t to

Cultivos
Sumergidos
Se define el crecimiento
como el aumento irreversible de masa de un
organismo
g
vivo,, órgano
g
o célula
Parámetros para expresar la tasa de crecimiento:
Peso Seco:
Consiste en filtrar el volumen de suspensión tomado como muestra,
secarlo, con vacío, a 50 °C hasta peso constante.
L desventaja
La
d
t j que presenta
t este
t método
ét d es que se destruye
d t
ell material
t i l
vegetal.
Peso Fresco:
En este caso se filtra el material vegetal y se pesa.
La desventaja es que este dato puede ser falso, si el aumento de peso se
debe a aumento de volumen celular y no a un aumento irreversible de
masa celular.
Volumen de empaquetamiento
p q
((VPC):
)
Relación de volumen de células referido al volumen de suspensión. Se
basa en centrifugar en tubo graduado a 3000 r.p.m. durante 5 minutos una
fracción de suspensión celular.
VPC =
volumen de células
volumen de suspensión
Cinética de crecimirnto
Plant Cell Suspension
p
typical
yp
Growth curve
16
Dry weigh
ht (g/l)
14
3
12
10
8
2
6
4
2
1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
time (d)
Fase inicial o lag: Corresponde a un período de adaptación de las células
de un cultivo, que son transferidas a un medio nutritivo fresco.
En esta etapa se inician una serie de cambios metabólicos, entre los
que se encuentran la activación del sistema energético (rutas
glicolíticas y de las pentosas) lo que provoca un aumento en las
concentraciones de NAD(P)H y un incremento en la actividad de
invertasa, que se traduce en una mayor síntesis de pared celular y
contenido de RNA en la célula.
célula
El objeto de esta fase es entonces, preparar a las células para el
proceso de división celular.
p
16
Dry weight (g/l)
14
3
12
10
8
2
6
4
1
2
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22
time (d)
Fase de división celular, logarítmica o exponencial: Como su nombre lo
i di
indica,
es ell período
í d en ell que una vez inducida
i d id la
l división
di i ió celular,
l l esta
t
procede rápidamente.
En esta etapa no se manifiestan notables cambios ni en el tamaño,
tamaño ni
en la diferenciación celular, ya que esta destina todos sus esfuerzos a
dividirse
Existe un notable incremento en la captación de oxígeno, parámetro que
se utiliza para evaluar proliferación celular .
16
Dry weight (g/l)
14
3
12
10
2
8
1
6
4
2
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22
time (d)
Fase estacionaria: Esta fase representa el cese de la división celular,
también se ve disminuida la actividad de los sistemas energéticos.
En esta fase se puede originar la diferenciación estructural y
bioquímica del cultivo, con la consecuente activación de regiones
meristemáticas
i
ái
presentes en los
l
agregados,
d
l que provocaría
lo
í la
l
organogénesis de los cultivos.
En algunos cultivos en esta etapa se activa o incrementa la
producción de metabolitos secundarios, debido a la baja actividad
en las rutas del metabolismo primario.
16
Dry weight (g/l)
14
3
12
10
8
2
6
4
1
2
0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22
time (d)
•
Linear
Stationary
Linear/progressive deceleration
Log
Exponential
Lag
Time (days)
Cambios en el tamaño celular
durante la fase exponencial el tamaño celular
disminuye (división celular >>ganancia de peso seco)
Growth
(
)
Cell Volume
Cell Volume
(----)
15
Cell Units
Cell Aggregation
5
2.0 x 105 cells/ml
Relative
Growth
(log)
6.2 x 105 cells/ml
Inoculum Density
Time (days)
El modelo clásico p
para expresar
p
crecimiento es el
exponencial y esta referido solo al crecimiento activo
dX / dt = μ . X0
ln X/ X0 = μ (t-to)
(t to)
donde Xo es la biomasa al tiempo cero y μ es la velocidad
específica de crecimiento que indica cuan rápido crece un
cultivo por unidad de biomasa.
Otro parámetro muy utilizado es el tiempo de duplicación
que es el tiempo que tarda una dada biomasa en duplicarse
td = ln2 / μ
En cultivos de callos y órganos se usa índice de
crecimiento
es la relación entre la concentración final e inicial de
biomasa.
IC = X / Xo
X= Xfinal – Xo
Filter apparatus to filter
off cells to measure
wet/dry
t/d weight
i ht
Haemocytometer
ae ocyto ete for
o ce
cell
number counting
Side arm flask to measure settled cell
volume (note red callus in side arm)
Centrifuge to spin down cells to determine
packed cell volume
mL células / mL medio
Comparación entre peso fresco y peso seco
índice de viabilidad que indica la cantidad de células
vivas presentes en un cultivo.
IV= n
nº de células viables / nº
n total de células
Uso de colorantes vitales:
A l de
Azul
d Evans:
E
tiñ solo
tiñe
l a las
l células
él l muertas
t de
d color
l
azul intenso, pudiéndose entonces realizar un recuento
de células viables.
Diacetato de fluoresceína se basa en la
captación y clivaje intracelular del mismo por
acción de las esterasas activas presentes en
células vivas, lo q
que da como resultado la
generación de un compuesto fluorescente que
para visualizarse requiere de iluminación
ultravioleta.
lt
i l t
™ Células intactas: alta fluorescencia
™ Células dañadas: fluorescencia débil
™ Células muertas: no fluorecen
450-480 nm
1 mm
0.1 mm
1 mm
Volume : 0.1mm3
1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3
Dead cell
Methods
1)
2)
3))
4)
5)
6)
7))
8)
9)
Clean hemocytometer & coverslip and wipe with 70% alcohol
b f
before
use
Place coverslip on hemocytometer
Mix the cell suspension
p
ggently
y
Aliquot 0.1 ml cell suspensions
Add 0.1 ml (2-fold dilution), 0.3 ml (4-fold dilution) or 0.9 ml (10fold dilution)
dil tion) trypan
tr pan blue
bl e : appropriate range of cells to be counted
co nted
Draw a sample into a Pasteur pipette after mixing
Draw the cell suspension
p
in to fill the chamber
Using a light microscope at low power, count the number of cells
Count the viable & non-viable cells in both halves of the chamber
Calculations
A = Vol. Of cell solution (ml)
B = Dilution factor in dying agent
C = Mean number of unstained cells
D = Mean number of dead/stained cells
104 = Conversion of 0.1 mm3 to ml
(1) Total number of viable cells
A Ⅹ B Ⅹ C Ⅹ 104
(2) Total dead cell count
A Ⅹ B Ⅹ D Ⅹ 104
(3) To give a total cell count
Viable cell count + dead cell count
(4) % viability
(Viable cell count/Total cell count) Ⅹ 100
Example
p
1) Vol. : Volume
2) CS : Cell Solution
3) EB : Evans blue
Dilution factor Vol. of Cell count
CS
Total viable cells
0.1 ml CS +
0.1 ml EB (2)
20 ml
23
20Ⅹ2Ⅹ23Ⅹ104 = 9.2 Ⅹ106 cells
0.1 ml CS +
0.3 ml EB (4)
15 ml
//
15Ⅹ4Ⅹ23Ⅹ104 = 1.38 Ⅹ107 cells
00.11 mll CS +
10 ml
0.9 ml EB (10)
//
10Ⅹ10Ⅹ23Ⅹ104 = 2.3 Ⅹ107 cells
pH
(5.5- 6.0 antes de autoclavar)
En suspensiones es importante porque determina
la solubilidad de sales y el uptake
p
de nutrientes
＊ Factores que afectan el ciclo de crecimiento:
1 IIntervalo
1.
t
l de
d subcultivos
b lti
Subculture at stationary phase
Alargamiento de
fase lag
Ciclos de cultivo más prolongados
Disminución de μ
＊ Factores que afectan el ciclo de crecimiento:
1 IInterval
1.
Intervalo
t
l offde
dsubculture
subcultivos
b b lt lti
subcultivo
Subculture
enatla log
fasephase
log
Short
Short
＊
: que afectan el ciclo de crecimiento:
＊Factors
Factores
2 Densidad celular inicial
2.
Alta densidad inicial
fase lag corta
Baja densidad inicial
fase lag larga
fase exponencial larga
＊ Factores
＊
Factors que
: afectan el ciclo de crecimiento:
2. Densidad inicial en los subcultivos
En general
general, 0.5
0 5 – 2.5
2 5 X 105 cells / mL