ANALISIS DE COMUNIDAD: PERFIL DE UTILIZACION DE

CUARTA PARTE
ANALISIS DE COMUNIDAD: PERFIL DE UTILIZACION DE
FUENTES DE CARBONO
UNA COMUNIDAD MICROBIANA puede considerase como una unidad funcional que está
caracterizada por la sumatoria de sus propiedades metabólicas. Como alternativa, la
caracterización de estas comunidades puede evaluarse mediante análisis a nivel de
comunidad de patrones de utilización de fuentes de carbono. En este análisis
impresiones fisiológicas son obtenidas mediante la inoculación de microorganismos
derivados directamente de una muestra natural a microplacas que contienen diferentes
fuentes de carbono.
El sistema automatizado para la identificación rápida de microorganismos, Biolog®,
desarrolló en la década del '90 un sistema de microplacas de 96 fosas cada una
conteniendo una fuente única de carbono, nutrientes básicos y un indicador
colorimétrico. El indicador colorimétrico que utiliza este sistema es una sal de tetrazolium
que en su forma oxidada es incolora. Tetrazolium es un excelente agente oxidante de
NADH. Cuando un organismo responde positivamente a una fuente de carbono presente
en una de las fosas particulares, entonces este organismo generará NADH como
intermediario metabólico. A su vez, el NADH será oxidado por tetrazolium siendo este
último transformado al estado reducido. La sal de tetrazolium reducida es sin embargo de
coloración rosada. A mayor oxidación de una fuente de carbono, mayor producción de
NADH y por lo tanto mayor reducción de tetrazolium. Respuestas positivas en la
microplaca son fácilmente observadas y pueden ser cuatificadas mediante el uso de un
espectofotómetro (Figura 1).
PATRON UTILIZACION FUENTES DE CARBONO
Figura 1.
2
Análisis de patrones de utilización de fuentes de carbono a
nivel de comunidad.
BIOLOG® MICROPLACA
GN & GP
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Comunidad
Microbiana
MUESTRA DE
SUELO (10 g)
Extracción
microorganismos
y dilución seriada
Inocular
Microplaca
BIOLOG
A
B
C
D
E
F
G
H
Incubar Bajo Condiciones
Estándares y Monitorear
Cambios en Color Mediante
Densidad Optica
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ANALISIS
A
B
C
D
E
F
G
H
Esta estrategia permite una rápida caracterización de una comunidad heterotrófica.
Mediante este procedimiento se puede agrupar a las comunidades microbianaas a base
de diferencias en el tipo y el grado de utilización de los sustratos. Estas impresiones
fisiológicas son capaces de distinguir comunidades de diferentes suelos y comunidades
asociadas.
Materiales & Equipos:
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Microplacas Biolog® GN
Micropippeteador múltiple de 8 canales
Puntas desechables
Placas Petri estériles
Solución salina (0.85% NaCl)
Tubos de ensayo con 9 ml de solución salina
Botellas de dilución con 99 ml de solución salina
Vortex
Lector Automatizado de Microplacas
PATRON UTILIZACION FUENTES DE CARBONO
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METODOLOGIA
1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 a 20 g) de varios
lugares u obtenga muestras de agua (100 a 500 ml) de lagos, ríos o charcas.
2. Extracción de biomasa: Para muestras de suelo, las células podrán ser removidas y
homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml de
solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex (la extracción de
biomasa de muestras de suelo suele ser optimizada variando la solución de
extracción y el tiempo de extracción). Previo a inocular la microplaca Biolog,
transfiera 1 ml del extracto a una botella de dilución con 99 ml de solución salina. Para
muestras líquidas, proceda a concentrar la biomasa mediante centrifugación o
filtración. Resuspenda la biomasa concentrada en la solución salina ajustando la
turbidez final entre 55 a 60% T a 600 nm. Esta suspenión equivale a
aproximadamente 3 x 108 células por ml.
3. Inoculación de microplacas: Transfiera aproximadamente 20 ml del extracto a una
placa Petri estéril. Utilizando el micropipeteador de canales múltiples, transfiera desde
la placa de 125 a 150 µl de la suspensión celular a cada fosa de la microplaca
Biolog® GN. Incube la placa estáticamente a 25°C.
4. Lectura: Utilizando el Lector Automatizado de Microplacas, examine sus muestras a
las 24, 48 y 72 horas de incubación midiendo absorvancia a 650 nm. De no tener
disponible este instrumento, proceda a leer las microplacas visualmente asignando un
1 a aquellas fosas con colaración distintivamente rosada-púrpura, 0.5 a aquellas
fosas con intensidad intermedia y 0 a aquellas fosas sin coloración o similar a la
condición de la fosa control (no contiene fuente de carbono alguna).
Datos & Análisis:
Cada lectura de sus microplacas resultará en 96 observaciones correspondientes a a
cada fosa de la microplaca. La fosa número uno es el control sin fuente de carbono
alguna. Esta lectura será la lectura base para comparación de las restantes 95 fosas.
Para representar esquemáticamente los resultados, grafique en forma de histograma
siendo el eje de X las 95 fosas de la microplaca y el eje de Y la lectura de absorvancia de
cada fosa (Figura 2). De esta forma usted podrá general el análogo a un código de
barras representativo de su muestra. Los resultados del análisis tambien pueden ser
evaluados estadísticamente realizando análisis de componentes principales o análisis de
grupo.
PATRON UTILIZACION FUENTES DE CARBONO
Figura 2.
4
Código de barradas generado del perfil de utilización de
fuentes de carbono a nivel de comunidad. Estos perfiles
pueden utilizarse para compara similitudes o variaciones entre
comunidades.
ABS690
0.7
0.0
1234...
...95
SUSTRATOS BIOLOG
Observaciones:
PREGUNTAS...
1. ¿Qué grupos microbianos pueden influenciar el patrón de utilización de fuentes de
carbono? ¿Cuáles no influyen en el análisis?
2. Mencione y explique brevemente los factores abióticos que podrían afectar este
análisis.
3. ¿Cuáles son las funciones principales de la fosa control? Discuta al menos dos
funciones.
4. ¿Cómo afecta el tiempo de incubación las respuestas fisiológicas en la microplaca?
¿Qué tiempo de incubación entiende usted es el más apropiado? Justifique.