Microbiología general 2008

Microbiología general
2008 - 2009
Antonio G. Pisabarro
Catedrático de Microbiología
Tema 2: Cultivo de microorganismos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Crecimiento microbiano.
Cultivo de microorganismos.
Medios de cultivo.
Métodos de aislamiento.
Concepto de cultivo puro.
Crecimiento microbiano en medio líquido.
Crecimiento microbiano en medio sólido.
Concepto de muerte de un microorganismo.
Medida del crecimiento y enumeración de microorganismos.
Crecimiento microbiano equilibrado.
Cinética de crecimiento de un cultivo estanco.
Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento.
Rendimiento de los cultivos.
Cinética de crecimiento en un cultivo continuo.
Tipos de fermentadores.
Crecimiento microbiano
Ciclo celular
20-30 min E. coli a 37º
Crecimiento
Medios de cultivo
• Soporte para el crecimiento de
microorganismos
• Clasificación
– definidos y complejos
– líquidos y sólidos
– En función de los microorganismos que pueden
crecer en ellos, los medios pueden ser:
•
•
•
•
•
Generales
Selectivos
Diferenciales
Selectivo-diferenciales
Medios de enriquecimiento
Nutrición y cultivo de
microorganismos
• Varios tipos de metabolismo
– Foto- / Quimio– - lito - / - organo –
• Concentración de nutrientes: oligotrofía
• La mayoría de las especies microbianas no son
cultivables
Cultivos puros y recuento de
microorganismos
• Tiene sólo un tipo de microorganismo
• En medio sólido forma una colonia aislada
• Cada colonia procede de
un único individuo inicial
• El número de colonias nos
indica el número de células
iniciales
Medios de cultivo
• Soporte para el crecimiento de microorganismos
• Clasificación
– definidos y complejos
– líquidos y sólidos
– En función de los microorganismos que pueden crecer
en ellos, los medios pueden ser:
•
•
•
•
•
Generales
Selectivos
Diferenciales
Selectivo-diferenciales
Medios de enriquecimiento
Esterilización de medios de cultivo
• Eliminación de todo tipo de microorganismo
• Concepto de esterilidad y asepsia
• Autoclaves
Programa de prácticas
Práctica 1: Preparación de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios de
cultivo. Esterilización.
Práctica 2: Análisis microbiológico de la contaminación ambiental y de
manipuladores.
Práctica 3: Obtención de cultivos puros.
Práctica 4: Recuento del número de bacterias por
mililitro de un cultivo líquido.
Práctica 5: Cultivo de bacterias anaerobias.
Práctica 6: Observación de bacterias teñidas. Tinción Simple y Tinción de Gram.
Práctica 7: Transformación bacteriana por resistencia a ampicilina.
Práctica 8: Antibiograma.
Práctica 9: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano
Práctica 10: Aislamiento y caracteristicas de un bacteriófago (virus de bacterias).
Práctica 11: Observación de levaduras.
Práctica 12: Tinción de esporas.
Práctica 13: Tinción de cápsula.
Cultivos puros y recuento de
microorganismos
• Tiene sólo un tipo de microorganismo
• En medio sólido forma una colonia aislada
• Cada colonia procede de
un único individuo inicial
• El número de colonias nos
indica el número de células
iniciales
Medida del crecimiento
Número de células
Masa celular
Componentes celulares
Pared celular
DNA
RNA
proteínas
Medida del crecimiento
Número de células
Medida del crecimiento
Biología de los Microorganismos de Brock
Medida del crecimiento
Biología de los Microorganismos de Brock
Medida del crecimiento
Masa celular
Cinética del crecimiento
Nº generaciones
(g)
Número de
células N
0
1
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
7
128
….
….
g
2g
N = N0 2g
Cinética del crecimiento
2g
140000
g
N
100000
0
1
80000
1
2
60000
2
4
40000
3
8
20000
4
16
5
32
6
64
7
128
8
256
9
512
10
1024
11
2048
3,00
12
4096
2,00
13
8192
1,00
14
16384
15
32768
16
65536
N = N0
120000
0
0
5
10
15
20
6,00
5,00
4,00
0,00
0
5
10
15
20
Cinética del crecimiento
140000
120000
N = N0 2g
100000
80000
60000
Log N = Log N0 + g Log 2
40000
20000
0
0
N puede ser
Biomasa
Densidad óptica
Número de células
Conc proteína
Conc. DNA
Conc. RNA
etc ..
5
10
15
20
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0
5
10
15
20
Cinética del crecimiento
dN / dt = µ N
La velocidad (tasa) de
crecimiento es proporcional al
número de células
dN / N = µ dt
∫ dN / N = µ ∫ dt
Ln N – Ln N0 = µ t
El logaritmo del número de
células varía de forma lineal
con el tiempo.
La pendiente de la recta de
proporcionalidad es la tasa de
crecimiento µ
LnN = Ln N0 + µt
N = N0eµt
El aumento del número de
células es exponencial
Cinética del crecimiento
N = N0eµt
LnN = Ln N0 + µt
N = N0 2g
Log N = Log N0 + g Log 2
Cinética del crecimiento
N = N0eµt
N = N0 2g
2g = eµt
g Ln2 = µt
µ = g Ln2 / t
µ = Ln2 / τ
g=t/τ
Cinética del crecimiento
LnN = Ln N0 + µt
LnN
Pendiente = µ
Ln N0
Tiempo (t)
Cinética del crecimiento
Log N = Log N0 + g Log 2
Log N = Log N0 + (t/τ) Log 2
Log N = Log N0 + t (Log 2 / τ)
Cinética del crecimiento
Log N = Log N0 + t (Log 2 / τ)
LogN
Pendiente = Log2/τ
Log N0
Tiempo (t)
Cinética del crecimiento
Problema 1:
Calcular la tasa de crecimiento y el tiempo de generación de las bacterias
de un cultivo que pasa de tener una DO550 de 0.1 a 0.78 en 120 min.
LnN = Ln N0 + µt
Ln0.78 = Ln 0.1 + µ 120 min
µ = 1.03 h-1
τ = 0.67 h
τ = 40.38 min
Cinética del crecimiento
Equivalencias entre la tasa de crecimiento y el tiempo de generación
µ = Ln2 / τ
Cuando µ = 1 h-1 , entonces τ = 0.69 h = 41 min (aporx.)
Cuando τ = 0.5 h, entonces µ = 1.4 h-1
Cuando τ = 1 h, entonces µ = 0.69 h-1
Tiempo de generación de algunas bacterias en condiciones
óptimas de cultivo.
Bacteria
Medio
Escherichia coli
Glucosa sales
Bacillus megaterium
Sacarosa sales
Streptococcus lactis
Leche
Streptococcus lactis
Caldo de lactosa
Staphylococcus aureus BHI
Lactobacillus acidophilus Leche
Rhizobium japonicum
Extr. Manitol levadura
M. tuberculosis
Sintético
Treponema pallidum
Testículo ratón
Tiempo gen (min)
17
25
26
48
27-30
66-87
344-461
792-932
1980
Cinética del crecimiento
Efecto de la temperatura sobre la
velocidad de crecimiento de los
micoorganismos
Biología de los Microorganismos de Brock
Clasificación de los microorganismos
según la temperatura
Biología de los Microorganismos de Brock
Efecto del ion Na+ sobre el
crecimiento microbiano
Biología de los Microorganismos de Brock
Efecto del pH sobre el crecimiento de
microorganismos
Biología de los Microorganismos de Brock
Efecto del oxígeno sobre el
crecimiento de microorganismos
Biología de los Microorganismos de Brock
Rendimiento del cultivo
Al valor Ys lo denominamos rendimiento de utilización del
substrato, ya que mide la cantidad de biomasa que puede
producirse por unidad de substrato consumido
Log Biomasa (N)
Rendimiento del cultivo
Tiempo (t)
[S1]
[N1]
[S2]
[N2]
[S3]
[N3]
N
m = Ys
[S]
Tasa específica de consumo de substrato
Comparación del Transporte Activo
con la Difusión Simple
Transporte
activo
Concentración
Interna de
solutos
Difusión Simple
Concentración Externa de solutos
Biología de los Microorganismos de Brock
Tasa de crecimiento (µ)
Ecuación de Monod
µmax
µmax / 2
Ks
[substrato]
Fermentador
Biología de los Microorganismos de Brock
Fermentador
Genentech, Corporate Communication
New Brunswick Scientific Co., Inc.
Fermentador
ICI, Ltd. factory, Billingham, UK,
Fermentador
Novo Nordisk
Cultivo continuo
Tasa de dilución
D=Φ/V
D=µ
Biología de los Microorganismos de Brock
Cultivo continuo
Biología de los Microorganismos de Brock
Cultivo continuo
Concentración
de substrato
Biomasa
D
µmax
Referencias
•
Una buena parte de las imágenes de esta presentación proceden del
libro Brock. Biología de los Microorganismos