CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (SEC)

CROMATOGRAFÍA
DE EXCLUSIÓN (SEC)
• PORATH - 1957 – Cromatografía Filtración Gel - GFC
Disolvente - agua
- Muestras – Solubles en agua-Biopolímeros
- Empaque - Suave, Gel Hidrofílica (Sephadex)
-
• MOORE - 1962 – Cromatografía Permeación en Gel - GPC
Disolventes - THF, Decalina, Tolueno
- Muestras – Polímeros Orgánicos
- Empaque – Poliestireno entrecruzado (Styragel)
-
GFC, GPC IDÉNTICO MECANISMO
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CROMATOGRAFÍA
DE EXCLUSIÓN (SEC)
• SEC caracterización de polímeros (PM 1000
a 1 millón)
• Resinas orgánicas (GPC) o bio-moléculas
(GFC)---cadenas de moléculas pequeñas
• Las cadenas de distintos largos y formas
• Se puede calcular el peso molecular y su
distribución
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COMPARACIONES
• GPC vs LSC o Fase Reversa
• GPC separa moléculas basada en su
tamaño en disolución
• Tamaño en disolución depende de PM y
otros factores (disolvente, temperatura,
etc.)
• La moléculas más grandes eluyen primero
las más pequeñas al final
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VENTAJAS DE SEC
•
Trabaja con altos PM y tiene tiempos de
corrida cortos
•
Tiempos de separación y orden de elución
fácilmente predecibles
•
No existen pérdidas o reacciónes en la
columna
•
Desarrollo de métodos relativamente
simple, sin gradientes
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GPC DE GOMA DE MASCAR
GPC
CHICLE
Ablandador
Sabor
Estabilizador
COMPONENTES
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PROBLEMAS EN SEC
•
Limitada capacidad de pico (baja resolución)
•
No puede resolver compuestos de tamaño
similar (isómeros)
•
Se requiere de una diferente estrategia de
optimización
•
Debe poder disolver al polímero
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MECANISMO DE SEPARACIÓN
• Las moléculas más
pequeñas penetran en los
poros más pequeños y se
retienen más
• Las moléculas mayores
son EXCLUIDAS
• La separación en función
del VOLUMEN
HIDRODINÁMICO y no el
PM
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CROMATOGRAMA DE EXCLUSIÓN
Respuesta del detector
V0
VR
Volumen interno
Volumen muerto
grande
pequeño
.
Inyección
Volumen de elución [ml]
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CURVA DE CALIBRACIÓN
EXCLUSIÓN
TOTAL
6
.
PE
RM
5
EA
log
CI
ÓN
PM
SE
LE
C
4
TI
VA
3
PERMEACIÓN
Vo
Vi
TOTAL
2
0
10
20
Volumen de elución
30
40
[ml]
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CURVAS DE CALIBRACIÓN PARA
VARIAS COLUMNAS PS-DVB
POLYSTYRENE MOLECULAR WEIGHT
107
106
10 6 Å
10 5 Å
105
10 4 Å
104
1000 Å
500 Å
MIXED BED
100 Å
103
50 Å
102
4
5
6
7
8
9
10
E LUT ION VOL UME [m in p er 30 cm ]
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DESARROLLO DE MÉTODOS
• Seleccione un buen disolvente (consulte
la literatura)
• Escoja el tamaño de poro adecuado
• Corra estándares; desarrolle una curva de
calibración
• Inyecte una disolución diluída (~1%)
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DISOLVENTES PARA GPC
•Deben disolver al polímero
•Compatible con el empaque y
•Baja viscosidad
•Toxicidad, costo, punto de
detector
ebullición
SOLVENT
THF
Viscosity UV cutoff BP
[20°C, cP] [nm]
[°C]
Flash Pt. Toxicity
[°C]
0.55
220
66
14
Slight
m-Cresol
20.8
302
203
94
Moderat
Toluene
0.59
285
111
4
Moderat
Dichloromethane0.44
233
40
None
Severe
Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography , 2nd ed., (1979)
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PAPEL DE LA FASE MÓVIL
DISOLVENTE A:
Polímero completamente solvatado
DISOLVENTE B:
Sin solvatar
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SELECCIONANDO COLUMNAS GPC
PORES SIZES
MW RANGE
(polystyrene)
50 Å
< 1,000
100 Å
< 4,000
500 Å
500 - 2 x10
1000 Å
1000 - 4 x10
4
4
10
4
Å
4 x 10
3
- 4 x10
5
10
5
Å
4 x 10
4
- 4 x10
6
10
6
Å
4 x 10
5
- 4 x10
7
Mixed Bed
500 - 10
7
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REQUERIMIENTOS DE HARDWARE
•
•
BOMBA – un control preciso de flujo, esencial
•
COLUMNA – empaque estable (no cambie
disolventes), control de temperatura
•
DETECCIÓN – No-destructivo (trabajo prep.),
amplio intervalo lineal
•
OBTENCIÓN DE DATOS - computarizado,
cálculos automáticos de Mn, Mw, etc.
INYECTOR – mejor automuestreador (10100µl)
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PREPARACIÓN DE MUESTRA
•Seleccione un buen disolvente, caliente
si es necesario
•Prepare una disolución diluída (~1%)
PM<10K ~1%
PM>1Millón ~0.01%
•Siempre filtre (¡No guarda-columnas!)
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DETECTORES PARA SEC
ÍNDICE DE REFRACCIÓN:
• Respuesta universal
• Sensibilidad moderada
• Mala temp. y estabilidad de flujo
UV/VISIBLE:
• Buena estabilidad, muchos polímeros
no tienen cromóforos
LASER DE LUZ DISPERSA DE ÁNGULO BAJO:• da valores para M n, M w
(LALLS)
• resultados de PM ABSOLUTO,
ya que se mide el volumen
hidrodinámico
VISCOMETRÍA DIFERENCIAL:• Volumen hidrodinámico = Visc.  M n
• Útil para calibración universal,
da M n, M w viscosidad intrínseca
DETECTORES EVAPORATIVOS DE MASA:• Universal, da masa,
igual respuesta
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APLICACIONES DE GPC
•
Separaciones de polímeros de alto peso
molecular
•
Caracterización de polímeros:
Mn, Mw, Mz, polidispersión
•
Limpieza de muestra:
Remueve materiales de alto PM
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APLICACIONES DE GPC
CONTROL DE CALIDAD RÁPIDO
6
Buen polímero
log PM
5
4
Mal polímero
.
3
2
0
10
20
30
40
Volumen de elución [m l]
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SEPARACIÓN DE ADITIVOS DE
POLÍMEROS
7
3
1
Muestra:
1. Irganox 1010
2. DSTDP
3. Irganox 1076
4. Estearamide
5. Desconocido
6. Tinuvin 327
7. BHT
Columna: G2000 H8
6
7.5 mm ID x 60 cm x 2
Eluente:
Tetrahidrofurano
Flujo:
1.6 ml/min
Caida Presión : 54 kg/cm2
Detector:
RI
Temp.:
Ambiente
2
4
5
15
20
25
30
35
Tiempo de elución [min]
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GPC DE ALTA RESOLUCIÓN
C36
C28
C32
C22
MUESTRA:
n-Parafinas
COLUMNA:
SHODEX a-802 x 4, 2m
ELUENTE:
THF
FLUJO:
1 ml/min
PRESIÓN:
48 kg/cm2
C24
C20 C18
C16
C13
C12
C14
DETECTOR: IR
C11
C9
30
40
50
60
C8
70
min
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PROPIEDADES FÍSICAS
• Número
PM promedio
cristalinidad, flujo,
compresión
• Peso
PM promedio
fuerza (tensil, impacto)
resistencia
•z
PM promedio
elongación, flexibilidad
• Z+1
PM promedio
“die swell”
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VARIABLES DE SEPARACIÓN SEC :
TEMPERATURA, CARGA DE MUESTRA
A. Incremente la Temperatura para mejorar:
- Solubilidad de la muestra
- Eficiencia de la columna
- Tiempo de corrida (menores debidos a flujos altos, menor
viscosidad)
- Carga de muestra (solubilidad incrementada)
B. Tamaño de muestra: Limitada por la viscosidad
- Cerca de 15 mg max para columnas de 25 x 0.8 cm;
VR y HETP se degradan a valores mayores
Intervalo PM
a 20K
34K a 200K
400K a 2,000K
Concentración Max [%wt./vol.]
0.25
0.10
0.05
Synder and Kirkland, Introduction To Modern Liquid Chromatography., (1979) p. 507
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CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
RESUMEN
• DOS TIPOS:
GFC - Biopolímeros Acuosos en Geles
Hidrofílicos
GPC - Polímeros Orgánicos en Poliestireno
• MECANISMO
Separación por tamaño (PM)
• CURVA DE CALIBRACIÓN
Correlaciona PM y Volumen de Elución
• DISOLVENTE
Debe disolver al polímero
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