Imprimir este artículo - Revista de Investigaciones de la Facultad de

Ciencias Agronómicas
Artículo Original / Recibido 24/09/2010 - Aceptado 03/05/2011
R E V I S TA D E I N V E S T I G A C I O N E S D E L A FA C U LTA D D E C I E N C I A S A G RA R I A S - U N R
Efecto del hidroximetil furfural sobre el crecimiento de
hongos en pan de molde
Effect of hydroxymethylfurfural on fungi growth in sliced bread
1
1
RUIZ GARCÍA, M. ; RAMÍREZ DE LARA, M.C. ; ANTOLÍN GIRALDO, G.
1,2
1
CARTIF Centro Tecnológico, División Químico-Alimentaria.
Parque Tecnológico de Boecillo, Parcela 205. 47151 Valladolid. (España)
2
Universidad de Valladolid, Departamento Ingeniería Química y Medioambiental
E.T.S.I.I. de Valladolid, (España)
[email protected]
Resumen
Abstract
A partir de ensayos previos de fermentación en estado sólido de
cortezas de pan de molde para enriquecimiento proteico
realizados con cuatro cepas de hongos filamentosos, se observó
cómo su crecimiento se veía inhibido en mayor o menor medida.
Para comprobar si el hidroximetilfurfural (HMF) era el causante
de esta inhibición, se determinó la concentración a la que estaba
presente en las muestras (miga y corteza de pan de molde). La
extracción del HMF se realizó utilizando dos procedimientos de
extracción, y se puso a punto un método cromatográfico de
análisis (HPLC-UV) para la cuantificación del HMF en los
extractos. Por último, los hongos se sembraron sobre placas de
PDA sin HMF y con HMF a dos concentraciones diferentes, así
como placas de PDA con discos de papel de filtro empapados en
tres concentraciones diferentes de HMF. Los resultados
mostraron que las concentraciones de HMF ensayadas no
resultaron inhibitorias sobre el crecimiento de los hongos.
From previous solid state fermentation (SSF) tests for protein
enrichment of sliced bread crusts, carried out with four strains of
filamentous fungi, it was observed that fungal growth was
inhibited to a certain extent in all of them. In order to verify if
hydroxymethylfurfural (HMF) was relevant in this inhibitory
effect, a procedure to extract the HMF from the samples (crumb
and crust) was carried out following two different protocols,
along with a the fine-tuned chromatographic method (HPLCUV) to quantify HMF in the extracts. Finally, the fungi studied
were cultivated on PDA plates added with HMF at two different
concentrations, and on PDA plates with paper discs soaked in
three different concentrations of HMF. The results showed that
the tested concentrations of HMF were not inhibitory of fungal
growth.
Keywords:
hydroxymethylfurfural, sliced bread, , filamento us fungi
Palabras clave:
hidroximetilfurfural, pan de molde, hongos filamentosos
Introducción
La fabricación del pan implica tres etapas: mezclado de la masa
(harina, agua, levadura, y sal), la fermentación de la masa, y el
horneado. Durante el proceso de horneado, el almidón se
gelatiniza y las proteínas se desnaturalizan a una temperatura
interna de 60-80ºC y entonces la masa cruda se transforma en un
producto ligero, poroso, y digestible.
Las reacciones químicas implicadas en este proceso son
principalmente la reacción de Maillard y la caramelización. La
reacción de Maillard se favorece en alimentos con alto contenido
en proteína y carbohidratos y un contenido intermedio en
humedad a temperaturas superiores a 50ºC y a un pH entre 4-7,
produciendo cambios en el color (melanoidinas), sabor
(aldehídos y cetonas), propiedades funcionales, y valor
nutricional (bloqueo o destrucción de lisina). La caramelización
(degradación de azúcares) necesita condiciones más drásticas
(temperaturas superiores a 120ºC, pH <3 o pH >9, y baja Aw). La
distribución del contenido de agua y la temperatura juegan un
papel importante en el desarrollo de las características
sensoriales de estos productos. Durante el horneado, el
contenido de agua sobre la superficie del trozo llega a ser inferior
que en el medio y esto, combinado con la alta temperatura, es uno
de los factores que hace la corteza diferente de la miga.
El hidroximetilfurfural, HMF o 5-(Hidroximetil)furfural es un
aldehído y un furano, intermediario en la reacción de Maillard
que también se forma por la degradación de azúcares a elevadas
temperaturas. Este indicador, utilizado para evaluar los efectos
del calor inducidos durante el tostado del pan de molde
(Ramírez-Jiménez et al, 2000), se ha identificado en una amplia
variedad de alimentos procesados incluyendo leche, jugos de
frutas, bebidas alcohólicas, miel, etc., se conoce como
mutagénico y carcinogénico, y puede formarse durante las
reacciones el pardeamiento no enzimáticas, en forma de
reacciones de condensación entre los aminoácidos y los azúcares
reductores.
Por otra parte, se sabe que entre los inhibidores de algunos
procesos de fermentación, se encuentran los compuestos
furánicos y en concreto el furfural y el HMF, de los que se ha
demostrado que reducen la velocidad específica de crecimiento
de diversos microorganismos (Navarro, 1994), el rendimiento de
masa celular sobre el ATP (Palmqvist et al., 1999) y el
rendimiento volumétrico (Navarro, 1994). En estos casos, estos
compuestos inhibidores de la fermentación posterior se generan
durante tratamientos térmicos o hidrolíticos previos que son
necesarios para que los microorganismos fermentativos puedan
acceder a los azúcares. Entre los intentos para evitar el efecto
negativo de los inhibidores presentes en los hidrolizados, los
métodos mejor establecidos para la detoxificación del
hidrolizado incluyen la adición de resinas de intercambio iónico
(Horváth et al., 2004), la adición de carbón activo, la
detoxificación enzimática utilizando lacasa (Jönsson et al.,
1998) y la adición de cal. A pesar de sus beneficios, estos
Ciencias Agronómicas - Revista XVIII - Año 11 - 2011 / 027 - 031
-27-
Efecto del hidroximetil furfural sobre el crecimiento de hongos en pan de molde
métodos tienen ciertas limitaciones como la producción de
residuos o el aumento siginificativo de los costes de producción
(Zaldivar et al., 1999).
Por el contrario, la reducción por métodos microbiológicos
genera menos residuos, y puede realizarse directamente en el
reactor previamente al proceso de fermentación. Sin embargo,
hasta la fecha se han estudiado pocos procesos de tratamiento
biológico. Entre ellos, se ha descrito cómo el tratamiento con el
hongo Trichoderma reesei degrada inhibidores en un
hidrolizado de hemicelulasa consumiendo completamente
durante la fermentación las concentraciones de HMF y furfural
presentes en el hidrolizado (Palmqvist et al., 1997). Por otra
parte, también se ha descrito cómo un hidrolizado de biomasa
agrícola fue detoxificado en presencia del hongo Coniochaeta
ligniaria NRRL 30616 (teleomorfo) o su estado Lecythophora
(anamorfo), siendo después utilizado el sustrato en procesos de
fermentación industrial, especialmente en tratamientos de
sacarificación para la producción de bioetanol (Nichols et al.,
2006); también en otros estudios se ha demostrado cómo este
organismo es capaz de reducir de forma significativa los niveles
tóxicos, especialmente el nivel de furanos y particularmente del
5-Hidroximetilfurfural (5-HMF) (M.J. López et al., 2004).
Hasta el momento se han utilizado varios métodos para extraer y
cuantificar el HMF en alimentos. En matrices simples, como
miel o zumos de frutas, se ha propuesto un método colorimétrico
basado en la reacción del HMF con ácido tiobarbitúrico (TBA),
pero este método carece de especificidad ya que otros
compuestos carbonilo presentes o formados durante el proceso
pueden también reaccionar con el TBA, lo cual explica la
sobreextimación del HMF en algunos artículos. Así, en matrices
más complejas como los productos de cereales, leche y frutas se
utiliza normalmente una extracción con agua seguida de la
clarificación por Carrez (I y II) o ácido tricloroacético, antes de
la cuantificación por HPLC-UV (Ramírez-Jiménez et al., 2001).
El uso de técnicas HPLC permite obtener resultados más
precisos y además analizar varios compuestos en el mismo
análisis.
El presente trabajo se deriva de una investigación anterior cuyo
objetivo era el enriquecimiento proteico de los residuos de
corteza de pan de molde, mediante un proceso de fermentación
en estado sólido llevado a cabo por varias cepas de hongos
previamente seleccionadas. A partir de los resultados de este
estudio, se observó que el crecimiento de los hongos sobre
cortezas de pan de molde se veía inhibido en mayor o menor
medida. Como consecuencia, se planteó la posibilidad de que
existiera algún compuesto en el pan de molde que inhibiera total
o parcialmente el crecimiento de los hongos en estudio, o
resultara tóxico para ellos. Dado que entre los métodos de
inhibición de crecimiento de hongos se incluyen la adición de
compuestos como el 5-hidroximetilfuraldehído (HMF), y que la
formación de este compuesto durante la etapa de horneado del
pan de molde es un hecho constatado, las sospechas se centraron
en él.
El objetivo del estudio fue por tanto determinar la concentración
de HMF en las diferentes muestras de pan para evaluar si la
inhibición del crecimiento observada en las cepas de hongos en
estudio se debía a la presencia de este compuesto.
Materiales y métodos
Muestras
Las muestras sometidas a estudio consistieron en miga y corteza
de pan procedente de una planta de pan de molde de Grupo Siro
(España). Las muestras se secaron y molieron en la planta de
producción y se enviaron a Cartif para su tratamiento y análisis.
Microorganismos
Para comprobar el efecto de las concentraciones de HMF
determinadas mediante el método propuesto se utilizaron cuatro
cepas de hongos, dos de la especie Rhizopus oryzae (cepas 1 y 2),
una cepa de la especie Rhizopus stolonifer (cepa 3) y una cepa de
Aspergillus niger (cepa 4), todas ellas procedentes de la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT).
Determinación de la concentración de HMF en las muestras
en estudio
Para la determinación de las concentraciones de HMF presentes
en las muestras, se siguió un protocolo de extracción utilizando
dos procedimientos diferentes, y posteriormente, se puso a punto
un método cromatográfico (HPLC-UV) para cuantificar el HMF
en los extractos obtenidos.
Se utilizaron reactivos químicos de grado analítico. La solución
de clarificación consistió en Carrez I y Carrez II, y el patrón
externo utilizado en el análisis cromatográfico fue 5(hidroximetil)furfural (99%, Aldrich).
La determinación de la humedad en todas las muestras se obtuvo
por análisis gravimétrico después del secado en estufa a 105 ºC
durante 24 horas.
a) Métodos de Extracción de HMF: Se llevaron a cabo por
duplicado los dos procedimientos de extracción que se describen
a continuación.
-28-
Procedimiento A: Según García-Villanova et al. (1993) la
muestra molida (0,4 g) se pesó en un tubo de centrífuga de 10 ml
al que se añadieron 7 ml de agua desionizada. El tubo de
centrífuga fue agitado fuertemente durante 1 minuto y la muestra
se centrifugó durante 10 minutos a 5000 rpm. El mismo
procedimiento se realizó dos veces más. Los sobrenadantes
fueron clarificados con 0,5 ml de solución Carrez I y Carrez II.
La mezcla resultante se centrifugó durante 10 minutos a 5000
rpm. La solución se diluyó a un volumen total de 25 ml con agua
desionizada. Se filtró una alícuota de 2 ml de esta solución a
través de un filtro de disco de 0,2 micras antes de la inyección.
Procedimiento B: Siguiendo el método descrito por Ait Ameur et
al. (2006), la muestra molida (1 g) se pesó en un matraz de 25 ml
y se suspendió en 10 ml de agua desionizada y clarificada con 0,5
ml de solución Carrez I y 0,5 ml de solución Carrez II. La mezcla
se agitó fuertemente durante más de 5 minutos. El volumen de la
suspensión se ajustó a 25 ml con agua desionizada y se
centrifugó durante 8 minutos a 5000 rpm.
b) Análisis Cromatográfico: La concentración de 5-hidroximetil
furfural presente en los extractos obtenidos fue analizada por
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC-UV).
Previamente a su inyección en el sistema de cromatografía, todas
las muestras fueron filtradas a través de un filtro de nylon de 0,45
µm (Scharlau, Barcelona).
El cromatógrafo utilizado fue un equipo Agilent, modelo 1100.
Se inyectaron 20 L de la solución filtrada en una columna Pursuit
C-18 de 5 m (250 x 4,6 mm) (Varian, España) conectada a un
detector UV (diode array) a 284 nm. La velocidad de flujo fue de
1 ml/min y la temperatura de columna de 30ºC, utilizándose
como fase móvil agua desionizada. El HMF se separó en 8
Ciencias Agronómicas - Revista XVIII - Año 11 - 2011 / 027 - 031
Ciencias Agronómicas
Ruiz García, M.; Ramírez De Lara, M.C.; Antolín Giraldo, G.
minutos y el tiempo de ensayo fue de 15 minutos. Para la
calibración se utilizó el método del patrón externo, a partir de
una solución patrón madre se prepararon las soluciones patrón
de trabajo (0,1-0,5 mg/L).
Las concentraciones de la solución de HMF y la altura del pico
obtenido se consideraron como las variables para obtener la
ecuación de regresión lineal. Todos los análisis fueron realizados
por duplicado. Los resultados se expresan como mg de HMF por
Kg de muestra (corteza o miga) seca.
Estudio del efecto del HMF sobre el crecimiento de los
hongos
Como ya ha quedado demostrado (Palmqvist & Hahn Hägerdal,
2000), la interacción entre diferentes compuestos del sustrato
puede influir sobre el efecto inhibitorio del HMF en el
crecimiento de los microorganismos. Por eso, y para evitar que el
efecto del HMF quedara enmascarado, se utilizó como sustrato
el medio semisintético PDA (Potato Dextrose Agar,
composición en g/L: peptona de patata, 4,00; glucosa, 20,00;
agar, 15,00), al que se añadió HMF en concentraciones definidas
y similares a las obtenidas a partir de los análisis
cromatográficos de los extractos.
A) En medio PDA con HMF disuelto
Se prepararon placas con medio de cultivo PDA, al que se añadió
HMF en dos concentraciones diferentes: 4 mg/100 ml (H) y 2
mg/100 ml (H½) y placas con PDA sin HMF como control. En el
centro de estas placas se sembraron discos de 3 mm de diámetro
de un cultivo de cada una de las cuatro cepas en estudio (1-4), por
triplicado, resultando al final un ensayo con 36 placas (Tabla 1).
Para el cálculo de estas concentraciones de HMF se tomaron
como referencia los valores obtenidos en la determinación
cromatográfica de las muestras.
R E V I S TA D E I N V E S T I G A C I O N E S D E L A FA C U LTA D D E C I E N C I A S A G RA R I A S - U N R
La distribución de los discos en las placas de ensayo se muestra
en el esquema de la Figura 1. En el centro de cada una de las
placas así preparadas se sembró un disco de 3 mm de diámetro de
un cultivo de las cepas de los hongos en estudio. Las placas se
incubaron durante dos días a 24ºC.
Tabla 1: Planteamiento del ensayo en placas de PDA (potato dextrose
agar) con HMF (hidroximetilfurfural) disuelto.
CEPA 1 CEPA 2 CEPA 3 CEPA 4
Control (* )
CONCENTRACIÓN H½ (** )
CONCENTRACIÓN H
( *** )
1a
2a
3a
4a
1b
2b
3b
4b
1c
2c
3c
4c
1aH½
2aH½
3aH½
4aH½
1bH½
2bH½
3bH½
4bH½
1cH½
2cH½
3cH½
4cH½
1aH
2aH
3aH
4aH
1bH
2bH
3bH
4bH
1cH
2cH
3cH
4cH
3 Réplicas de cada ensayo (a, b, c)
(*) Placas de PDA sin hidroximetilfurfural (HMF)
(**) Placas de PDA con una concentración de 2 mg HMF/100 ml
(***) Placas de PDA con una concentración de 4 mg HMF/100 ml
Cepas 1 y 2 (Rhizopus oryzae), cepa 3 (Rhizopus stolonifer) y cepa 4
(Aspergillus niger)
Figura 1: Esquema de la distribución de los discos impregnados en
HMF (hidroximetilfurfural) en las placas de cultivo
B) En medio PDA con discos impregnados en HMF
Para eliminar la posibilidad de que el efecto potencial inhibidor
del HMF añadido fuese alterado al reaccionar con el medio, se
realizó un nuevo experimento consistente en colocar en las
placas de PDA, inoculadas posteriormente con las cuatro cepas,
discos impregnados con una disolución de HMF a distintas
concentraciones (0,5 g/l, 0,25 g/l y 0,05 g/l). Se colocó un cuarto
disco en cada placa impregnado en agua estéril como control.
Resultados y discusión
Determinación de la concentración de HMF en las muestras
en estudio
El uso de Carrez I y Carrez II como agentes de clarificación en
lugar de los ácidos clásicos (tricloroacético, metafosfórico,
sulfosalicílico) se recomienda en muchos estudios para
productos de cereales, como es el caso del sustrato en estudio,
debido a la posible producción de HMF a partir de la glucosa
presente en las matrices a valores bajos de pH (Ramírez-Jiménez
et al., 2000).
Los extractos obtenidos por ambos procedimientos fueron
analizados utilizando el método cromatográfico puesto a punto.
En la Figura 2 se muestran dos cromatogramas correspondientes
al análisis de dos extractos, de corteza (a) y miga (b) de pan
respectivamente, obtenidos a partir del procedimiento de
extracción B. Para el análisis de las diferentes muestras se utilizó
el mismo método y condiciones cromatográficas. La identidad y
pureza del HMF fue confirmada por un detector UV (diode
array).
La Tabla 2 muestra el contenido de HMF que presentaron las
muestras analizadas por cromatografía, correspondientes a miga
y corteza sometidas a los dos procedimientos de extracción de
HMF ensayados (A y B); los valores son la media de las réplicas
analizadas, una vez corregidos por el factor de dilución.
Como puede observarse, con el procedimiento A apenas existen
diferencias entre los valores obtenidos de HMF en corteza y
miga. Sin embargo, mediante el procedimiento B los niveles de
HMF detectados, el valor de la corteza es más de cuatro veces
superior que el de la miga, lo cual está más en consonancia con
los datos que aparecen en otros trabajos consultados (RamírezJiménez et al., 2000).
Estudio del efecto del HMF sobre el crecimiento de los
hongos
A) En medio PDA con HMF disuelto
Para evaluar el efecto del HMF sobre el crecimiento de las cepas
de hongos en estudio estaba previsto realizar la medida del
diámetro medio de las colonias de cada cepa en cada placa. Sin
embargo, al cabo de 48 horas el crecimiento llegó al borde de la
Ciencias Agronómicas - Revista XVIII - Año 11 - 2011 / 027 - 031
-29-
Efecto del hidroximetil furfural sobre el crecimiento de hongos en pan de molde
placa en todos los casos, no observándose ninguna diferencia
entre las placas con y sin HMF, por lo que no fue necesario
realizar el análisis estadístico.
los discos por lo que no parece existir ningún efecto inhibitorio
del HMF a las concentraciones ensayadas sobre el crecimiento
de los hongos.
A continuación (Figura 3) se presentan algunas imágenes que
muestran el aspecto de las placas correspondientes al
crecimiento de los hongos sobre medio PDA con distintas
concentraciones de HMF disuelto.
Los resultados obtenidos en ambos ensayos contrastan con lo
que ocurrido en los experimentos previos de fermentación para
enriquecimiento proteico realizados sobre pan de molde, en los
que ninguna de las tres cepas del género Rhizopus fue capaz de
crecer a diferencia de las cepas de Aspergillus.
B) En medio PDA con discos impregnados en HMF
El objetivo fue observar si el crecimiento fúngico quedaba
inhibido en contacto directo con una disolución de HMF y, si así
fuera, a partir de qué concentración resultaba inhibitorio.
En este caso, a partir de los resultados (Figura 4) se observa
cómo a los dos días de la inoculación las cuatro cepas invadieron
la placa siendo por tanto capaces de crecer perfectamente sobre
Además, los datos procedentes del análisis cromatográfico de
los dos extractos (A y B) también parecen confirmar estos
resultados, ya que los valores de concentración de HMF
encontrados tanto en miga como en corteza, fueron inferiores a
los niveles indicados en la bibliografía como inhibidores del
crecimiento de hongos (Nichols et al., 2006).
Figura 2: Cromatogramas correspondientes los extractos de pan, corteza (a) y miga (b), respectivamente, obtenidos a partir del procedimiento B de
extracción de HMF (hidroximetilfurfural) descrito en el artículo.
Tabla 2: Concentración de hidroximetilfurfural (mg HMF/kg pan seco) presente en las muestras analizadas, a partir de los dos procedimientos de
extracción descritos en el artículo (A, y B).
PROCEDIMIENTO A(mg HMF*/kg pan seco)
PROCEDIMIENTO B(mg HMF*/kg pan seco)
CORTEZA
4,12
11,97
MIGA
4,03
2,70
HMF* (hidroximetilfurfural)
Figura 3: Imágenes del aspecto del crecimiento de los hongos sobre placas de PDA a distintas concentraciones de hidroximetilfurfural (HMF). (a y b)
Aspecto de dos cepas de hongos, de izquierda a derecha: control (sin HMF), concentración ½H (2 mg HMF/100 ml) y doble concentración H (4 mg
HMF/100 ml); (c) Aspecto del crecimiento de cinco de las cepas ensayadas sobre placas de PDA; (d) Ensayo correspondiente a la cepa 1, donde el
hongo creció por igual en las placas control (sin HMF) y en las placas adicionadas con HMF a las dos concentraciones anteriores, H y ½H.
-30-
Ciencias Agronómicas - Revista XVIII - Año 11 - 2011 / 027 - 031
Ciencias Agronómicas
Ruiz García, M.; Ramírez De Lara, M.C.; Antolín Giraldo, G.
R E V I S TA D E I N V E S T I G A C I O N E S D E L A FA C U LTA D D E C I E N C I A S A G RA R I A S - U N R
Figura 4: Imágenes del aspecto del crecimiento de las cuatro cepas sobre los discos impregnados en hidroximetilfurfural (a = Cepa 1, b= Cepa 2,
c= Cepa 3, d= Cepa 4)
Conclusiones
Tras el estudio realizado se puede concluir que la inhibición del
crecimiento de las cepas ensayadas sobre el pan no está
provocada por el hidroximetilfurfural presente en el sustrato ya
que los niveles encontrados están lejos del mínimo propuesto por
otros autores. Habría que estudiar otros motivos que se
relacionen con esta inhibición, para lo cual se propone continuar
la investigación centrándose en las causas más probables
establecidas en estudios previos.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido realizado para el Grupo Siro, en el marco del Proyecto CENIT “Acuicultura Sostenible” (2007-2010,
ACUISOST), financiado por el Ministerio Español de Ciencia e Innovación.
Bibliografía
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
AIT AMEUR, L.; TRYSTRAM, G.; BIRLOUEZARAGÓN, I. 2006. Accumulation of 5-hydroxymethyl-2furfural in cookies during the backing process: Validation of
an extraction method. Food Chemistry, 98:790–796.
GARCÍA-VILLANOVA, B.; GUERRA-HERNÁNDEZ,
E.; MARTÍNEZ GÓMEZ, E.; MONTILLA, J. 1993.
Liquid chromatography for the determination of 5(hydroxymethyl)-2-furaldehyde in breakfast cereals. Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 41:1254-1255.
HORVÁTH, I. S.; SJÖDE, A.; NILVEBRANT, N.-O.;
ZAGORODNI, A.; JÖNSSON, L. J. 2004. Selection of
anion exchangers for detoxification of dilute-acid
hydrolysates from spruce. Applied Biochemistry and
Biotechnology, 113-116:525-538.
JÖNSSON, L. J.; PALMQVIST, E.; NILVEBRANT, N.O.; HAHN-HÄGERDAL, B. 1998. Detoxification of wood
hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot
fungus Trametes versicolor. Applied Microbiology and
Biotechnology, 49(6):691-697.
LÓPEZ, M. J.; NICHOLS, N. N.; DIEN, B. S.;
MORENO, J.; BOTHAST, R. J. 2004. Isolation of
microorganisms for biological detoxification of
lignocellulosic hydrolysates. Applied Microbiology and
Biotechnology, 64(1):125-131.
NAVARRO, A. R. 1994. Effects of furfural on ethanol
fermentation by Saccharomyces cerevisiae: Mathematical
models. Current Microbiology, 29:87-90.
NICHOLS, N. N.; LÓPEZ, M. J.; DIEN, B. S.;
BOTHAST, R. J. 2006. Culture containing biomass acid
hydrolysate and Coniochaeta ligniaria fungus. Patente Nº.
US 7,067,303 B1.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
PA L M Q V I S T, E . ; H A H N - H Ä G E R D A L , B . ;
SZENGYEL, Z.; ZACCHI, G.; RÈCZEY K. 1997.
Simultaneous detoxification and enzyme production of
hemicellulose hydrolysates obtained after steam
pretreatment. Enzyme and Microbial Technology, 20:286293.
PALMQVIST E.; ALMEIDA J. S.; HAHN-HAGERDAL
B. 1999. Influence of furfural on anaerobic glycolytic
kinetics of Saccharomyces cerevisiae in batch culture.
Biotechnology and Bioengineering, 62:447-54.
PALMQVIST, E. & HAHN-HÄGERDAL, B. 2000.
Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: inhibition
and detoxification. Bioresource Technology, 74:17±24.
PALMQVIST, E. & HAHN-HÄGERDAL, B. 2000.
Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors
and mechanisms of inhibition. Bioresource Technology,
74:25±33.
RAMÍREZ-JIMÉNEZ, A.; GUERRA-HERNÁNDEZ,
E.; GARCÍA-VILLANOVA, B. 2000. Browning Indicators
in Bread. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
48:4176-4181.
RAMÍREZ-JIMÉNEZ, A.; GARCÍA-VILLANOVA, B.;
GUERRA-HERNÁNDEZ, E. 2001. Effect of toasting time
on the browning of sliced bread. Journal of the Science of
Food and Agriculture, 81:513-518.
ZALDIVAR, J.; MARTÍNEZ, A.; INGRAM, L. O. 1999.
Effect of selected aldehydes on the growth and fermentation
of ethanogenic E. coli. Biotechnology and Bioengineering,
65:24-33.
Ciencias Agronómicas - Revista XVIII - Año 11 - 2011 / 027 - 031
-31-