26 RESULTADOS Inmunización de Ratones de la Cepa C3H/HeJ

RESULTADOS
Inmunización de Ratones de la Cepa C3H/HeJ con
la Proteína PE_PGRS33 de M. tuberculosis
Para inducir una respuesta inmune celular in vivo y estimular las células
T de los ratones, éstos se inmunizaron con la proteína PE_PGRS33 en cada
cojinete plantar. Posteriormente, se llevó a cabo la extracción de los 10 ganglios
linfáticos poplíteos; y se observó un aumento en su tamaño, indicando la
presencia de activación celular.
Se obtuvieron 118 millones de células de nódulo linfático, cantidad que
se esperaba, ya que lo estimado son 10 millones de células, por cada ganglio
linfático activado. Las células obtenidas se incubaron in vitro en presencia de 1
µM de la proteína PE_PGRS33.
Fusión Celular de las Células de Nódulo Linfático de
Ratón C3H/HeJ con las Células de Timoma BW5147 α-βPara la generación de los hibridomas de células T, después de la
estimulación in vitro con la proteína PE_PGRS33, se llevó a cabo la fusión
celular de las células de nódulo linfático del ratón, con las células BW5147α-β-;
las cuales, carecen del receptor de células T y por lo tanto no tienen
especificidad.
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La proporción de células que se utilizaron fueron 25 millones de células
de nódulo linfático y 75 millones de las células tumorales BW5147α-β-; las
cuales se fusionaron con polietilenglicol 1500 al 50%, el cual permitió la fusión
de ambas membranas celulares. Posteriormente, las células se colocaron en 10
placas de cultivo de 96 pozos para su expansión; 5 placas a una concentración
de 5 x105 células/mL y 5 placas a 2.5 x105 cel/mL. Para la expansión celular se
utilizó el medio selectivo HAT.
El medio HAT permite solamente el desarrollo de las células híbridas, y
no de las células tumorales. Para que las células proliferen, se necesita la
síntesis de ácidos nucleicos, mediante una de las dos vías que existen: la vía
clásica o “de novo”y la vía alterna; donde ésta última utiliza la enzima
Hipoxantina Guanidina Fosforribosil Transferasa (HGPRT). Las células
tumorales carecen de tal enzima, por lo que no pueden utilizar la hipoxantina ni
la timidina del medio, pero tampoco pueden utilizar la vía “de novo”” porque es
bloqueada por la aminopterina. En cambio, los hibridomas si proliferan, porque
conservan la enzima HGPRT proveniente de las células T de ratón.
Para verificar la actividad del medio selectivo HAT, se realizó una curva
de proliferación de las células tumorales BW5147 α-β- en medio HAT y se
comprobó que estas células, no sobrevivieron después de 48 horas (Figura 3).
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Concentración (cel/mL)
120000
100000
Células BW5147/mL
80000
60000
40000
20000
0
0
24
48
72
Tiempo (hr)
Figura 3. Curva de proliferación de las células BW5147α-β- en medio HAT. Las
células BW5147α-β- no sobrevivieron en medio HAT después de 48 horas,
confirmando la actividad del medio selectivo.
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Selección de los Hibridomas Generados Después de la Fusión Celular
A partir del décimo día después de la fusión celular, se seleccionaron los
primeros hibridomas de células T; los cuales a consecuencia de la proliferación,
provocaron el viraje del pH del medio HAT y por lo tanto un cambio en su color;
lo cual permitió la selección de las células con mayor facilidad. Una vez
seleccionados los hibridomas, éstos se colocaron en placas de cultivo de 48
pozos con medio HT para expandirlas y restaurar la vía de “novo” para la
síntesis de ácidos nucleicos. La selección de los hibridomas se llevó a cabo en
12 días, a partir del día 10 después de la fusión, hasta el día 21, y se obtuvieron
un total de 169 hibridomas (Tabla 1).
El 40% de los hibridomas generados (68) no sobrevivieron debido a
diferentes causas, entre ellas la inestabilidad celular y los cambios en diferentes
medios de cultivo.
Por otra parte, la morfología de los hibridomas de células T es muy
característica, ya que presentan una forma irregular y son de mayor tamaño que
las células T. Los hibridomas generados en este proyecto, concuerdan con
éstos rasgos (Figura 4).
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Tabla I. Hibridomas de células T seleccionados después de la fusión.
1a
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Total
1b
0
6
4
4
6
0
0
2
0
0
0
1
23
2
3
7
7
4
2
0
0
0
0
0
0
1
24
3
2
3
5
1
0
3
0
0
1
0
1
1
17
4
2
6
4
6
3
0
0
0
0
0
0
2
23
5
4
5
5
5
2
0
0
0
1
1
1
1
25
6
0
2
2
1
0
0
0
1
0
0
0
0
6
7
0
7
0
1
2
0
0
0
0
0
0
0
10
8
4
0
5
4
0
1
0
0
1
0
0
0
15
9
2
1
4
3
0
0
1
0
0
1
0
1
13
10
1
0
5
2
3
0
1
0
0
0
0
1
13
Total
18
37
41
31
18
4
2
3
3
2
2
8
169
No.
placa
(a) Días de selección de los hibridomas. (b)Número de placas de cultivo de 96
pozos. Las placas de cultivo de la número 1 al 5, tienen una concentración de 5
x105 cél/mL y las placas del 6 al 10, tienen una concentración celular de 2.5
x105 cél/mL.
30
Figura 4. Morfología de los hibridomas de células T. Los hibridomas de células
T generados, presentan una forma semi-redonda e irregular, como “gota de
agua”.
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Tamizaje de Hibridomas de Células T
Específicos Contra la Proteína PE_PGRS33
Una vez seleccionados los hibridomas y que se expandieron en placas
de cultivo de 48 pozos, se realizó el tamizaje de los mismos, mediante un
sistema de procesamiento y presentación de antígeno. Para poder evaluar si los
hibridomas de células T generados reconocieron específicamente a la proteína
PE_PGRS33, se estableció un sistema de presentación antigénica in vitro,
utilizando como CPA a las células M12Ak.C3F6, las cuales presentan el mismo
haplotipo del MHC clase II, que las células del ratón C3H/HeJ.
La medición de la proliferación de las células CTLL-2, inducida por la
presencia de IL-2 en el ensayo de los hibridomas de células T, nos permitió
evaluar indirectamente la presencia de hibridomas específicos contra la
proteína PE_PGRS33, mediante el ensayo con MTT. Se realizaron 16
tamizajes, evaluando todos los hibridomas de células T obtenidos, y se
compararon los cambios morfológicos de las CTLL-2 con el sobrenadante de
los hibridomas, con los cambios en los controles positivos (CTLL-2 + IL-2) y
controles negativos (CTLL-2 + medio de cultivo) (Figura 5).
En base ha este criterio, se seleccionaron dos hibridomas, en los cuales
fue muy evidente la diferencia entre el pozo con células CTLL-2 y la proteína y
el pozo sin proteína. Estos hibridomas fueron el 3C2 y el 2F9. Además, se
encontraron otros hibridomas, el 2B6, 3F8 y 7E7, cuyos sobrenadantes con la
IL-2 indujeron una mayor proliferación de las CTLL-2, en el ensayo de MTT. En
la Figura 6, se muestra un resultado representativo, de la proliferación de las
células CTLL-2, debido a la activación de los hibridomas específicos (2B6, 3F8
y 7E7) e hibridomas autorreactivos, así como los hibridomas que no se
activaron (Figura 6).
32
a)
b)
Figura 5. Morfología de las Células CTLL-2 en presencia y ausencia de IL-2. a)
Control positivo de células CTLL-2. b) Control negativo.
33
Proliferación CTLL-2
D.O. 570-655 nm
1.4
0.5 μM PE_PGRS33
1.2
0.0 μM PE_PGRS33
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Positivo
Negativo
3F8
7E7
2B6
Hibridomas específicos
4E8
10F4
Hibridomas autorreactivos
4G10
6G6
5D4
Hibridomas inespecíficos
Hibridomas de Células T
Figura 6. Ensayo de proliferación de las células CTLL-2. En la figura se
muestran 3 hibridomas específicos contra la proteína PE_PGRS33 (3F8, 7E7,
2B6), 2 hibridomas autorreactivos (4E8, 10F4) y 3 hibridomas inespecíficos
(4G10, 6G6, 5D4). Se utilizaron como controles internos: células CTLL-2 más
IL-2 (1:150) (Positivo) y células CTLL-2 más medio D5F (Negativo). La línea
basal indica el valor de la D.O. del control negativo 0.230.
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Subclonación de los Hibridomas de Células T
Específicos Contra la Proteína PE_PGRS33
Los 5 hibridomas de células T que se identificaron como específicos
contra la proteína PE_PGRS33, se subclonaron con el propósito de separar las
posibles clonas de células T presentes y poder identificar las clonas específicas,
mediante un nuevo ensayo de hibridomas de células T. Para la subclonación,
se realizó una dilución limitante. Después de la Subclonación de los hibridomas
3C2, 2F9, 3F8, 7E7 y 2B6, se obtuvieron un total de 87 subclonas de las cuales,
solo se pudieron evaluar las provenientes de los hibridomas 3C2 y 2F9 (Tabla
II). Las subclonas que resultaron específicas contra la proteína PE_
PGRS33 en el ensayo de proliferación de las CTLL-2 fueron: 3C2.D4, 3C2.F5,
3C2.E7, 2F9.B7 y 2F9.E7 (Figura 7).
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Tabla II. Subclonas obtenidas de los hibridomas de células T específicos contra
la proteína PE_PGRS33.
Hibridomas
No. de subclonas
Subclonas específicas
3C2
8
3
2F9
7
2
3F8
24
N.E.
2B6
23
N.E.
7E7
25
N.E.
Total
87
5
Se obtuvieron 87 subclonas de los 5 hibridomas específicos contra la proteína
PE_PGRS33, de los cuales solamente se evaluaron las 15 subclonas de los
hibridomas 3C2 y 2F9 mediante ensayos de proliferación de las CTLL-2. (N.E.)
No Evaluado. Las subclonas de los hibridomas 3F8, 2B6 y 7E7 no se evaluaron
debido a problemas con el cultivo de las CTLL-2; ya que el cultivo continuo de
esta línea celular provocó la pérdida de sensibilidad y confiabilidad de la misma.
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0.5 μM PE_PGRSS33
0.0 μM PE_PGRSS33
Proliferación CTLL
D.O. 570-655 nm
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Positivo Negativo 2F9.B7
2F9.E7 3C2.D4 3C2.F5 3C2.E7
Hibridomas de Células T
Figura 7. Hibridomas específicos contra la proteína PE_PGRS33. En la figura
se muestran las 5 subclonas específicas contra la proteína PE_PGRS33,
provenientes de los hibridomas 2F9 y 3C2. Se utilizaron como controles
internos: células CTLL-2 más IL-2 (1:150) (Positivo) y células CTLL-2 más
medio D5F (Negativo). La línea basal indica el valor de la D.O. del control
negativo 0.073.
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DISCUSIÓN
La importancia que tiene la respuesta inmune celular en el control de la
tuberculosis, es mundialmente conocida, por lo que estudios sobre la inducción
de esta respuesta contra antígenos de M. tuberculosis, son cada vez más
solicitados.
Para que se genere una respuesta celular eficiente contra M.
tuberculosis, se necesita la activación de las células T, que tras reconocer
específicamente determinantes antigénicos de la micobacteria asociados a
moléculas del MHC clase II de las CPA; activan su mecanismo de transducción
de señal y trascripción de genes, y codifican para la síntesis de citocinas como
el IFN-γ principalmente; ya que esta citocina es de gran relevancia para
erradicar la enfermedad (Boyer M y col., 1988; Van Crevel y col., 2002).
El caracterizar las principales proteínas de M. tuberculosis que actúan
como factores de virulencia, resulta de gran ayuda para poder identificar las
proteínas candidatas, que inducen una fuerte respuesta inmune celular. Sin
embargo, M. tuberculosis puede evadir la respuesta inmune celular mediante
diferentes mecanismos, como lo es la expresión selectiva de genes que le
confieren a la micobacteria infectar y sobrevivir dentro de los macrófagos.
Algunos de los genes que se expresan preferentemente pertenecen a la familia
de genes PE, en donde la mayoría de los miembros de esta familia están
implicados en la replicación y sobrevivencia del bacilo en el granuloma.
Se ha reportado, que muchos antígenos de M. tuberculosis interactúan
con las células T durante la presentación de antígeno e inducen una apoptosis
en las células T y en macrófagos, sugiriendo el por qué se puede dar la
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reactivación de la TB y la persistencia del bacilo tuberculoso (latencia). La
apoptosis de células T es considerada como un mecanismo regulatorio
importante en la respuesta inmune y está involucrada en la pérdida de
funciones efectoras durante muchas enfermedades infecciosas (Balaji y col.,
2007).
La proteína PE_PGRS33 que se utilizó en este estudio, representa el
prototipo de la familia de genes PE, ya que presenta como ventajas el
encontrarse en la superficie de la micobacteria y quedar expuesta al ambiente
extracelular permitiéndole interactuar con las células del huésped (Delogu G y
col., 2004; Ramakrishnan y col., 2000); presenta una secuencia de genes
polimórficos, que le confieren la característica de variabilidad antigénica y así
poder evadir la respuesta inmune del huésped (Cole ST y col., 1998; Gey van
Pittius y col., 2006); se encuentra asociada a las cepas del complejo de M.
tuberculosis; pero sobre todo, que el dominio constante amino terminal de su
estructura (PE), es el responsable de la inducción de la respuesta inmune
celular contra esta proteína (Delogu G y cols., 2001). Es por ello que la proteína
PE_PGRS33 representa un paso crucial hacia el mejor entendimiento de la
patogénesis inducida por el bacilo tuberculoso.
Para poder evaluar la inducción de la respuesta inmune celular de esta
proteína, en un sistema in vitro de procesamiento y presentación de antígeno,
se necesitan herramientas biológicas como los hibridomas de células T; que
permitan la caracterización inmunológica de la proteína y la identificación de los
epítopes inmunodominantes. La gran ventaja de generar estos hibridomas, es
que expresan un TCR con la especificidad de las células T activadas de ratón,
y proliferan abundantemente en ausencia de factores de crecimiento o células
“feeder”; por lo que son muy útiles para estudios de especificidad en el
reconocimiento antigénico por el complejo MHC-TCR.
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En este trabajo se lograron generar al menos 5 hibridomas específicos
contra la proteína (3C2, 2F9, 7E7, 2B6 y 3E7), lo cual nos permitirá utilizarlas
en futuras investigaciones, para identificar específicamente los epítopes o
determinantes antigénicos de la proteína, responsables de la inducción de la
respuesta inmune celular. Un método para identificarlos, consiste en sintetizar
los péptidos utilizando técnicas de espectrometría de masas y la información
disponible del genoma de M. tuberculosis; para posteriormente, evaluarlos en
ensayos in vitro de inducción de la respuesta inmune o in vivo en modelos
murinos. Sin embargo, esta técnica resulta costosa y consume mucho tiempo.
Una alternativa más viable, es hacer uso de los algoritmos y modelos
matemáticos existentes, que permiten hacer estimaciones sobre los posibles
péptidos de unión a las moléculas de MHC de clase I y II de diferentes especies
(Yu y col., 2002). Esta información esta disponible en programas y base de
datos como el PEPTIDE CUTTER y el SYFPEITHI, en los cuales se pueden
hacer análisis de los posibles sitios de corte de la proteína, por enzimas
proteolíticas y predecir los ligandos óptimos del MHC, respectivamente (Ver
Apéndice V y VI). De tal manera, que con las predicciones de los epítopes
potenciales de células T y los hibridomas generados, podamos contribuir con la
búsqueda y diseño de vacunas de nueva generación, que brinden una mayor y
mejor protección, que la única vacuna existente hasta el momento, la BCG
(Chaitra y col., 2005).
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