Comparación de metodologías para la determinación de toxinas paralizantes en bivalvos relacionadas con el Paralytic Shellfish Poisoning (PSP). Aplicación a la acuicultura en España Duración del proyecto: 3,5 años. 2007 financiación para inicio actividad 2008 – 2010, período de ejecución del proyecto. 2011‐ Prórroga de 6 meses 2012 – Informe Final 23 investigadores 3 subproyectos: Andalucía L.C.C.R.P. – Junta de Andalucía Cataluña IRTA (Coordinación) Departament de Salut Pública ICM – CSIC Galicia CIMA INTECMAR CSIC IIM – IEO Sanidad Exterior Contexto y objetivos PSP •Reglamento 854/2004 establece 800 μg eqSTX/Kg como límite máximo. •Reglamento 2074/2005 establece el Bioensayo ratón (MBA) como método oficial; aunque se aceptan métodos alternativos si se demuestra su eficacia. •Directiva 86/609/CEE referente a los animales de experimentación •Reglamento 1664/2006 se menciona como método alternativo el HPLC con derivatización pre‐columna(Lawrence); AOAC 2005.06 Nombre Abreviatura Toxicidad relativa MU/μmol (MBA) Saxitoxina Alexandrium tamarensis Alexandrium minutum Alexandrium catenella Alexandrium fraterculus Alexandrium fundyense Alexandrium cohorticula Alexandrium andersonii* Gymnodinium catenatum Pyrodinium bahamense STX 2483 1.0000 Gonyautoxina‐2 GTX2 892 0.3592 Gonyautoxina‐3 GTX3 1584 0.6379 Neosaxitoxina NEO 2295 0.9243 Gonyautoxina‐1 GTX1 2468 0.9940 Gonyautoxina‐4 GTX4 1803 0.7261 Gonyautoxina‐5 GTX5, B1 160 0.0644 N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐2 C1, epiGTX8 15 0.0060 N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐3 C2, GTX8 239 0.0963 Gonyautoxina‐6 GTX6, B2 160 0.0644 N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐1 C3 33 0.0133 N‐sulfocarbamoyl‐gonyautoxina‐4 C4 143 0.0576 dcSTX 1274 0.5131 Decarbamoylonyautoxina‐2 dcGTX2 382 0.1538 Decarbamoylonyautoxina‐3 dcGTX3 935 0.3766 Decarbamoylneosaxitoxina dcNEO, GTX7 Decarbamoylonyautoxina‐1 dcGTX1 Decarbamoylonyautoxina‐4 dcGTX4 Decarbamoylsaxitoxina Sector Necesidad Sector Necesidad Análisis obligatorios Aplicación de reglamentos 2007 219.661,05 Tn moluscos 3.900 análisis PSP Galicia 215.488,17 Tn moluscos > 3.000 análisis PSP Seguridad del producto Fiabilidad del sector Exportación Cataluña 3.341,78 Tn moluscos > 300 análisis PSP Andalucía 4450 Tn moluscos > 600 análisis PSP Metodologías Métodos oficiales Comparación De Métodos Oficiales / No oficiales Toxicológicios / Anticuerpos / Análiticos Cuantitativos / Cribado Bioensayo ratón HPLC con derivatización pre‐columna Métodos no oficiales HPLC con derivatización post‐ columna LC‐MS/MS Kits comerciales (screening) Citotoxicidad Resultados Episodios Molusco Fecha prohibición Fecha apertura Total días Mejillón batea 23/06/2008 07/07/2008 14 Camariñas Infaunal 24/06/2008 08/07/2008 14 Vigo IV.1 Infaunal 17/06/2008 26/06/2008 9 Vigo IV.2 Infaunal 19/02/2008 05/03/2008 14 Vigo IV.2 Infaunal 03/06/2008 18/07/2008 45 Vigo IV.2 Infaunal 26/08/2008 10/09/2008 15 Ría/Zona Gymnodinium catenatum aparece en el litoral atlántico de la provincia de Cádiz entre los meses de agosto y diciembre, con máximos centrados casi exclusivamente en agosto Baiona Especie fitoplancton Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Alexandrium sp. Relación de prohibiciones por toxicidad PSP en zonas de producción de moluscos infaunales y mejillón cultivado en viveros flotantes de Galicia en el 2008. Especie de fitoplancton Molusco Ría Periodo Total días A. minutun Infaunal Ares-Betanzos junio 30 A. minutun Infaunal Camariñas julio 28 A. minutun Berberecho Baiona VIGO-IV.2 junio-septiembre 88 En la siguiente tabla se resumen los episodios de cierre debidos a toxinas PSP en 2010. Todos han sido debidos a Alexandrium minutum. Resultados cultivos, muestras, exposiciones mar, exposiciones laboratorio Molusco Balones de cultivo de 8 L con Alexandrium minutum. IEO IRTA INTECMAR Almeja (blanco) Si Si Si Almeja nivel 420 µg/Kg Si Si Si Almeja nivel 950 µg/Kg Si Si Si Berberecho blanco Si No Si Berberecho nivel 450 µg/Kg Si No Si Berberecho nivel 1270 µg/Kg Si No Si Vieira (blanco) Si No Si Longueirón (blanco) Si No Si Relación de moluscos naturalmente contaminados con PSP en episodios de Alexandrium sp. Sala de “challenge” en la que se realizó la primera exposición en laboratorio X Localización de los puntos de exposición de los bivalvos durante la floración de A. minutum ocurrida en el puerto de Vilanova i la Geltrú entre el 8 y el 11 de abril de 2008. X % A.fundyense(CCMP1719) 35 30 25 20 15 10 5 0 ng μL-1 Puerto GTX4 GTX1 dcGTX3 dcGTX2 neoSTX STX toxinas Se muestra el perfil de toxinas y abundancia de las mismas en porcentaje para la cepa CCMP1719 de Alexandrium fundyense. Vilanova i la Geltrú Vilanova i la Geltrú Cambrils Bivalvo Mejillón Ostión Mejillón Ostión Mejillón Ostión Almeja GTX4 GTX1 GTX2 GTX3 0,62 0,16 0,37 0,00 0,00 0,00 3,23 0,66 0,24 0,24 0,01 0,02 0,00 0,00 0,48 0,14 0,24 0,01 0,00 0,00 0,00 0,03 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,01 μg STXeq kg-1 2.702,71 849,12 1.256,91 30,55 45,90 1,46 *4.926,41 Resultados MBA , MIST AlertTM, cultivos celulares Bioensayo ratón: Método AOAC Official Method 959.08. Paralytic Shellfish Poison. Biological Method. MIST AlertTM: Puede dar falsos positivos en valores cercanos al LMP. (Izquierda). Efecto sobre la viabilidad celular de un extracto de mejillón con dopaje de STX. (Derecha). Efecto sobre la viabilidad celular de un extracto de mejillón con dopaje de STX con paso adicional de purificación por columna C18. Resultados Extracciones, LC‐MS/MS En la fase de preparación de muestras a partir de moluscos nos encontramos con un paso de limpieza no resuelto actualmente y que limita en gran medida la duración de las columnas además de la habitual presencia de interferentes no tóxicos. Análisis de una muestra de Argopecten purpuratus conteniendo STX, GTX2 y GTX3, por el método de LC-MS/MS Es necesario el desarrollo de métodos de preparación de la muestra adaptados a tanto a las condiciones cromatográfica (HILIC) como a las de ionización en el espectrómetro de masas (ESI), antes de que se pueda utilizar para el control rutinario de la toxicidad de bivalvos. Resultados HPLC Pre‐Columna, HPLC Post‐Columna Pre Columna abreviado Aplicable con perfiles de Alexandrium en el Mediterráneo. Extracción Post Columna Andalucía Aplicable pero tiempo excesivo Purificación SPE-C18 Oxidación con periodato Análisis por HPLC-FLD AOAC HPLC Method 2005.06 Presencia picos No hay picos Ensayo MBA Muestra NEGATIVA Resultados Aplicabilidad Tiempo Costes REVISAR DADES INTECMAR Tiempo de ejecución del ensayo /análisis por muestra. Tiempo de muestra (h) MBA HPLC‐Pre HPLC‐ Pos * Jellet Andalucía: Laboratorio de Control de Calidad de los Recursos Pesqueros 3,7 ‐ 12,3 2,2 Galicia: Intecmar 1,5 3,5 ‐ Galicia: Centro de Investigacións Mariñas ‐ ‐ 2,1 ‐ Catalunya: Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries ‐ 1,0 ‐ 0,5 2,2 ‐ ‐ 1,4 Catalunya: Laboratori Salut Pública de Tarragona Coste de ejecución del ensayo /análisis por muestra. Coste muestra (euros) MBA HPLC‐Pre HPLC‐ Pos* Jellet Andalucía: Laboratorio de Control de Calidad de los Recursos Pesqueros 105,8 ‐ 392,7 96,6 Galicia: Intecmar 25,66/ 40,83 59,35 ‐ ‐ Galicia: Centro de Investigacións Mariñas ‐ ‐ 144,2 ‐ Catalunya: Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaries ‐ 116,6 ‐ 47,5 249,6 ‐ ‐ 118,6 Catalunya: Laboratori Salut Pública de Tarragona Resultados Adecuación por Autonomías, Futuro Andalucía: Bioensayo ratón Posible HPLC Post Columna pero requerimiento de infraestructuras complejas Galicia: Bioensayo ratón HPLC Post Columna representaría incremento de costes y nuevas inversiones Cataluña: Bioensayo ratón actualmente Posibilidad en un futuro: HPLC Pre Columna como screening Secundado por Bioensayo ratón Conclusiones Impacto Sector Algunas conclusiones: Consolidación de una red de laboratorios con acceso a diferentes metodologías que fortalece el potencial en España ante episodios por toxinas potencialmente conflictiivos Los perfiles toxínicos segúna las zonas de estudio pueden condicionar la eleccción de una metodología u otra adaptada a la región. La mejora e implementación de diferentes metodologías cromatográficas para el análisis de toxinas PSP aporta mayor resolución y definición de las toxinas paralizantes presentes, favoreciendo la predicción de potenciales eventos. Se identifican estrategias de screnning complementadas con protocolos de cuantificación de toxinas, y potencial aplicabilidad en Cataluña. En las otras comunidades a corto plazo no se preven cambios en cuanto a metodología de análisis. Sector: Los laboratorios de control disponen de mayores informaciones para toma de decisiones respecto a estrategias de vigilancia de toxinas PSP En circunstancias controladas los kits de Jellett podrían ser utilizados por el sector con la limitación de la existencia de algunos falsos positivos en presencia de toxinas PSP por debajo del MLP