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Preparación de plantas transgénicas expresando la sintasa de óxido nítrico de
Synechococcus. Respuesta a la deficiencia de nitrógeno.
El óxido nítrico (NO) es un radical libre y una molécula señal en animales, bacterias,
plantas y hongos. Específicamente en plantas, el NO cumple un rol importante en
diversas respuestas de defensa a patógenos, estreses abióticos y procesos de crecimiento
y desarrollo. El tratamiento con dadores de NO protege a las plantas de los daños
producidos por el herbicida metil viológeno, deficiencia de hierro, exposición a
radiación UV-B y sequía, entre otros. El NO además interviene en diversos procesos
como germinación, crecimiento de raíces y pelos radicales. En mamíferos, el NO es
sintetizado principalmente por la enzima NO sintasa (NOS).
En plantas superiores, se han propuesto varias vías de producción de NO. Aunque la
presencia de una enzima NOS en plantas ha sido controversial. El análisis
bioinformático de genomas completamente secuenciados en plantas superiores, carecen
de secuencias con homología a las proteínas NOS de animales, sugiriendo que la
actividad NOS observada en plantas proviene de una enzima diferente de aquella
presente en animales. Sin embargo, en el año 2010 ha sido caracterizada la primer
enzima con actividad NOS en el reino vegetal, perteneciente al alga verde unicelular
marina Ostreococcus tauri. La actividad de la proteína NOS de O. tauri (OtNOS) es
importante durante la etapa exponencial del crecimiento del alga y durante la
aclimatación a diferentes intensidades lumínicas. Una búsqueda de secuencias
homólogas a OtNOS permitió identificar la secuencia NOS de la cianobacteria fijadora
de nitrógeno Synecochoccus PCC 7335 (SyNOS). SyNOS presenta una característica
muy peculiar que la diferencia de otras NOS identificadas hasta el momento, y es la
presencia de un dominio globina en el extremo N-terminal. OtNOS y SyNOS son las
únicas NOS estudiadas hasta el momento en organismos fotosintéticos.
Las plantas de Arabidopsis thaliana que expresan el transgén OtNOS bajo el control de
un promotor inducible por estrés, poseen niveles incrementados de NO en hojas y raíces
y una mayor tolerancia al déficit hídrico, estrés salino y oxidativo.
Por otra parte, bacterias de Escherichia coli que expresan las proteínas NOS (OtNOS y
SyNOS) en medios de cultivo con diferentes relaciones de C/N crecen con mayor
velocidad que las bacterias control, mostrando una mayor capacidad de adaptación a la
deficiencia nutricional específicamente de N.
Uno de los factores que afecta severamente el crecimiento y desarrollo de los cultivos es
el estrés nutricional. El N es un macronutriente esencial necesario en la biosíntesis de
nucleótidos, aminoácidos, proteínas y enzimas. En general las plantas deficientes en N
presentan un pobre crecimiento y una baja productividad.
A fin de abordar este último problema, utilizaremos una estrategia alternativa, mediante
la transformación de plantas de Arabidopsis con el gen de un cianobacteria que codifica
por una NOS canónica. Se utilizará el gen de Synecochoccus PCC 7335, el cual será
puesto bajo control del promotor constitutivo 35S del virus del mosaico del coliflor y de
un promotor inducible por condiciones ambientales adversas (Hahb de girasol). Las
construcciones resultantes serán introducidas en plantas mediante transformación con
Agrobacterium. Las plantas transformadas serán seleccionadas y posteriormente
ensayadas respecto a su tolerancia a la deficiencia de N mediante determinaciones
fisiológicas y bioquímicas. Asimismo se determinará la expresión de genes asociados al
metabolismo del N y transportadores del mismo utilizando técnicas de biología
molecular.