UNIDAD 4: Purificación y cuantificación de lípidos de membrana

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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA, BIOLOGIA MOLECULAR Y FARMACOLOGIA
CURSO: PRACTICAS DE LABORATORIO EN BIOQUIMICA
2007
UNIDAD 4: Purificación y cuantificación de lípidos de membrana
Profesor Responsable: Carla Gallo
Principio:
Debido a que los lípidos son moléculas insolubles en agua, su extracción y posterior separación o
fraccionamiento requiere del uso de solventes no polares.
En términos generales, las mezclas complejas de lípidos (como las que componen las membranas
biológicas) son separadas por diferencias en la polaridad o solubilidad de éstas moléculas en
solventes no polares.
Práctica #13: Purificación de lípidos de membrana, cuantificación de colesterol de
membrana
Los lípidos neutrales, como triglicéridos, ceras y pigmentos, son fácilmente extraídos de tejidos con
solventes como eter etílico, cloroformo o benceno. Estos solventes no permiten la agregación que
causa las interacciones hidrofóbicas entre lípidos.
Los lípidos de membrana, sin embargo, son extraídos de manera más efectiva mediante solventes
orgánicos más polares como etanol o metanol, ya que además de reducir las interacciones
hidrofóbicas entre lípidos, estos solventes también debilitan los puentes de hidrógeno y las
interacciones electrostáticas entre lípidos y proteínas de membrana.
Los solventes de extracción más utilizados para lípidos de membrana consisten en una mezcla de
cloroformo, metanol y agua, en una proporción tal que todos los componentes son miscibles entre sí
(forman una sola fase). Después que el tejido es homogenizado en este solvente para extraer todos
los lípidos, se agrega más agua al extracto, y la mezcla se separa en dos fases: metanol/agua (fase
superior) y cloroformo (fase inferior). Los lípidos permanecen en la fase clorofórmica y las moléculas
más polares como proteínas se parten en la fase metanol/agua.
La práctica consistirá en 3 partes:
1) extracción de lípidos de membrana de eritrocitos humanos,
2) cuantificación de fosfolípidos totales mediante la determinación de fósforo en los extractos, y
3) determinación del contenido de colesterol del extracto
NOTA IMPORTANTE: LOS ALUMNOS TRABAJARAN SOLAMENTE LAS PARTES 2 Y 3 DE LA
PRACTICA. RECIBIRAN YA PREPARADO, UN EXTRACTO DE LIPIDOS DE MEMBRANA
(suspendidos en en benceno/metanol (4:1) v/v con BHT al 0.05%) PARA LA DETERMINACION DE
FOSFOLIPIDOS Y COLESTEROL.
1) Extracción de Lípidos de Membrana (REFERENCIAL, NO SE TRABAJA EN PRACTICA)
Soluciones y solventes
− Solución de lavado (NaCl 0.9% en agua desionizada)
− Ditionite de sodio 9.57%
− KCl 0.37%
− Isopropanol/cloroformo (11:7) v/v
− Benceno/metanol (4:1) v/v
− Benceno/metanol (4:1) v/v con BHT (hidroxitolueno butilado (2,6-di-ter-butil-4-metilfenol)) 0.05%
− Agua desionizada y destilada
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PROCEDIMIENTO
Preparación de los eritrocitos
Se trabajará con sangre total anticoagulada con citrato.
− Centrifugar la sangre a 1500 g por 10 minutos y separar el plasma y los glóbulos blancos
− Lavar los eritrocitos 3 veces (1500 g por 5 minutos) con la solución de lavado en una proporción
1:10 v/v.
− Homogenizar suavemente el pellet de eritrocitos y separarlo en fracciones de 0.5 ml
− Agregar un volumen igual de solución de lavado y 100 µl de solución de ditionite 9.57%
− Realizar un hematocrito de la suspensión final (para conocer la proporción de eritrocitos en el
volumen total).
− En este paso la muestra se puede guardar en viales de criopreservación a -70°C si van a estar
almacenadas por un tiempo largo, o a -20°C, si el período de almacenamiento es corto.
Extracción de lípidos
− Si la muestra ha estado almacenada en frío, atemperar en baño maría a 37°C
− Tomar un volumen de 0.5 ml y transvasar a un tubo de vidrio de 15 ml con tapa esmerilada
− Añadir el mismo volumen de agua desionizada y destilada y 5.5 ml de isopropanol, agitar en vortex
y dejar reposar 15 minutos
− Añadir 3.5 ml de cloroformo, agitar en vortex y esperar 15 minutos
− Tapar el tubo con Parafilm™ y centrifugar a 1500 g por 5 minutos
− Filtrar el contenido del tubo sobre un filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/F) haciendo vacío en un
embudo de porcelana
− El tubo y el filtro se enjuagan con isopropanol/cloroformo (11:7) v/v, recuperando este volumen en
el tubo de extracción
− Agregar 1ml de cloruro de potasio 0.37%, y agitar en vortex
− Tapar el tubo con Parafilm™ y centrifugar a 1500 g por 5 minutos
− Retirar la fase acuosa (superior) por succión con una bomba de vacío, evitando tocar la fase
inferior
− Dejar reposar 10 minutos a 0°C
− Cubrir el tubo con Parafilm™ y centrifugar a 1500 g por 5 minutos
− Retirar la fase acuosa por succión con bomba de vacío, evitando tocar la fase inferior
− Medir el volumen del extracto y llevar a un volumen exacto entre 6 y 10 ml con
isopropanol/cloroformo (11:7) v/v
− Retirar una alícuota de 1 ml para determinar fósforo y colesterol, almacenándola en un vial de
vidrio color ámbar
− Evaporar el volumen restante del extracto bajo nitrógeno a 37°C
− En los últimos mililitros del extracto durante la evaporación, agregar de a pocos entre 1 y 2 ml de
benceno/metanol (4:1) v/v, y continuar evaporando. Si la muestra queda lechosa, agregar más
benceno/metanol.
− Una vez secada la muestra, resuspender adicionando inmediatamente 150 µl de benceno/metanol
(4:1) v/v con BHT al 0.05%
− Medir el volumen final de la muestra resuspendida y almacenar en 2 fracciones (medir los
volúmenes de cada fracción) a -70°C hasta su uso. Las muestras pueden ser almacenadas a 20°C, si el período de almacenamiento es corto.
Almacenamiento de los extractos lipídicos
− Si se van a almacenar los extractos por largo tiempo es conveniente guardarlos bajo nitrógeno en
viales de vidrio color ámbar. Los viales deben ser sellados para prevenir la oxidación de la
muestra. Previamente al sellado es conveniente congelar la muestra en nitrógeno líquido para
prevenir su oxidación durante el sellado. Para el caso de la práctica, los extractos se almacenarán
en viales de vidrio color ámbar, se cubrirán con Parafilm® y se almacenarán a -20 C.
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2) Determinación de fósforo
Soluciones y reactivos
− Reactivo A (ácido ascórbico 10% -preparar fresco-)
− Reactivo B (molibdato de amonio 0.42% en ácido sulfúrico 1 N)
− Solución de trabajo (1 volumen de reactivo A y 6 volúmenes de reactivo B)
− Solución stock de fósforo (KH2PO4 10 mM)
− Solución estándar (solución stock 1:10)
− Acido sulfúrico 10 N
− Acido perclórico 60%
− Agua desionizada y destilada
PROCEDIMIENTO
− Realizar una curva estándar de 0, 20, 40, 60 y 80 nmoles de fósforo inorgánico por tubo (0, 20, 40,
60 y 80 µl de estándar 1 mM)
− Colocar en cada tubo de muestra 48 µl de extracto lipídico
− Completar el volumen de todos los tubos (curva estándar y muestra) a 80 µl con agua desionizada
y destilada.
− Secar los tubos a 100°C
− Agregar 20 µl de ácido sulfúrico 10 N y 60 µl de ácido perclórico 60% a cada tubo
− Mineralizar en baño de arena a 190°C por 10 minutos
− Añadir 300 µl de agua (enjuagando la superficie del tubo), y 1.3 ml de la solución de trabajo.
Mezclar en vortex e incubar por 30 minutos a 37°C en baño maría
− Leer la absorbancia a 823 nm, contra el blanco
3) Determinación de colesterol
Soluciones y reactivos
− Tritón X-100 2.5% en cloroformo.
− Kit enzimático para la determinación de colesterol (Wiener Lab, Rosario, Argentina)
PROCEDIMIENTO
− Colocar 200 µl del extracto lipídico (muestra) en un tubo de ensayo
− Además, realizar una curva estándar agregando 0, 10, 20, 40 y 80 µl de standard de colesterol
2g/L. Completar a 200 µl con isopropanol/cloroformo (11:7) v/v: 200, 190, 180, 160 y 120 µl.
− Evaporar el solvente bajo nitrógeno
− Agregar 100 µl de Tritón X-100 al 2.5% en cloroformo
− Evaporar nuevamente bajo nitrógeno
− Agregar 2 ml de reactivo de colesterol (kit enzimático)
− Dejar reposar por 30 min
− Leer absorbancia a 505 nm, contra el blanco
CALCULOS
Determinar la concentración de fósforo y colesterol en las muestras, en base a la curva estándar.
Expresar los datos por volumen de eritrocitos.
Referencias
1. Rose HG and Oklander MJ. Improved procedure for the extraction of lipids from human erythrocytes. J Lip
Res . 65:428-431. 1965.
2. De Hoff JL An enzymatic assay for determining free and total cholesterol in tissue. Clin Chem . 24:433-435.
1978.
3. Higgins, J.A. Separation and analysis of membrane lipid components. En: Biological Membranes. A Practical
Approach. JBC Findlay y WH Evans, Editores. IRL Press - Oxford University Press. Oxford. 1990.
4. Kates M. Techniques of Lipidology. Isolation, analysis and identification of lipids .Series: Laboratory Techniques in
nd
biochemistry and molecular biology. RH Burdon and PH van Knippenberg (Editors). 2 Edition. Elsevier. 1986.