TP 5 4-03 Coloración

Curso de Postgrado 2016
COLORACIÓN
¿POR QUÉ ES NECESARIO COLOREAR
UN CORTE HISTOLÓGICO?
PREPARADOS FRESCOS U
OBTENIDOS POST MORTEM
(M.O)
SOLUCIONES COLOREADAS
 Se unen selectivamente a
ciertas estructuras,
tiñéndolas.
Ej. Orceína
Carmín de Best
Fibras elásticas
Glucógeno
Se diferencian sólo los elementos
que poseen distinto índice de
refracción (ir). Aquellos
componentes con un ir. semejante
aparecerán iguales al observador,
por lo tanto serán confundidos en
uno solo.
Determinados detalles
estructurales se hacen visibles
El estudio del preparado se
realiza mediante el análisis
cromático
COLOR Y COLORANTES
Cuando una sustancia es incolora (no tiene absorción en el espectro
visible), agregando algunos grupos no saturados (con doble ligadura)
denominados CROMÓFOROS se pueden desplazar esas bandas hacia el
espectro visible, entonces la sustancia presenta color.
C
O
carbonilo
N O
nitroso
N
N
azoico
RESUMIENDO: Sustancia incolora + Cromóforos = CROMÓGENO
No implica que la sustancia ya sea un colorante
CROMÓGENO + AUXOCRÓMO = COLORANTE
AUXOCRÓMOS: son radicales químicos que aumentan el color y
adquieren la capacidad de colorear. Estos hacen que el cromógeno se
ionice.
Grupos aminos, hidroxilos, halógenos.
 CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES SEGÚN SU CARGA
1. BÁSICO
Posee un grupo catiónico (R+=cromógeno) que se une a grupos ácidos
de los tejidos: SO4= (sulfato); PO4= (fosfato).
Azul de metileno
Hematoxilina
Fucsina básica
Azul de toluidina
2. ÁCIDO
Posee un grupo aniónico (R-) que se une a grupos básicos de los tejidos:
NH3+ (grupo amino protonado).
Eosina (Eosianato de Na)
Na+
Orange G
Azul de anilina
Na+
3. NEUTROS mezcla de un colorante ácido con uno básico.
Eosianato de azul de metileno (May Grünwald)
Teniendo en cuenta la afinidad de un colorante por determinados grupos
químicos presentes en el tejido diremos que:
COMPONENTES TISULARES BASÓFILOS
COLORANTE BÁSICO
Formará uniones con componentes tisulares
cargados (-) por ej. grupos ácidos
 Heterocromatina y nucléolos (grupos fosfato ionizados de los ácidos
nucleicos).
 RER (grupo fosfato ionizados del ARN).
 Matriz extracelular del cartílago ( hidratos de carbono con grupos
sulfatos.
COMPONENTES TISULARES ACIDÓFILOS
COLORANTE ÁCIDO
Carga (-) aniónica




Formará uniones con componentes tisulares
cargados (+) por ej. grupos básicos
Filamentos citoplasmáticos (Ej. Actina, miosina).
Componentes membranosos intracelulares.
Citoplasma en general.
Fibras extracelulares (grupos aminos ionizados).
CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES
VEGETALES
NATURALES
Hematoxilina
Orceína
ANIMALES
Carmín
 POR SU ORIGEN
ARTIFICIALES
Derivados de la
destilación de la hulla
Colorantes de anilina
MECANISMOS DE COLORACIÓN
¿POR QUÉ SE COLOREA?
 FÍSICOS:
a) Por disolución del colorante en distintas sustancias o
componentes tisulares. Ej. Sudan III se disuelve en lípidos.
b) Por impregnación metálica: precipitación de sales metálicas sobre
estructuras con diferente densidad. Ej. Sales de Ag (Técnica de Río
Hortega), Hg (Técnica de Ramón Moliner).
 QUÍMICA:
Detección de una sustancia determinada a través de una
unión química específica.
Ej: Técnicas histoquímicas
Reacción del ácido periódico-reactivo de Schiff (PAS)
Reacción del azul alcian (AB) (detección de glicoconjugados)
Técnica con Carmín de Best (detección de glucógeno).
 FÍSICOQUÍMICA (la mayoría)
El colorante se une a la sustancia coloreable específica
combinándose íntimamente con ella debido a la presencia de
agrupaciones moleculares básicas y ácidas en los tejidos que se unirán
con los grupos ácidos y básicos de los colorantes.
GLOSARIO aplicable a coloraciones y/o colorantes
 SIMPLE: se utiliza un solo colorante y por ende se colorea solamente
algunos elementos del preparado. Ej: azul de metileno
 COMBINADA: se utilizan dos o más colorantes, se recurre al empleo
de colorantes básicos y ácidos. Ej: Hematoxilina-eosina
• Sucesiva: Tricrómico de Masson; H&E.
•Simultánea: Tricrómico de Mallory (azul de anilina-orange G)
Hematoxilina-Eosina
Tricrómico de Masson
modificado
Tricrómico de Mallory
 PROGRESIVA: se deja actuar al colorante hasta obtener una
coloración óptima. Ej: Orceína, para fibras elásticas (Técnica de Fränkel).
 REGRESIVA: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina
el exceso del colorante por medio de diferenciadores. Este proceso se
denomina diferenciación. Ej: Coloración de Mallory-Heidenhain (AZAN): el
azocarmín (colorante ácido) tiñe tantos núcleos como citoplasma.
Diferenciador: 0.1% de aceite de anilina en ROH 96º.
 DIRECTA: existe una verdadera afinidad entre la sustancia a colorear y
el colorante. Ej: Eosina
En un tiempo: Ej. Hematoxilina de Carazzi
Hematoxilina al oxidarse con la luz o
una sustancia oxidante
 INDIRECTA: requiere la
intervención de
intermediarios o mordientes
para que la coloración tenga
lugar.
Hemateína + Alumbre de K o Fe
(mordiente)
LACA O HEMALUMBRE
En dos tiempos Ej: Hematoxilina de Regaud
1º actúa el mordiente directamente en el tejido y
luego el colorante. La laca se forma en el tejido.
 PANÓPTICA: es una coloración combinada realizada sucesivamente
por colorantes neutros. Ej. Coloración de May Grünwald-Giensa
 PANCRÓMICA: en un solo colorante actúan todos los colorantes
neutros que se necesitan.
Ej. Coloración de Pappenheim
Se mezcla en una solución colorante:
ácido fénico, verde de metilo y pironina en
agua destilada.
 ORTOCROMÁTICA: el tejido toma el mismo color que el colorante.
Ej. la fucsina, hematoxilina.
METACROMÁTICA: un componente celular o una sustancia se tiñe de
un color diferente al del colorante. Ej. azul de metileno, azul de toluidina
Componentes tisulares inducen a que
el colorante se polimerice y modifique
su color. Se da con colorantes básicos
TÉCNICAS DE COLORACIÓN
Coloraciones pueden ser:
 GENERALES O TOPOGRÁFICAS
•H&E
• Tricrómico de Masson
• AZAN
 ESPECIALES
• Fränkel
• Sudan III
• Klüver-Barrera
• Impregnaciones argénticas
 HISTOQUÍMICAS
• APS
• Azul Alcian
 INMUNOHISTOQUÍMICAS
PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN PARAFINA
• Desparafinar: coplin con xilol (5 min).
• Hidratación (hasta el diluyente del colorante)
ROH 96º: 1 min.
COLODIONAR
ROH 70º: 1 min.
ROH 50º: 1 min.
AGUA DESTILADA: 1 min.
• Coloración propiamente dicha
VER PROTOCOLOS
COLORACIÓN
• Deshidratación
ROH 96º: un pasaje
Secar con papel de filtro o estufa.
• Aclaración
Coplin con xilol (ATENCIÓN!!!)
• Montado
Utilización de un medio químicamente
anhidro.
ACLARACIÓN
Coloraciones topográficas en cortes en parafina
Hematoxilina-Eosina
Tricrómico de Masson modificado
PROTOCOLO GENERAL DE COLORACIÓN PARA CORTES EN RESINA
•Hidratación
Hematoxilina-Eosina
AGUA DESTILADA: 10 min
• Coloración propiamente dicha
HEMATOXILINA DE CARAZZI
Lavado en H2O destilada
EOSINA ALCOHOLICA IODADA
Controlar bajo microscopio.
Lavar con H2O destilada
• Deshidratación
ROH 90º un pasaje
ROH 100° un pasaje
Dejar secar bajo campana
• Montaje
Utilización de un medio químicamente anhidro.
Hematoxilina -Eosina
Agradecimiento Dra. J. Gimenez
Hematoxilina -Eosina
Agradecimiento a Dra. J. Gimenez
Tricrómico de Masson modificado
Agradecimiento a Lic. M. Ojeda
Tricrómico de Masson modificado
Agradecimiento Lic. M. Ojeda
Development of the Follicle Complex and Oocyte taging in Red Drum, Sciaenops ocellatus Linnaeus,
1776 (Perciformes, Sciaenidae).
Dr. Harry J. Grier
JOURNAL OF MORPHOLOGY 273:801–829 (2012)
Coloración de semifino
Cortes de 1 µm de
espesor previo a la
obtención de cortes
ultrafinos para MET.
Una vez localiza la zona de interés se procede al retallado del taco.
Contraste de cortes ultrafinos
para MET