PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA DOMESTICOS.

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA
DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIRA CANICOLA EN CANIDOS
DOMESTICOS.
M.V Esteban Chuquipoma Guevara
Especialidad en Laboratorio Clínico Veterinario
INTRODUCCIÓN.
En estos últimos años la población canina domestica ha ido incrementando,
la introducción y crianza de los canidos como mascotas ha tomado auge por
la gran variedad de razas y las facilidades actuales para adquirirlas. Este
auge no solo se evidencia en las grandes ciudades sino también en
pequeñas poblaciones, pero las proyecciones futuras de esta población
como así mismo su estabilidad dependen en gran medida del control de las
enfermedades infecciosas que las puedan afectar.
Leptospira canícola, es el agente causal de una enfermedad altamente
contagiosa que afecta a canidos de todas las edades produciendo una muy
alta mortalidad. Los que sobreviven a la infección pueden convertirse en
portadores que, en cualquier momento, pueden infectar animales
susceptibles. Por lo tanto, es de importancia contar con métodos que
permitan identificar la bacteria en animales infectados con el objeto de
considerar las medidas adecuadas y así evitar su propagación y reducir la
mortalidad.
Leptospira canícola es una bacteria Gram negativa
del orden de los
espiroquetales, ya ha sido detectado en Perú e incluso caracterizado
bioquímicamente. La membrana celular de Leptospira presenta lipoproteínas
que actúan como antígenos de la membrana externa también existe una
flagelina periplásmica que actúa también como antígeno.
OBJETIVO.
El objetivo de esta investigación está dirigida a la creación de anticuerpos
monoclonales para la detección de los antígenos bacterianos de pared
celular de Leptospira canícola.
MATERIALES Y METODOS.
Inmunización
Se utilizaron preparaciones puras de antígeno, evitando de esta manera el
peligro de competencia antigénica, luego se inocularon vía subcutánea a
conejos en forma de emulsión a intervalos de dos semanas para asegurar
una buena estimulación y amplificación de los clones de linfocitos B
específicos para el antígeno de interés “(Harlow y Lane, 1988”), luego se
obtuvo el bazo del animal inmunizado.
Fusión
Luego de la suspensión de células esplénicas previamente purificados se
obtuvieron linfocitos B lo cuales se mezclaron con un número apropiado de
células de mieloma, las cuales
se mantuvieron
creciendo
exponencialmente in vitro. Posteriormente se fusiono a 37º la mezcla de
células en un pequeño volumen de
polietilenglicol (PEG) y se mezcló
suavemente por espacio de uno a tres minutos. En estas condiciones, las
membranas de algunas de las células se fusionan, uniéndose los
citoplasmas y formándose los hibridomas. El PEG luego se elimina por
lavado y las células fusionadas se siembraron en microplacas de cultivo
(“Yokoyama, 1992”).
El proceso de fusión es muchas veces muy ineficiente: en general, menos
del 1% de las células terminan fusionándose (“Johnstone y Thorpe, 1987;
Harlow y Lane, 1988”). Esto trae como consecuencia que se requiera de un
número de células relativamente alto para el proceso de fusión (un bazo de
ratón contiene del orden de 101 células). En algunas circunstancias es
posible enriquecer la población de linfocitos B específicos para el antígeno,
lo cual se logra asociando el antígeno a una fase sólida y utilizando
procedimientos de aislamiento como separación inmunomagnética
(“Ossendorp et al., 1989 Lundkvist et al., 1993”) o roseteo con glóbulos
rojos recubiertos con el antígeno de interés (“Myers et al., 1986”). De
tenerse el equipo necesario, en los casos en los que se dispone de pocas
células, es preferible realizar la fusión mediante el proceso denominado
electrofusión, el cual resulta mucho más eficiente (“Foung, 1990”).
Selección
La mezcla de células obtenidas estuvo formada por esplenocitos, células
de mieloma, esplenocitos fusionados entre sí, células de mieloma
fusionadas entre sí y además por los hibridomas linfocito B-célula de
mieloma, de tal manera que se procedió a seleccionar solamente el
crecimiento de los hibridomas, eliminando a las células mielomatosas. Esto
se obtuvo con el llamado medio HAT y el fundamento en que se basa es el
siguiente: Las células eucariotas disponen de dos vías para la síntesis del
ADN. Una es la llamada "vía principal o de novo" y la otra es la "vía de
rescate", en la cual se requiere la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosiltransferasa (“Harlow y Lane, 1988”). La clave de la selección está en que
las células de mieloma que se utilizan para la fusión son deficientes en la
enzima HGPRT, es decir, que sintetizan su ADN únicamente por la vía
principal. Esta vía principal puede ser bloqueada por la adición de la droga
aminopterina (“Hudson y Hay, 1989”). De manera que, si al medio de
cultivo en el que crece el producto de fusión se añade aminopterina, las
células mielomatosas no fusionadas o fusionadas entre sí morirán, ya que
serán incapaces de sintetizar ADN. Si consideramos ahora las células
híbridas, éstas tienen la capacidad de crecimiento tumoral heredada de las
células mielomatosas, pero también tienen el gen que codifica la enzima
HGPRT, heredado de los linfocitos normales, pudiendo sintetizar ADN por la
vía de rescate. De esta forma, en presencia de Hipoxantina-AminopterinaTimidina (HAT) las únicas células con capacidad de crecimiento,
"seleccionadas" gracias a un fenómeno de complementación génica, son las
híbridas.
Existe aún otro evento de selección, el cual está destinado a identificar y
aislar, del total de híbridos producidos, a los hibridomas productores de los
anticuerpos de interés. La identificación se logra con un método apropiado
para la evaluación de los sobrenadantes de cultivo y el aislamiento se
realiza mediante el clonamiento.
Evaluación de los sobrenadantes de cultivo
Luego de diez días post-fusión, en cada pozo de cultivo crecieron varios
híbridos, cada uno produciendo un anticuerpo distinto y era necesario
aislarlos para obtener anticuerpos de una sola especificidad. Para
determinar en cuáles cultivos se encuentran los anticuerpos con la
especificidad deseada, y por ende las células productoras de los mismos, se
realizaron ensayos de evaluación o "screening" en los sobrenadantes de
cultivo, para esto se utilizó pruebas de aglutinación debido a que el
antígeno es de pared.
Clonamiento
Se procedió a obtener células idénticas por replicación a partir de una sola.
El método que se utilizó para esto consistió en sembrar suspensiones
celulares a gran dilución de manera que en un volumen dado pueda haber
en promedio de ninguna a unas pocas células, para evitar la dificultad de
este método llamado de dilución al límite (“Harlow y Lane, 1988”), se utilizó
células nodriza (fibroblastos) las cuales proveyeron la ayuda necesaria
para el crecimiento a baja densidad (“James y Bell, 1987”).
RESULTADOS y DISCUSION.
Luego de haber superado todos los inconvenientes se logrado obtener el
hibridoma productor del anticuerpo deseado, como resultado de la fusión se
obtuvieron un total de 285 hibridomas de los cuales sólo 122 fueron
secretores, estos últimos, 32 sobrenadantes dieron positivos. el próximo
paso es su cultivo a escala para obtener el anticuerpo en las cantidades
deseadas. La producción a mediana escala de los anticuerpos se puede
efectuar inoculando el hibridoma correspondiente en la cavidad peritoneal
de ratones singénicos a la línea de mieloma utilizada para la fusión y
haciéndolo crecer como un tumor mielomatoso, obteniéndose el anticuerpo
en forma de líquido ascítico (Gavilondo, 1990). A otra escala de producción,
el cultivo se puede hacer en botellas rotatorias, en fibras huecas o en
fermentadores especiales diseñados para tal fin (Freshney, 1987; Corrigan,
1988; Lubiniecki, 1990). Para aplicaciones clínicas el anticuerpo debe estar
caracterizado tanto química como funcionalmente y con un alto grado de
pureza (Sullman, 1989; Lucas, 1989; Ronneberger, 1989). Otro aspecto de
importancia para la producción es el almacenaje de los hibridomas. Esto se
logra mediante congelamiento en tanques especiales de nitrógeno líquido,
en los cuales las células son congeladas cuando se encuentran creciendo en
fase exponencial y con un alto ponerle de viabilidad. (Daggett y Simione,
1987).
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