enterococos: procedimientos de aislamiento e identificación en el

ENTEROCOCOS: procedimientos de aislamiento e identificación en el laboratorio
ENTEROCOCOS: PROCEDIMIENTOS DE AISLAMIENTO
E IDENTIFICACIÓN EN EL LABORATORIO
Loretta Durán
Esther Damiani
Christian Trigoso
RESUMEN
Los diferentes miembros del género Enterococcus han asumido un papel muy
importante entre las causas de infecciones intrahospitalarias. El creciente número
de infecciones causadas por dichos organismos y el progresivo desarrollo de
resistencia antimicrobiana hacen que su precisa identificación hasta el nivel de
especie y la determinación de su perfil de susceptibilidad antimicrobiana sean de
alta importancia para el laboratorio de bacteriología.
El presente estudio resume los procedimientos actualmente recomendados
para el aislamiento, identificación y determinación de la susceptibilidad
antimicrobiana de estos patógenos en laboratorios clínicos de bacteriología.
Correspondencia:
[email protected]
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Vigilancia, prevención y control de infecciones asociadas a servicios de salud
INTRODUCCION
Los enterococos son cocos Gram positivos que constituyen parte de la flora
normal del intestino humano y de animales. La dos especies de este género que
causan infecciones humanas con mayor frecuencia son Enterococcus faecalis y
Enterococcus faecium. (1)
Inicialmente se los reconoció como patógenos de infecciones urinarias,
bacteriemias y como causa infrecuente de endocarditis bacteriana subaguda.
En los últimos 20 años los Enterococcus vienen adquiriendo una inusitada
importancia hospitalaria, de hecho se los considera como la segunda causa
más frecuente de infecciones del tracto urinario (ITU) y la tercera causa de
bacteriemia nosocomial. También son causa de endocarditis bacteriana subaguda
y de abscesos intraabdominales. La terapia antimicrobiana masiva y la capacidad
intrínseca de resistir la acción bactericida de muchos antibióticos hacen posible
la supervivencia de dichos microorganismos en el entorno hospitalario. Por si
solos no presentan una alta virulencia ni capacidad de invasión de los tejidos, es
por lo que las infecciones solo se producen en determinados puntos anatómicos.
Los estreptococos fueron observados y descritos por primera vez a partir
de sepsis puerperal (Pasteur) y en infecciones de heridas (Koch). La frecuencia y
la importancia de las infecciones causadas por ellos fueron anotadas por Ogston,
Fehleisen y Rosenbach a mediados de la década de 1880. Griffith (1928),
estudiando la correlación de especificidad y patogenicidad de los neumococos,
descubrió el fenómeno de transformación sirviendo de base para la demostración
de Avery, Mc. Leod y Mc Carty (1994) de que los caracteres genéticos radicaban
en el DNA.
En la década de 1930 Lancefield diseñó un sistema de tipificación
serológico en el que se clasificó a los enterococos como Streptococcus tipo
D, incluyendo en el grupo al Streptococcus bovis. En 1937 Sherman clasificó
a los estreptococos en los siguientes grupos: piógenos, lácticos, viridans y
enterococos. Dicha clasificación se mantuvo hasta la década de 1980 cuando
avances en taxonomía basados en el análisis del ácido nucleico mostraron que
los enterococos ameritaban su designación como un género separado. De esta
manera Streptococcus faecalis y S. faecium se convirtieron en Enterococcus
faecalis y E. faecium, respectivamente. (2) Subsecuentemente se reclasificaron
otras especies de estreptococos y se reconocieron nuevas especies dentro de
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este género. En el momento actual se reconocen más de 12 especies dentro
del género, de las cuales pocas son patógenos humanos. Tradicionalmente, la
mayoría de estas infecciones ha sido causada por E. faecalis. Sin embargo, en
los últimos 15 años la incidencia de infecciones causadas por E. faecium, el cual
es muchas veces multiresistente, ha aumentado en forma muy rápida. En los EE.
UU. la distribución por especie entre las bacteriemias causadas por enterococos
muestra los siguientes porcentajes: E. faecalis 60%, E. faecium 20%, E. rafinosus
2.0%, E. durans 0.5%, E. avium 0.5%, E. gallinarum 0.5%, E. casseliflavus y
Enterococcus spp. 16%.
Los laboratorios de bacteriología tradicionalmente utilizan las siguientes
características para identificar a los enterococos: reacción bilis esculina positiva,
reacción con anticuerpos del Grupo D positiva y habilidad de crecer en ClNa al
6.5%. Sin embargo pueden surgir algunas dificultades de interpretación utilizando
dichas características. Por ejemplo, en algunas cepas es difícil identificar la
reacción con el anticuerpo D. Los lactococos también pueden crecer en ClNa
al 6.5% y/o ser bilis esculina positivos; sin embargo, los lactococos no crecen o
crecen muy lentamente a temperatura de 45 °C.
Existen dos otros géneros (Pediococcus y Leuconostoc) que comparten
muchas de las características bioquímicas de los enterococos y que también
producen antígenos del Grupo D y pueden crecer a temperatura de 45 °C.
Dichos organismos son intrínsicamente resistentes a la vancomicina, lo cual
permitía su separación de los enterococos antes de que surgieran las cepas de
enterococos resistentes a la vancomicina (ERV). Actualmente, se separa dichos
géneros de los ERV por la producción de pirrolidonilarilamidasa (PIR) y leucina
aminopeptidasa (LAP). En dichos casos las reacciones típicas son las siguientes:
+/+ para enterococos; +/- para Pediococos; y -/- para Leuconostoc. Este último
también produce gas de la glucosa. (3)
Previa la aparición de los ERV no se justificaba tratar de identificar a los
enterococos en el laboratorio hasta el nivel de especie puesto que 90% de las
infecciones eran causadas por E. faecalis, susceptible a la ampicilina. Dicho
panorama ha cambiado drásticamente con el desarrollo de resistencia y sobre
todo con la aparición de cepas resistentes a la vancomicina, la mayoría de las
cuales son E. faecium pero también incluyen E. casseliflavus y E. gallinarum. Por
esta razón en la práctica laboratorial actual es necesario poder identificar hasta el
nivel de especie. Dicho nivel de especificación es útil al seleccionar antibióticos
para infecciones severas puesto que existen diferencias en la susceptibilidad
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antimicrobiana de las diferentes especies de enterococos. Igualmente es útil
para detectar brotes de infecciones nosocomiales o para determinar si un mismo
paciente con infecciones repetidas por enterococos sufre de relapsos de infección
a causa de tratamiento no adecuado o de nuevas infecciones.
Se diferencian las especies de enterococos por una serie de pruebas que
incluyen la acidificación de carbohidratos, hidrólisis de la arginina, tolerancia
a la telurita, motilidad y pigmentación. Por ejemplo, las cepas de E. faecalis
característicamente toleran a la telurita y producen colonias de color negro. Las
especies motiles incluyen a E. casseliflavus (E. flavescens) y E. gallinarum.
E. casseliflavus y E. mundtii producen pigmento amarillo. La motilidad y la
producción de pigmento son particularmente útiles en diferenciar E. gallinarum
y E. casseliflavus de E. faecium aunque se reconoce que algunas cepas pueden
mostrar reacciones atípicas.
La identificación de los enterococos hasta el nivel de especies puede ser
complicada a causa de las múltiples pruebas requeridas y la existencia de cepas
con características fenotípicas atípicas. (4) Por estas razones, los laboratorios de
referencia han utilizado pruebas de biología molecular para dicho propósito.
(5-7)
Desde el punto de vista práctico el mayor imperativo es poder identificar
las cepas de E. faecalis y de E. faecium y de poder establecer sus perfiles de
susceptibilidad. Es útil reconocer que las cepas de E. faecalis son susceptibles a la
ampicilina y resistentes a la quinupristina-dalfopristina y las cepas de E. faecium
son resistentes a la ampicilina y susceptibles a la quinupristina-dalfopristina.
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Flujograma para la identificación del género Enterococcus
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300
α, β, γ
α, β, γ
-
+
+
+
+ *
+
+ *
+
- *
- *
Hemólisis
Catalasa
Cl Na 6,5%
Bilis esculina
Crecimiento a 45 ºC
Hidrólisis Arginina
Hidrólisis Piruvato
Sorbitol
Manitol
Rafinosa
Arabinosa
+ *
+ *
+
-
-
+
+
+
+
-
E. faecium
E. faecalis
Prueba Bioquímica
-
- *
-
-
+
+
+
+
+
-
α
E. durans Tabla de interpretación de Pruebas Bioquímicas
-
+*
+
-
-
-
-
+
-
-
α, γ
S. bovis
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TABLA2. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS
UTILIZADAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES DE ENTEROCOCCUS Y
ALGUNAS ESPECIES RELACIONADAS DE COCOS GRAM POSITIVOS
a Abreviaturas y símbolos MAN, manitol; Sor, sorbosa;ARG, arginina; ARA, arabinosa; SBL, sorbitol;
RAF, rafinosa; TEL, 0.04% telurito; MOT, mobilidad; Pig, pigmento; SUC, sucrosa; PYU, piruvato;
MPG, metil-o-Dglucopiranosido; +,90% o más de las cepas son positivas; -,10% o menos de las cepas
son positivas; V variable(11 al 89% de las cepas son positivas).
b Caraterísticas fenotípicas basadas en datos de la cepa tipo.
c Las características fenotípicas de E. porcinus son idénticas a las de E. villorum. Estas dos especies
recientemente descriptas corresponden a un solo taxon.
d Existen excepciones (-3% de cepas que muestran reaccines aberrantes)
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