ANÁLISIS CUALITATIVO vs. CUANTITATIVO

ANÁLISIS
CUALITATIVO vs. CUANTITATIVO
1. CUALITATIVO - ¿qué está presente?
• Cromatografía - compare tR 's
• Espectroscopía - MS, IR, UV
2. CUANTITATIVO - ¿Cuánto está presente?
• Altura de pico
• Área de pico
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ANÁLISIS CUALITATIVO
Teofilina
Teobromina
Cafeína
1. Estándar
"X"
2. Desconocido
tR(theophylline) = tR(“X”), entonces, se sugiere que “X” es teofilina.
Para confirmación positiva, se debe emplear LC-MS
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ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LC
Efluente LC
Espectrómetro de masas
Solvente
Muestra
Sistema de datos
Al
Vacío
Espectro de masas
Muestra concentrada
HPLC 5 10/96
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EXACTITUD-META ANALÍTICA
•
Error absoluto:
Diferencia entre valor medido y el
valor verdadero.
•
Error relativo (%) :
(Error / Valor Verdadero) x 100 = %
Error
•
Ejemplo:
50.0 g
Peso medido
48.0 g
Error absoluto
2.0 g
% Error
( 2 / 50 ) x 100 = 4 %
Peso verdadero
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PRECISIÓN
1. Mide reproducibilidad
2. Depende de la técnica
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MEDIDA DE LA PRECISIÓN:
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
S.D.  

x  x 2
n1
S.D.
 100
Desviación estándar relativa =RSD 
x
Data
10.0
12.0
9.0
11.0
8.0
Chemist X
Statistics
n=5
x = 10.0
= 1.58
RSD = 15.8%
Data
10.2
10.6
9.8
10.1
9.3
Chemist Y
Statistics
n=5
x = 10.0
= 0.48
RSD = 4.8%
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COMPONENTES DE EXACTITUD
CALIBRACIÓN + PRECISIÓN = EXACTITUD
1. Esencial calibración con estándares
2. Precisión (reproducibilidad) necesaria para
un procedimiento analítico exacto
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PROCESO CUANTITATIVO HPLC
1. Muestreo
4. Integración
2. Preparación
de la
muestra
5. Cálculos
3. Cromatografía
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MUESTREO
1. Objetivo – tomar una pequeña muestra
representativa de una población grande
2. Problemas
•
•
Contaminación
La muestra no es representativa
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PREPARACIÓN DE MUESTRA
1. Procedimiento
Moler
Disolver
Diluir
Concentrar
Filtrar
Extraer
Derivatizar
2. Problemas
• Pérdida de muestra
• Contaminación
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CROMATOGRAFÍA
Registrador
Bomba
Inyector
Medidor
de presión
Reservorio
de solventes
Sistema de
datos o integrador
Columna
Detector
Macintosh
Desecho
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CONVERSIÓN DIGITAL–ALTURA DE PICO
B
D
C
h
A
h
h
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INTEGRACIÓN – ÁREA DE PICO
Area
Más difícil que medir altura de pico, pero está
menos influenciado por cambios en la
temperatura de la columna o el flujo.
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INTEGRADOR DIGITAL ELECTRÓNICO
DETECTOR
A/D
CONVERTIDOR
MICROPROCESADOR
IMPRESORA
sjhd kahd kjhd kjhd
kjhd kjhsd kjhsd kjhs
kjhs dkjhs dkjhs
dkjhs dkjhs dkjhs
dkjhs dkjhs dkjhs
aljd lkjsd lkjsd lkjsd
lkjs dljad ljadlj sljd
aljd lkjsd iou fijgf
oujfjd iuzdshda,
adh fiehkjhd
audddehfjsiu
dSj.jfldu oejalkjd lkjs
dlkj djs 2163216 321
6312
REGISTRADOR
CINTA
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SISTEMAS DE DATOS
1.235
1.235
1.235
1.235
1.235
INTEGRADOR
. Fácil de usar
. Precio moderado
COMPUTADORA
. Flexible/poderosa
. Más caras
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VENTAJAS DE LOS INTEGRADORES
1. Sensibilidad
2. Intervalo dinámico
3. Exactitud/precisión
4. Corrección de línea base
5. Identificación de pico (Computadora)
6. Automatización total (Computadora)
• Programación de temperatura
• Integra, cuantifica
• Auto-calibra
• Introducción de la muestra
• Registro impreso
• Regeneración de la columna
• Repetición del programa
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LIMITACIONES DE INTEGRADORES
1. Costo de capital
2. Se requiere entrenamiento
3. Picos no resueltos - baja
exactitud
4. Sobreconfianza
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CÁLCULOS:
NORMALIZACIÓN DE ÁREA SIMPLE
C
B
A
600
300
Área = 150
1. Cálculos
wgt %A 
Area A
150
 100 
 100  14. 3%
Total Area
150  300  600
2. Procedimiento usualmente no válido
• Asume que todos los picos responden igual
• Asume que la suma de áreas es el 100% de la muestra
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CÁLCULOS: FACTOR DE
RESPUESTA
C
B
A
Peso =
10 g
10 g
10 g
Área =
150
300
600
Los factores de respuesta difieren
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CÁLCULOS DEL FACTOR DE
RESPUESTA
Área (Cuentas)
300
C
B
200
W
A
A
100
5
FR
Cuentas de área [g]
B.
30
A.
15
C.
60
10
Peso (g)
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CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN CON
CORRECCIÓN DE ÁREA
A
B
C
Area
150
300
600
RF
15
30
60
Corrected Area
10
10
10
wgt %A = (10/30) x 100 = 33.3%
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CÁLCULOS:
ESTÁNDAR EXTERNO
Área
Desconocido
Peso (g)
1. Desarrolla una curva de calibración con
estándares, y compara con el desconocido
2. Requiere de una inyección reproducible
3. Es más empleado en LC que en GC
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SELECCIÓN DEL ESTÁNDAR INTERNO
Muestra sola
Requisitos:
1. Estándar puro
Muestra + ISTD
2
Picos bien resueltos
3. Nunca presente en la
muestra
4. En el mismo nivel de
concentración
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CÁLCULOS:
ESTÁNDAR INTERNO (1)
A
A
IS = EST. INTERNO
A = ANALITO
A
IS
IS
IS
Muestra 1 Muestra 2
Muestra 3
Muestra 3
Área A / Área IS
Muestra 2
Muestra 1
Peso A / Peso IS
1. Prepare e inyecte muestras de estándar interno y del analito de
interés.
2. Prepare una curva de calibración de los datos cromatográficos,
graficando la relación de áreas contra la relación de pesos de
analito y estándar interno.
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CÁLCULOS:
ESTÁNDAR INTERNO (2)
Área A / Área IS
Desconocido X
Peso A / Peso IS
1.
2.
3.
4.
Añada con precisión el IS a la muestra desconocida
Cromatografíe la mezcla
Calcule la relación de áreas
Determine la relación de pesos de la curva de
calibración
5. Encuentre el peso del analito
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ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC
Component
True
Measured Relative
Weight % Weight % Error (%)
Et Paraben
11.66
11.54
1.0
Pr Paraben
16.94
16.91
0.2
Bu Paraben 33.14
33.17
0.1
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