ID Bacterias

Métodos de ID Bacteriana
API
BIOLOG
FAME
VITEK
ARDRA
tRFLP
BOX/REP PCR
API
•
•
•
•
•
Tirilla plástica
Aprox. 20 pruebas bioquímica
Inspección manual
Código numérico
ID bacteriano (especialmente entéricas)
BIOLOG
• Microplacas 95 fuentes de carbono
• Tetrazolium: indicador de actividad
microbiana
• Perfil de utilización de fuentes de carbono
• Comparación computarizado Banco de
datos
• ID bacteriano
1
BIOLOG
BIOLOG® MICROPLACA
GN & GP
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Comunidad
Microbiana
MUESTRA DE
SUELO (10 g)
Desconoocido
Extracción
microorganismos
y dilución seriada
Inocular
Microplaca
BIOLOG
A
B
C
D
E
F
G
H
Incubar Bajo Condiciones
Estándares y Monitorear
Cambios en Color Mediante
Densidad Optica
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
ANALISIS
FAME
“Fatty acid methyl ester”
• Perfil de los ácidos grasos de la membrana
(tipo y abundancia de cada ác. Graso)
• Extracción, metilación, análisis por
cromatografía de gas (GC)
• Sensible al estado fisiológico del organismo
• ID bacteriano
Staphylococcus aureus
4
O
=
7
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
3
-
OH
Acido Graso 18:0
6
1
O
=
2
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
5
-
18:0 metil éster
=
O
0
10
MINUTOS
C-C-C-C-C-C-C-C-C=C-C-C-C-C-C-C-C-C
9
8
OH-CH3
10
1. C14:0
2. C14:0
3. C15:0
4. C15:0
5. C16:0
6. C17:0
7. C17:0
8. C18:0
9. C19:0
10. C20:0
Nombre
ISO
ISO
ANTEISO
ISO
ANTEISO
ANTEISO
Area%
4.52
2.10
9.96
37.97
3.05
6.33
20.02
1.48
5.70
0.70
20
-
OH
18:1 cis 9 (ó trans 9)
=
O
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
C
OH
19:0 ciclopropano
O
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
C-C-C
OH
19:0 anteiso
O
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
C-C-C
OH
OH
19:0 iso 3OH
OH
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
H
16:0 aldehído
O-CH3
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
O-CH3
16:0 dimetil acetal
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
COSECHA
=
-
-
-
Cultivo Fresco
(Transfiere del
tercer cuadrante)
Cuatro Transferencias a Tubo de Ensayo
SAPONIFICACION
-
=
-
Vortex
5-10 seg
Añade 1.0 ml
Reactivo #1
Vortex
5-10 seg
100o C
5 min
100o C
20 min
METILACION
=
-
-
-
-
-
Añade 2.0 ml
Reactivo #2
Vortex
5-10 seg
80o C
10 min
EXTRACCION
Añade 1.25 ml
Reactivo #3
Retenga
Fase de
Arriba
10 min
-
LAVADO
Añade 3.0 ml
Reactivo #4
Remueva Fase Inferior
Transfiera a
Vial de
Cromatografía
de Gas
10 min
Remueve 2/3
Partes de la
Fase Superior
Selle
FAME
2
VITEK
• Método rápido y costoso
• Tarjetas con pruebas bioquímicas
• Incubación y análisis (banco de datos)
simultáneo
• ID bacteriano (2-24 hrs)
ARDRA
“Amplified ribosomal DNA restriction analysis”
Amplificación del 16S rDNA
Corte con enzimas de restricción
Electroforesis de agarosa
Análisis de la tipificación genética
10
0
AC bp
A l
AC -V3adde
r
A
AC -V6
A
AC -A2
ACA-32
ACA-I
A
AC -F
AC A-G
AAC 31
ACA-34
A
AC -V1
A
AC -V2
ACA-33
AC A-V5
A
10 -2
0b
pl
ad
de
r
•
•
•
•
2,272 bp
600 bp
400 bp
200 bp
100 bp
3
“terminal restriction fragment length polymorphism”
tRFLP
• Variante de ARDRA, pero con primordios
fluorescentes
• Permite describir composición bacteriana en
comunidades
• Utiliza
BOX/REP PCR
• Método rápido de tipificación genética
• Amplificación de DNA entre regiones
repetitivas
• Permite distinguir a nivel de cepas
bacterianas
4
(+) ACA-V2
(+) ACA-V1
ACA-33
R. pickettii PKO1
B. cepacia G4
PS1-30
P.mendocina KR
P. putida PaW1
P. putida F1
Pseudomonas sp. ACA-V5
(++) ACA-F
ACA-V6
(++) Pseudomonas sp. PS2-40
ACA-32
(+) ACA-V3
ACA-A2
(+) ACA-I
PS1-15
PS2-21
PS1-E
PS1-PB
ACA-G
PS1-29
(+) PS1-26
PS1-14
DCA-51
PS2-17
Serratia sp. ACA-25
PS1-D2
PS2-C
PS2-38
DCA-52
ACA-46
DCA-49
DCA-23
DCA-50
DCA-48
Ralstonia sp. DCA-47
Stenotrophomonas sp. ACA-2
ACA-34
(+) ACA-31
BOX/REP PCR
5