigaciones Bioquímicas.
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de esta etapa repercute negativamente en
la fagocitosis en general.1-4
Es por lo antes planteado que resulta
de interés la evaluación de la adherencia
en leucocitos polimorfonucleares neutrófilos
(PMN) de pacientes con trastornos en el
mecanismo fagocítico en particular e
inmunodeficiencias celulares en general para
un diagnóstico más preciso, y de gran utilidad cualquier método que permita alcanzar
este objetivo.
MÉTODOS
Muestra. A 47 donantes voluntarios de
sangre, que acudieron al Servicio de Transfusiones del Instituto Superior de Medicina
Militar “ Dr. Luis Díaz Soto” y que cumplían los criterios de inclusión siguientes:
edad entre 16 y 40 años y no haber recibido
tratamiento con fármacos inmunomoduladores, hemoterapia o ambos, en los últimos 6 meses, se les tomó muestras de
sangre venosa y se depositó en tubos de ensayo plásticos que contenían heparina libre
de preservo (50 UI/mL).
Aislamiento de polimorfonucleares
neutrófilos. Sangre anticoagulada y diluida
con solución salina fisiológica (SSF) volumen a volumen, se depositó sobre un
gradiente Ficoll-Telebrix densidad
(1,077 g/cm3), y se centrifugó a 1 500 r.p.m.
durante 30 min. Los PMN así aislados se
lavaron con SSF y se centrifugaron a 1 500 r.p.m.
durante 5 min. Posteriormente se sometieron a 2 shocks osmóticos sucesivos con solución de cloruro de amonio (SCA), para
eliminar los eritrocitos contaminantes. La
SCA entonces fue eliminada por 2 nuevos
lavados con SSF y los PMN ajustados a la
concentración de 4 x 106 cel/mL de medio
esencial mínimo. La viabilidad celular fue
determinada por la técnica de exclusión con
Tripan azul.5
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Ensayo de adherencia celular. Para el
ensayo fueron empleadas placas plásticas de
cultivo de 24 pozos con fondo plano. Se depositó 0,5 mL de la suspensión celular en
cada pozo e inmediatamente esta se incubó
a 37 °C, en atmósfera de humedad durante
30 min. Un control negativo (testigo sin
células) fue también incluido en el ensayo.
Las células no adheridas, finalizado el tiempo de incubación, se eliminaron por lavados
con SSF. Finalmente se adicionó a cada pozo
0,25 mL de agua destilada fría, se agitó
vigorosamente para lograr el lisado de los
PMN adheridos y se dejó reposar durante
15 min a temperatura ambiente. El contenido de 2 pozos por muestra se utilizó para
la cuantificación de proteínas. El método
empleado fue el de Lowry, las determinaciones realizadas por duplicado y las concentraciones informadas en miligramo por
decilitro.6
Curva de calibración. Fue obtenida por
ploteo de 5 concentraciones diferentes de
una solución de albúmina de suero bovino
(Merck) y calculada la ecuación de la recta por el método de los mínimos cuadrados,
a partir de un triplicado de la curva. Esta
última se utilizó para el cálculo, por
interpolación, de las concentraciones
proteicas de las muestras ensayadas.
Análisis estadístico. Los datos obtenidos se procesaron de forma automatizada a
través del paquete estadístico STADISTICA.
El nivel de significación se fijó en una
p ≤ 0,05.
RESULTADOS
Se encontraron concentraciones de proteínas entre 2 y 16 mg/dL, con un pico máximo del recorrido de la variable en 8 mg/dL.
Al realizar la prueba de Shapiro Wilk se
encontró que esta variable cumple con una
distribución normal, con un nivel de
confiabilidad estadística del 95 %.
La curva de calibración obtenida fue
lineal en el recorrido de valores ploteados
y el coeficiente de correlación (r) de 0,997.
Además se encontró una relación coeficiente
de variación en condiciones de rutina/coeficiente de variación en condiciones óptimas menor que 2. Valores estos de calidad
aceptados metodológicamente para ensayos
fotométricos.7
DISCUSIÓN
En ensayos realizados in vitro se ha
informado que los PMN de individuos con
deficiencias en la adhesión tienden a mostrar pérdida de la habilidad para adherirse
a la superficie del plástico. Esto se relaciona in vivo con una disminución de la
capacidad de los fagocitos para difundir a
la zona del daño, formar seudópodos y por
consiguiente fagocitar las partículas extrañas. Además la literatura informa una correlación directa entre los ensayos automatizados que miden cantidad de células con
los que determinan la concentración
proteica, aspectos estos tenidos también en
cuenta para desarrollar este proceder.8-11
Basados en estos hallazgos se empleó
la placa de cultivo plástica de 24 pozos como
superficie de adhesión y se combinó, para
la amplificación de esta cualidad celular,
con la determinación de proteínas, que aunque ya informados por otros autores no habían sido antes tenidas en cuenta en el mismo ensayo, lo que constituye una novedad
introducida en el método.
En general se puede concluir que el
método propuesto aparece fundamentado en
la literatura científica, es ventajoso con
propósitos diagnóstico y de seguimiento de
la evolución, y no requiere de equipos ni
reactivos especiales.
SUMMARY
A simple cytochemical and quantitative method was developed to evaluate the adherence in polymorphonucelar
neutrophil leucocytes. The cells were isolated by density gradient from peripheral blood of 47 volunteer donors that
went to the Transfusions Service of “Dr. Luis Díaz Soto” Higher Institute of Military Medicine. The adhesive
quality was amplified by the determination of total proteins by the method of Lowry, after incubating the
phagocytes in plastic culture plates of 24 pits. The highest number of values was found between 6 and 10 mg/dL,
which accounted for 70 % of the evaluated subjects. The combination of the culture plate as adhesion surface and
the determination of proteins as a way to amplify this quality, is a novelty of the proposed method.
Subject headings: CELL ADHESION; LEUCOCYTE ADHERENCE INHIBITION TEST/methods; BLOOD
TRANSFUSION; PHAGOCYTOSIS; HYSTOCYTOCHEMISTRY.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Acta Med Acad Sci Hung 1982;39(3-4):155-60.
Recibido: 29 de agosto del 2000. Aprobado: 13 de septiembre del 2000.
Lic. Tatiana Vázquez González. Instituto Superior de Medicina Militar “Dr. Luis Díaz Soto”. Avenida Monumental, Habana del Este, CP 11700, Ciudad de La Habana, Cuba.
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