moleculas de inmunoglobulina hibridas recombinantes y su

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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ES 2 054 688
kInt. Cl. : C12N 15/66
11 N.◦ de publicación:
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ESPAÑA
A61K 39/395
//C12N 9/72
C07K 15/00
G01N 33/66
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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA
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kNúmero de solicitud europea: 87310006.9
kFecha de presentación : 12.11.87
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 271 227
kFecha de publicación de la solicitud: 15.06.88
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54 Tı́tulo: Moléculas hı́bridas recombinantes de inmunoglobulina y su uso.
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73 Titular/es: The General Hospital Corporation
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72 Inventor/es: Haber, Edgar y
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74 Agente: Gómez-Acebo Pombo, J. Miguel
30 Prioridad: 12.11.86 US 929581
55 Fruit Street
Boston, MA 02114, US
45 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
16.08.94
45 Fecha de la publicación del folleto de patente:
16.08.94
Aviso:
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Quertermous, Thomas
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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletı́n europeo de patentes,
de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina
Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar
motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de
oposición (art◦ 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Esta invención se relaciona con una molécula
hı́brida recombinante de inmunoglobulina que
tiene un punto de ligación de antı́geno especı́fico
para fibrina enlazada a una segunda proteı́na
que comprende la porción activa de un activador de plasminógeno. Esta invención se relaciona
también con la clonación y producción de estas
nuevas moléculas hı́bridas de inmunoglobulina.
La invención se relaciona además con un método
de uso de estas moléculas hı́bridas de inmunoglobulina en procesos de inmunodiagnóstico e inmunoterapéuticos.
La mayor parte de los infartos de miocardio
son causados por trombosis coronaria (DeWood
et al., N. Eng. J. Med., 303:897 (1983). La
trombosis coronaria causante del infarto de miocardio puede ser lisada por agente trombolı́ticos.
Estos agentes trombolı́ticos son activadores de
plasminógeno que activan la conversión de plasminógeno al enzima fibrinolı́tico plasmina. La
plasmina lisará entonces la fibrina presente en
el trombo. Este tratamiento con activadores de
plasminógeno no está libre de efectos secundarios.
La plasmina actúa de forma no selectiva y, por
tanto, no solo lisa la fibrina del trombo, sino que
también ataca al fibrinógeno y factores de coagulación, traduciéndose ello frecuentemente en una
severa diátesis de sangrı́a.
Las moléculas estreptoquinasa, uroquinasa,
prouroquinasa y activador de plasminógeno de
tipo tisular (tPA) son activadores de plasminógeno conocidos para lisis de trombos. Estos
activadores están indicados en el tratamiento de
enfermedades cardiovasculares agudas tales como
infarto, apoplejı́a, embolismo pulmonar, trombosis venosa profunda, oclusión arterial periférica y
otras trombosis venosas. Sin embargo, tanto la
estreptoquinasa como la uroquinasa tienen severas limitaciones. Debido a la baja afinidad por fibrina, ambos activadores activarán la circulación
y el plasminógeno ligado a fibrina de forma indiscriminada. La plasmina formada en la sangre en circulación es neutralizada antes de que
pueda usarse en la trombolisis. La plasmina residual degradará varias proteı́nas de factores de
coagulación, por ejemplo, fibrinógeno, Factor V y
Factor VIII, causando un potencial hemorrágico.
Por otro lado, la estreptoquinasa es fuertemente
antigénica y los pacientes con altos tı́tulos de anticuerpos responden de manera ineficaz al tratamiento y no pueden permanecer en tratamiento
continuo.
El activador de plasminógeno de tipo tisular
humano puede ligarse a fibrina y, por tanto, favorece la activación de plasminógeno en estrecha proximidad al trombo, conservando potencialmente fibrinógeno en otra parte de la circulación. Sin embargo, a las dosis requeridas para
la lisis rápida de trombos coronarios, el uso de
activador de plasminógeno de tipo tisular puede
traducirse también en hemorragias.
Con el fin de aumentar la especificidad de los
agentes tromboliticos con respecto al trombo, se
ha comprobado que el enlace covalente de uroquinasa a un anticuerpo especı́fico a fibrina se
traduce en un notable incremento de la potencia
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y especı́ficidad fibrinoliticas Bode et al., Science,
229:765 - 767 (1985).
Una función caracterı́stica de cada molécula
de anticuerpo es la ligación especı́fica a un determinante antigénico. Los anticuerpos in vivo
son bivalentes y monoespecificos, conteniendo dos
puntos de ligación de antı́geno idénticos. La ligación especı́fica de antı́geno por una molécula de
anticuerpo se determina por la estructura del anticuerpo de las regiones variables (Fab ) de ambas
cadenas pesada y ligera.
Se han preparado anticuerpos que tienen dobles especificidades sometiendo anticuerpos de
distintas especificidades a una rotura selectiva de
los puentes disulfuro que enlazan las dos cadenas
pesadas entre sı́. Las semi - moléculas de anticuerpo son reasociadas entonces bajo pH neutro
para producir los anticuerpos hı́bridos que tienen dobles especificidades. Véase Nisonhoff et al.,
Nature (London), 194:355 (1962); Brennan et al.,
Science, 229:31 (1985); Liu et al., Proc. Nat’l.
Acad. Sci. USA, 82:8648 (1985); y la solicitud
de patente USA copendiente, n◦ de serie 851.
554, presentada el 14 de Abril de 1986 (correspondiente a la publicación EP - A - 0241907).
Se han producido también anticuerpos biespecı́ficos a partir de hibridomas. La preparación
de anticuerpos monoclonales biespecı́ficos mediante fusión de células hibridomas productoras
de anticuerpos se describe en Milstein y Cuello,
Nature (London), 305:537 (1983) y en la solicitud
PCT, WO83 103679.
Los anticuerpos han sido también clonados y
producidos mediante técnicas del ADN recombinante. Genes para las cadenas pesadas y ligeras han sido introducidos en huéspedes adecuados
y expresados, seguido por reagregación de estas
cadenas individuales a moléculas de anticuerpos
funcionales (véase, por ejemplo, Munro, Nature,
312:597 (1984); Morrison, S.L. Science 229:1202
(1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986));
Wood et al, Nature, 314U:446 - 449 (1985)). Regiones variables de cadena ligera y cadena pesada han sido clonadas y expresadas en huéspedes
foráneos, manteniendo su capacidad de ligación
(Moore et al., publicación de patente europea
0088994 (publicada el 21 de Septiembre de 1983)).
También se han preparado anticuerpos
quiméricos o hı́bridos mediante técnicas del ADN
recombinante. Oi y Morrison, BioTechniques,
4:214 (1986) describen una estrategia para la
producción de anticuerpos quiméricos. En las
páginas 218 - 220 se describe un anticuerpo
quiméricos anti - Leu3 de IgG humana. Los autores establecen que se ha preparado un anticuerpo
quimérico anti - dansilo de ratón:humano. Este
artı́culo indica, sin expresarlo concretamente, que
la especificidad de ligación de Leu3 y la especificidad de ligación anti - dansilo han sido clonadas
conjuntamente en una sola molécula de inmunoglobulina.
Morrison, Science, 229:1202 (1985), en la Tabla 1, establece que las regiones de cadena ligera variable o de cadena pesada variable pueden unirse a una secuencia no - Ig para crear
proteı́nas de fusión. Este artı́culo establece que
los usos potenciales para las proteı́nas de fusión
son tres: (1) para unir especificidad de anticuer-
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pos a enzimas para utilizarse en análisis; (2) para
aislar proteı́nas no - Ig mediante columnas de
antı́genos; y (3) para suministrar especificamente
agente tóxicos. En esta referencia no existe des
- crip - ción alguna en cuanto a moléculas de inmunoglobulina quiméricas especı́ficas.
Neuberger et al, Nature, 314:268 (1985) describen un anticuerpo quimérico cuya cadena pesada es una región constante humana fusionada a
una región variable de ratón que es especı́fica para
el hapteno, 4 - hidroxi - 3 - nitrofenil - acetilo.
La solicitud de patente europea 120.694 describe la construcción genética de las regiones variable y constante de una molécula de inmunoglobulina que se expresa en células huésped de E.
coli. En la página 10 de dicha solicitud, se indica
que la molécula de inmunoglobulina puede ser sintetizada por una célula huésped con otra mitad
péptido unida a uno de los dominios constante.
Esta mitad péptido se describe como citotóxica
o como enzimática. Igualmente, en la página 10
de dicha solicitud se establece que la molécula de
inmunoglobulina puede comprender también un
agente terapéutico. La memoria descriptiva de
dicha solicitud y los ejemplos de la misma ofrecen
el uso de una cadena de tipo lamda derivada de
un anticuerpo monoclonal que se liga a haptenos
de 4 - hidroxi - 3 - nitrofenilacetal (NP).
La solicitud de patente europea 125.023 se relaciona con el uso de técnicas de ADN recombinante para producir moléculas de inmunoglobulina que son quiméricas o que están modificadas
de otro modo. Uno de los usos descritos en las
páginas 3 - 4 para estas moléculas de inmunoglobulina reside en la diagnosis y tratamiento de
todo el cuerpo mediante la inyección, en un paciente, de los anticuerpos dirigidos a tejidos enfermos especı́ficos. La presencia de la enfermedad
puede ser determinada uniendo un marcador adecuado a los anticuerpos, o bien el tejido enfermo
puede ser atacado mediante el transporte de un
fármaco adecuado con anticuerpos. La solicitud
describe anticuerpos construidos para facilitar el
suministro especifico de un agente como “anticuerpos alterados”.
La solicitud PCT WO83/03971 se relaciona
con una proteı́na hı́brida que comprende anticuerpos - toxinas enzimáticamente activas.
La solicitud PCT WO83101533 describe, en la
página 5, anticuerpos quiméricos con la región variable de una molécula de inmunoglobulina enlazada a una porción de una segunda proteı́na que
puede comprender la porción activa de un enzima.
Boulianne et al., Nature, 312:643 (1984) construyeron un gen de inmunoglobulina en donde los
segmentos de ADN que codifican regiones variables de ratón especı́ficas para el hapteno trinitrofenilo están unidos a segmentos que codifican
regiones constantes mu y kappa humanas. Estos genes quiméricos fueron expresados como IgM
quimérica de ligación a TNP funcional.
Morrison et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA,
81:6851 (1984) crearon una molécula quimérica
utilizando los exones de la región variable de
cadena pesada de un gen de proteı́na de mieloma anti - fosforilcolina, los cuales fueron unidos a los exones de cualquier gen de cadena ligera
kappa humano. Los genes fueron transfectados
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en lı́neas de células de mieloma de ratón, generando células transformadas que produjeron IgG
quimérica de ratón - humana con función de ligación de antı́genos.
Sharon et al., Nature, 309:604 (1984) fusionaron un gen codificador de una región variable
de cadena pesada de ratón especı́fica para azofenilarsonato con el gen de la región constante
de cadena ligera kappa de ratón. Esta construcción se tradujo en una cadena polipéptido
que dimerizó con la correspondiente cadena polipéptido VL - Kappa cuando se introdujo en la
lı́nea celular de mieloma adecuada. La molécula
VHkappa VL Ckappa se ligó al hapteno azofenilarsonato.
Neuberger et al., Nature, 312:604 (1984) unieron el gen de la región variable de cadena pesada
de un anticuerpo especı́fico a un hapteno a un gen
que especifica la sı́ntesis de nucleasa micrococal, y
obtuvieron una molécula hı́brida que tenı́a tanto
actividad de, ligación de antigenos como actividad enzimática.
Serı́a conveniente poder disponer de un activador de plasminógeno selectivo que se caracterice
por una alta afinidad y especificidad por fibrina
en relación a fibrinógeno y que efectuara la activación de plasminógeno únicamente en el medio
ambiente inmediato de un trombo que contiene
fibrina.
Esta invención se relaciona con una molécula
hı́brida recombinante de inmunoglobulina que
tiene un punto de ligación de antı́geno especı́fico
por fibrina enlazada a una segunda proteı́na que
comprende la porción activa de un activador de
plasminógeno. La invención está dirigida también
a la clonación y producción de estas nuevas
moléculas hı́bridas de inmunoglobulina. La invención se refiere además a un método de uso
de estas moléculas hı́bridas recombinantes de inmunoglobulı́na en procesos de inmunodiagnóstico
e inmunoterapéuticos.
La invención comprende también secuencias
genéticas codificadoras de las moléculas hı́bridas
de inmunoglobulina, vectores de clonación g expresión que contienen dichas secuencias genéticas,
huéspedes transformados con dichos vectores
y métodos de producción de dichas moléculas
hı́bridas mediante expresión de las secuencias
genéticas subyacentes en dichos huéspedes. El
resto de la des - crip - ción se refiere a modalidades preferidas de la invención, con referencia a
los dibujos adjuntos, en donde:
La figura 1 muestra la estructura del plasmido
de expresión pSVD8t que codifica la proteı́na de
fusión de t - PA de cadena pesada. Las secuencias codificadoras están indicadas por rótulos
fuera del cı́rculo; los puntos de restricción usados en la construcción están indicados dentro del
cı́rculo. Abreviaturas: VDJ, transposición productiva de cadena pesada de 59D8; 2b - CH secuencia genómica de la región constante de cadena pesada 2b murı́nica; t - PA - , secuencia de
CADN codificadora de la cadena de t - PA humano; 3’ - UT, secuencia 3’ - no traducida del
CADN de t - PA humano; Ampr , gen de resistencia a ampicilina pBR322; gpt, gen de guuanina
fosforribosil transferasa de E. coli impulsado por
el promotor SV40; R1, Eco R1.
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La figura 2 muestra el ensayo con substrato
cromogénico que compara la actividad catalı́tica
de la proteı́na recombinante con la del t - PA de
melanoma. Figura 2A: Como se muestra por las
lı́neas discontinuas, el ensayo S - 2288 se llevó a
cabo con 105 ng (cı́rculos blancos) o 70 ng (cuadrados blancos) de proteı́na recombinante. Las
lı́neas sólidas representan la actividad catalı́tica
de 50 ng (cı́rculos negros), 40 ng (cuadrados negros) o 30 ng (triángulos negros) de t - PA de
melanoma, usados como referencias. La actividad molar relativa de la proteı́na recombinante
se determinó por comparación con referencias de
t - PA con proporciones de catálisis similares.
Figura 2B: El ensayo S - 2251 se llevó a cabo
con actividades variables de la referencia de t
- PA de melanoma (cı́rculos blancos), proteı́na
recombinante (cı́rculos negros) y tripsina bovina
(triángulos blancos). Las unidades de actividad
de cada proteı́na se determinaron en el ensayo S
- 2288.
La figura 3 ofrece una comparación del comportamiento de ligación de anticuerpo anti - fibrina 59D8 y proteı́na recombinante. Las curvas representan la inhibición de ligación de anticuerpo a monómero de fibrina en fase sólida mediante competición con diversas concentraciones
de monómero de fibrina soluble. El anticuerpo
recombinante (lı́neas discontinuas) requiere una
concentración de fibrina soluble, para una inhibición del 50%, ligeramente mayor que la del anticuerpo (lı́neas continuas) y de este modo liga
fibrina con algo menos de avidez. Esta diferencia
es inferior a 10 veces.
Esta invención está dirigida a una molécula
hı́brida de inmunoglobulina que tiene tanto actividad de ligación de antigeno como actividad enzimática. Más concretamente, esta invención está
dirigida a una molécula hı́brida recombinante de
inmunoglobulina que tiene un punto de ligación
de antigeno especı́fico por fibrina enlazada a una
segunda proteı́na que comprende la porción activa
de activador de plasminógeno. Esta invención
está dirigida también a la clonación y producción
de estas nuevas moléculas hı́bridas de inmunoglobulina.
En toda esta des - crip - ción, se emplea el
término “molécula hı́brida de inmunoglobulina”
para designar una sola molécula producida por
técnicas de ADN recombinante y que comprende
la totalidad o una porción de un anticuerpo especı́fico por fibrina y la totalidad o una porción de
un activador de plasminógeno. Los términos anticuerpo heterobifuncional, heteroanticuerpo, anticuerpo biespecı́fico, anticuerpo de heteroligación,
duplex de anticuerpo y heterodı́mero, se refieren
todos ellos más especı́ficamente a un anticuerpo
de doble especificidad, es decir, dos puntos de
combinación de anticuerpos en una molécula.
El término “especificidad por fibrina” tal y
como aquı́ se emplea se refiere a anticuerpos
dirigidos contra fibrina. Cuando la sangre escapa de la vasculatura, una cascada intrincada
de reacciones enzimáticas convierte fibrinógeno a
fibrina, la proteı́na estructural de la sangre coagulada. El fibrinógeno mismo es el menos soluble de las proteı́nas del plasma. Con un peso
molecular de 340. 000 kd, posee una simetrı́a
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de dos veces que surge de tres pares de cadenas polipéptidas no idénticas denominadas A alfa, B - beta y gamma. En el punto de trombosis, la cascada de coagulación se activa para generar trombina, la cual rompe enzimáticamente
péptidos polares (Fibrinopéptido A a partir A alfa y Fibrinopéptido B a partir B - beta), y se
traduce en la formación de monómero de fibrina.
Los monómeros de fibrina, que son mucho menos solubles, se polimerizan espontáneamente a
una red gelificada. Después de la polimerización,
el coágulo de fibrina es estabilizado por Factor
XIIIa, el cual introduce enlaces covalentes de e (g - glutamil) lisina en la cadena. El fibrinógeno
y la fibrina son idénticos en más del 98% de su
estructura y únicamente se diferencian en dos terminales amino recientemente expuestos, los de las
cadenas alfa y beta de fibrina. Ya se conoce la secuencia de aminoácidos de estos terminales amino
de fibrina. Doolittle, R.F., “Fibrinogen and Fibrin”, en Putnam, F.W., ed. The Plasma Proteins: Structure Function, and Genetic Control,
3d ed., Vol. 2, New Tork: Academic Press, 1975;
109 - 156.
Los epitopos de fibrina que pueden ser usados
en esta invención incluyen el terminal amino de la
cadena beta de fibrina, el terminal amino de la cadena alfa de fibrina, las secuencias de aminoácidos
de beta (43 - 49), que son carboxi - terminales respecto a un punto de disociación de plasmina, y el
punto de reticulación de la cadena gamma.
Anticuerpos con especificidad a fibrina han
sido descritos en Hui et al., Science, 222: 1129
(1983). Otra des - crip - ción del mismo tipo
de anticuerpos puede encontrarse en la solicitud de patente USA copendiente n◦ 2 de serie
824.228, presentada el 30 de Enero de 1986 (USA
- 4927916) para “Fibrin - Specific Monoclonal Antibodies Lacking Fibrinogen Cross - Reactivity”.
Anticuerpos monoclonales especı́ficos por fibrina
con prácticamente ninguna reactividad cruzada
con fibrinógeno, han sido descritos también en la
solicitud de patente USA copendiente n◦ de serie
851.514, presentada el 14 de Abril de 1986. Otros
ejemplos de anticuerpos con especificidad contra
fibrina incluyen Kudryk et al., Mol. Imm., 21:89
(1984); solicitud de patente europea 146.050 de
Callewaert, publicada el 26 de Junio de 1985, para
“Site Selective Plasminogen Activator and Method of Making and Using Same” y solicitud de
patente australiana AU - A - 25387/84 de Bundesen et al., para “Monoclonal Antibodies with
Specificity for Crosslinked Fibrin and Their Diagnostic Uses”.
En la preparación de las moléculas hı́bridas
de inmunoglobulina de esta invención, la totalidad del anticuerpo especı́fico por fibrina puede ser
clonado y comprende una porción de la molécula
hı́brida. Sin embargo, con el fin de reducir el
tamaño de la molécula hı́brida de inmunoglobulina, ası́ como para reducir la antigenicidad, es
preferible usar solo aquella región del anticuerpo
que reconocerá fibrina y se ligará a la misma.
La clonación de esta región del anticuerpo especı́fico por fibrina requiere el conocimiento de
la estructura y función de los anticuerpos. De
forma breve, los anticuerpos son inmunoglobulinas tetraméricas consistentes en dos cadenas li-
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geras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H)
idénticas. Cada cadena de proteı́na consiste en
dos regiones principales: la región variable (V) N
- terminal y la región constante (C) C - terminal.
Las cadenas ligera (VL ) y pesada (VH ) variables
forman el dominio de región variable. El dominio
variable determina el reconocimiento y especificidad a un antı́geno particular. Los dominios de
región constante de las cadenas ligera (CL ) y pesada (CH ) mediatizan la función efectora responsable de ejecutar la inmunorrespuesta. La región
de bisagra (J) de la molécula de anticuerpo conecta el fragmento Fab con el fragmento Fc del
anticuerpo.
Dentro de la región variable pueden existir
regiones hipervariables conocidas como dominios
de diversidad (D). Estos dominios de diversidad
están relacionados con exones observados en los
genes codificadores de las regiones variables.
El dominio variable de un anticuerpo, una definición estructural de proteı́na, consiste en ambos
segmentos VL y VH de las cadenas ligera y pesada. Contiene 6 regiones hipervariables, 3 en la
cadena ligera y 3 en la cadena pesada. A nivel
genético, 3 exones son responsables de especificar
VH, incluyendo su estructura y regiones hipervariables; 2 exones especifican VL. Las dos primera
regiones hipervariables de VL y de VH son especificadas por los exones del gen V de las cadenas ligera y pesada respectivamente. La tercera región
hipervariable de la cadena ligera es especificada
por dos exones, VL y JL. La tercera región hipervariable de la cadena pesada es especificada por
tres exones VH, D y JH.
La expresión del gen de inmunoglobulina ocurre a través de la unión del gen V con el gen C
mediante recombinación somática en los linfocitos
B. Estos genes se unen para formar la inmunoglobulina completa. Los segmentos genéticos unidos,
transpuestos, codifican entonces la inmunoglobulina completa o dominios de ligación de antı́geno
de las cadenas variables ligera y pesada.
Existen 5 clases principales de cadenas pesadas, caracterizadas por propiedades quı́micas e
isotı́picas. Estas clases de cadenas pesadas son
referidas como mu, gamma, delta, alfa y epsilon.
Existen también dos clases principales de cadenas
ligeras: kappa y lambda.
En esta invención, un anticuerpo especı́fico
por fibrina es clonado como parte de la molécula
hı́brida de inmunoglobulina. Preferentemente,
únicamente se clona la región variable del anticuerpo de fibrina. La cadena ligera variable o
la cadena pesada variable, o bien ambas, comprenden parte de la molécula hı́brida. Además,
la región de bisagra del anticuerpo especı́fico por
fibrina puede ser clonada. El dominio constante de la porción Fab del anticuerpo especifico
por fibrina unida a la región variable, puede ser
también clonada.
Las regiones variable y constante del anticuerpo especı́fico por fibrina clonadas y utilizadas
en la molécula hı́brida de inmunoglobulina pueden ser de origen mamı́fero, prefiriéndose aquellas
derivadas de humanos. Alternativamente, la
región variable puede ser de origen mamı́fero,
siendo la región constante de origen humano.
Los activadores de plasminógeno que pueden
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ser usados en esta invención incluyen uroquinasa, prouroquinasa, activador de plasminógeno
de tipo tisular y estreptoquinasa. Cuando el
plasminógeno se convierte, mediante un activador, en plasmina, el enzima fibrinolı́tico activo
del plasma, desarrolla una notable afinidad por
su substrato, fibrina.
El término “activador de plasminógeno” es
por tanto un agente trombolı́tico y debe apreciarse que en esta des - crip - ción se incluye cualquier agente utilizado. Se conocen otros términos
en la técnica para la lisis de un trombo, incluyendo fibrinolisis. Aunque los activadores de
plasminógeno más comunes son estreptoquinasa,
uroquinasa, prouroquinasa y activador de plasminógeno de tipo tisular, en esta invención se
puede emplear cualquier otro activador de plasminógeno o agente trombolı́tico.
En la preparación de las moléculas hı́bridas de
inmunoglobulina de esta invención, todo el activador de plasminógeno puede ser clonado y expresado como parte de la molécula hı́brida. Preferentemente, solo se clona la porción activa del
activador de plasminógeno. Este punto activo o
punto catalı́tico puede ser determinado mediante
una experimentación de rutina, como se describe
en.los ejemplos.
El proceso para la obtención de una molécula
hı́brida de inmunoglobulina según la presente invención requiere la clonación del anticuerpo especı́fico a fibrina y del activador de plasminógeno
y la expresión de sus secuencias de ADN a una
sola molécula hı́brida.
Las secuencias de ADN del anticuerpo especı́fico a fibrina y del activador de plasminógeno
empleados para la preparación de la molécula
hı́brida de inmunoglobulina, puede derivarse de
diversas fuentes. Estas fuentes incluyen ADN
genómico, cADN, ADN sintético y combinaciones de los mismos. El ADN genómico puede o no
incluir intrones de origen natural.
El ADN obtenido a partir de ADN genómico
o cADN puede obtenerse de varias formas. Pueden aislarse células codificadoras de la secuencia
deseada, el ADN genómico Se fragmenta, convenientemente mediante una o más endonucleasas
de restricción, y los fragmentos resultantes son
clonados y evaluados con una sonda respecto a la
presencia de la secuencia de ADN codificadora de
especificidad a fibrina o con respecto al activador
de plasminógeno.
Para la región variable del anticuerpo especı́fico a fibrina, el ADN codificador de la cadena
pesada transpuesta puede incluir regiones V, D y
J. El ADN codificador de la cadena ligera de la
lı́nea germinal transpuesta puede incluir las regiones V y J. Una vez que el fragmento clonado ha
sido identificado como conteniendo el punto de ligación deseado de la secuencia de ADN especifica
a fibrina, este fragmento puede ser manipulado
adicionalmente para separar el ADN superfluo,
para modificar uno o ambos terminales y para
separar la totalidad o una porción de secuencias
intervinientes (intrones) o similares.
La unión de los diversos fragmentos se efectúa
según técnicas convencionales, empleando terminales de extremos romos o de extremos escalonados para la ligación, digestión con enzimas de
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restricción para proporcionar terminales adecuados, relleno de extremo cohesivos en la forma
adecuada, tratamiento con fosfatasa alcalina para
evitar una unión indeseable y ligación con las ligasas adecuadas.
Para cADN, el cADN puede ser clonado y el
clon resultante es evaluado con una sonda adecuada respecto al cADN que codifica la región
variable o constante deseada. Una vez aislado
el clon deseado, el cADN puede ser manipulado prácticamente del mismo modo que el ADN
genómico. Sin embargo, con cADN no existirán
intrones o secuencias intervinientes.
Por otro lado, los genes del anticuerpo especı́fico a fibrina y los genes del activador de plasminógeno pueden ser sintetizados de acuerdo con
medios bien conocidos y clonados para utilizarse
en la preparación de la molécula hı́brida de inmunoglobulina.
Para expresar la molécula hı́brida de inmunoglobulina, son necesarias señales de transcripción
y traducción reconocidas por un huésped adecuado. Los huéspedes eucarióticos serán células
de mamı́feros capaces de cultivarse in vitro, particularmente leucocitos, más especialmente células
de mieloma, u otros linfocitos transformados u
oncogénicos, por ejemplo, células transformadas EBV. Alternativamente, se pueden emplear
células que no son de mamı́feros, tales como bacterias, hongos, por ejemplo, levadura, hongos filamentosos y similares.
La secuencia de ADN que codifica la región
variable especı́fica a fibrina puede obtenerse en
asociación con la región promotora del ADN
genómico. En la medida que las células huésped
reconocen las señales reguladoras de transcripción
e iniciadoras de la traducción asociadas con la
región variable, la región 5’ de la secuencia codificadora de la región variable puede entonces
retenerse y emplearse para regular el inicio de la
transcripción y de la traducción.
La región 5’ no codificadora contigua a la
región variable incluirá normalmente aquellas secuencias implicadas con la iniciación de la transcripción y de la traducción, tal como la caja
TATA, la secuencia terminadora, la secuencia
CAAT y similares. Normalmente, la secuencia
5’ - no codificadora será de por lo menos 150 pb,
más normalmente de por lo menos 200 pb, en general sin exceder de 2 kpb, más normalmente sin
exceder de 1 knb aproximadamente.
La región no codificadora 3’ respecto a la
región constante especı́fica a fibrina puede retenerse por sus secuencias reguladoras de la terminación de la transcripción, tales como terminación y poliadenilación. Además, la región no
codificadora 3’ respecto a la región codificadora
contiene también un estimulador importante en
genes de inmunoglobulina. Ası́, mediante la retención de la región 3’ contigua de forma natural
a la secuencia de ADN que codifica la región constante, pueden proporcionarse las señales de terminación de la transcripción. Cuando las señales de
terminación de la transcripción no son satisfactoriamente funcionales en la células huésped de
expresión, entonces puede emplearse una región
3’ funcional en la célula huésped.
Las construcciones para el anticuerpo es6
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pecı́fico a fibrina y activador de plasminógeno
pueden unirse entre sı́ para formar un solo segmento de ADN, o bien pueden mantenerse como
segmentos separados, bien por sı́ mismos o bien
en combinación con vectores.
La construcción o construcciones pueden introducirse en una célula mediante transformación
en combinación con un gen que permita la selección en donde la construcción llegará a integrarse en el genoma del huésped. Normalmente,
la construcción será parte de un vector que tiene
un sistema de replicación reconocido por la célula
huésped.
Los vehı́culos de expresión para la producción
de las moléculas de la invención incluyen plasmidos u otros vectores. En general, en conexión
con el huésped, se utilizan aquellos vectores que
contienen secuencias de replicones y de control
derivadas de especies compatibles con una célula
huésped. El vector lleva normalmente un punto
de replicón, ası́ como genes especı́ficos que son
capaces de proporcionar una selección fenotı́pica
en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se
transforma fácilmente usando pBR322, un plasmido derivado de una especie de E. coli. El
pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y, de este modo, proporciona
un medio sencillo para identificar células transformadas. El plasmido pBR322 u otros plasmados microbiales deben contener también, o han
de modificarse para que contengan, promotores
que pueden ser usados por el organismo microbial para la expresión de sus propias proteı́nas.
Aquellos promotores más normalmente usados en
la construcción de ADN recombinante incluyen
beta lactamasa, sistemas promotores de lactosa,
promotores de fagos lambda y los sistemas promotores de triptofano. Aunque estos son los más
generalmente usados, han sido descubiertos otros
promotores microbiales que pueden ser utilizados.
Por ejemplo, una construcción genética para
la molécula hı́brida de inmunoglobulina puede
colocarse bajo el control del promotor de la izquierda de bacteriofago lambda. El control es
ejercido por el represor lambda y se conocen puntos de restricción adyacentes.
La expresión de la molécula hı́brida de inmunoglobulina puede colocarse también bajo control
de otras secuencias reguladoras que pueden ser
homólogas al organismo en su estado no transformado. Por ejemplo, el ADN cromosómico de E.
coli dependiente de lactosa comprende un operón
lactosa o lac que mediatiza la utilización de lactosa mediante la elaboración del enzima beta galactosidasa. Los elementos de control lac pueden obtenerse a partir del bacteriofago lambda
plac5, el cual es ineficaz para e. coli. El sistema
promotor - operador lac puede ser inducido por
IPTG.
Igualmente, pueden emplearse otros sistemas
promotores/operadores o porciones de los mismos. Por ejemplo, se pueden emplear colicina
El, galactosa, fosfatasa alcalina, triptofano, xilosa, tax y similares.
Los huéspedes preferidos son células de
mamı́feros, desarrolladas in vitro en cultivo de
tejidos o in vivo en animales. Las células de
mamı́feros proporcionan modificaciones posterio-
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res a la traducción a moléculas proteı́nicas de inmunoglobulina que incluyen el doblado o glicosilación correctos en los puntos igualmente correctos.
Células de mamı́feros que pueden ser útiles
como anfitriones incluyen células de origen fibroblástico tales como VERO o CHO - K1, o
células de origen linfoide, tales como el hibridoma
SP210 - AG14 o el mieloma P3x63Sg8, y sus derivados. Las células huéspedes de mamı́feros preferidas incluyen SP210 y J55BL. Varias lı́neas celulares segregan uroquinasa y pueden ser empleadas
para la transfección, tales como células cultivadas
de carcinoma de riñón (Ferraivolo, et al., J. Cell.
Phusiol., 121:363 (1984)) y células (Belin et al.,
EMBO J., 3:190 (1984)).
Para un huésped mamı́fero, se disponen de
varios sistemas de vectores posibles para la expresión de la molécula hı́brida de inmunoglobulina. Una clase de vectores utiliza elementos de
ADN que proporcionan plasmidos extra - cromosómicos de replicación autónoma, derivados de
virus animales tales como virus de pa - pi - lo ma bovino, virus de polioma, adenovirus o virus
SV40. Una segunda clase de vectores está basada en la integración de las secuencias del gen
deseado en el cromosoma de la célula huésped.
Pueden seleccionarse células que han integrado de
forma estable el ADN introducido en sus cromosomas introduciendo también uno o más marcadores que permiten la selección de células huésped
que contienen el vector de expresión. El marcador puede proporcionar prototrofia a un huésped
auxotrófico, resistencia biocida, por ejemplo antibióticos, o metales pesados. tal como cobre, o
similares. El gen marcador seleccionable puede
enlazarse directamente a las secuencias genéticas
de ADN a expresar, o bien puede introducirse en
la misma célula mediante co - transfección. Pueden necesitarse también otros elementos para la
sı́ntesis óptima de mARN de proteı́na de ligación
de una sola cadena. Estos elementos pueden incluir señales de unión, ası́ como promotores de la
transcripción, estimuladores y señales de terminación. Los vectores de expresión de cADN que
incorporan tales elementos incluyen aquellos descritos por Okayama, H., Mol. Cel. Biol., 3:280
(1983) y otros.
Puede emplearse una amplia variedad de secuencias reguladoras de la transcripción y de
la traducción, en función de la naturaleza del
huésped. Las señalesreguladoras de la transcripción y de la traducción pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, virus de pa
- pi - lo - ma bovino, virus Simian y similares, en donde las señales reguladoras se asocian
con un gen particular que tiene un alto nivel de
expresión. Alternativamente, pueden emplearse
promotores derivados de productos de expresión
de mamı́feros, tales como actina, colágeno, miosina, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras del inicio de la transcripción que permitan
la represión o activación, de manera que pueda
modularse la expresión de los genes. De interés
son las señales reguladoras sensibles a la temperatura, de modo que variando la temperatura, la
expresión puede ser reprimida o iniciada, o bien
señales reguladoras que están sujetas a regulación
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quı́mica, por ejemplo, metabolitos.
Otro huésped preferido es levadura.
La
levadura proporciona ventajas sustanciales ya
que puede llevar a cabo también modificaciones
péptidas posteriores a la traducción, incluyendo
glicosilación. Existen varias estrategias de ADN
recombinante que utilizan secuencias promotoras
fuertes y un alto número de copia de plasmidos que pueden ser utilizados para la producción
de las proteı́nas deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias de guı́a en productos genéticos de mamı́feros clonados y segrega
péptidos portadores de las secuencias de guı́a (es
decir, pre - péptidos).
Puede emplearse cualquiera de una serie de
sistemas de expresión de genes de levadura que incorporan elementos promotores y de terminación
a partir de los genes expresados de forma activa
y que codifican enzimas glicolı́ticos producidos en
grandes cantidades cuando la levadura se hace
crecer en medios ricos en glucosa. Los genes glicolı́ticos conocidos pueden proporcionar también
señales de control de la transcripción muy eficientes. Por ejemplo, puede utilizarse las señales promotoras y terminadoras del gen de fosfoglicerato
quinasa.
Una vez que el vector o secuencia de ADN
que contiene la construcción o construcciones ha
sido preparado para la expresión, la construcción
o construcciones de ADN pueden introducirse en
un huésped adecuado. Pueden emplearse varias
técnicas, tales como fusión de protoplastos, precipitación de fosfato cálcico, electroporación u otras
técnicas convencionales. Después de la fusión, las
células se hacen crecer en un medio selectivo, en
donde las células no transformadas son destruidas, dejando únicamente células transformadas
con la construcción de ADN. La expresión del gen
o genes se traduce en un conjunto para formar la
molécula hı́brida de inmunoglobulina.
Las células huésped serán en su mayor parte
células inmortalizadas, particularmente células de
mieloma o linfoma. Estas células se pueden hacer crecer en un medio nutriente adecuado en
matraces de cultivo o puede inyectarse en un
huésped sinérgico, por ejemplo, ratón o rata, o
en un huésped o punto de un huésped inmunodeficiente, por ejemplo, en la bolsa de un ratón
o hámster. En particular, las células pueden introducirse en la cavidad abdominal para la producción de fluido ascı́tico y posterior recogida
del receptor quimérico. Alternativamente, las
células pueden ser inyectadas subcutáneamente
y los anticuerpos pueden recogerse de la sangre
del huésped. Las células se pueden emplear del
mismo modo que las células hibridomas. Véase
Diamond et al., N. Eng. J. Med. (1981) 304:1344
y Kennatt, McKearn y Bechtol (eds.), Monoclonal Antibodies: Hubridomas - - A New Dimension
in Biologic Analysis, Plenum, 1980, cuya información se incorpora aquı́ solo con fines de referencia.
La molécula hı́brida de inmunoglobulina
puede aislarse y purificarse según técnicas convencionales, tales como extracción, precipitación,
cromatografı́a, cromatografı́a de afinidad, electrofóresis y similares. El método preferido es
la cromatografı́a de afinidad con el heptapéptido
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amino - terminal de la cadena beta de fibrina (se
liga al punto de antifibrina) o con benzamidina
(se liga al punto catalı́tico de activador de plasminógeno) para aislar selectivamente la molécula
hı́brida.
La presente invención proporciona también
métodos de inmunoterapia e inmunodiagnosis que
utilizan las moléculas hı́bridas de inmunoglobulina. En aplicaciones inmunoterapéuticas y de inmunodiagnóstico, la molécula hı́brida de inmunoglobulina se administra a un paciente, llegando
a localizarse en el punto de un trombo a través
del punto de ligación especı́fico a fibrina de la
molécula hı́brida. El trombo es lisado por la
actividad enzimática de la porción del activador
de plasminógeno de la molécula hı́brida. Como
podrá ser apreciado por el experto en la materia,
la especificidad de la molécula hı́brida de activador de plasminógeno especı́fico a fibrina permite
la selectividad de unión al trombo y la lisis de este
último, lo cual reduce el riesgo de efectos secundarios serios, tales como hemorragias.
Las moléculas hı́bridas de inmunoglobulina de
esta invención se pueden emplear también en aplicaciones de inmunodiagnóstico, incluyendo inmunodiagnosis in vivo. En esta aplicación, la
molécula hı́brida es marcada de forma detectable usando un radionúclido. El radionúclido debe
ser del tipo de decadencia, el cual es detectable
por un cierto tipo de instrumento. Además, el radionúclido para la diagnosis in vivo deberá tener
una vida media suficientemente larga para que todavı́a sea detectable en el momento de la máxima
absorción, pero suficientemente corta para que,
después de la diagnosis, no permanezca radiación
indeseable en el paciente. El acoplamiento de
los radionúclidos a la proteı́na de este modo a
la molécula hı́brida, ya se conoce por el estado
de la técnica y suele efectuarse bien directamente
o bien indirectamente usando un grupo funcional intermediario. Ejemplos de radioisótopos que
pueden ser utilizados para la diagnosis in vivo son
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Tc, 123 I, 131 I, 111 In, 97 Ru, 67 Cu, 67 Ga, 72 As,
89
Zr y 201 Tl.
Según los métodos de esta invención, pueden emplearse también isótopos paramagnéticos
para diagnosis in vivo. Ejemplos de elementos
que son particularmente útiles para utilizarse en
técnicas de energı́a de resonancia magnética incluyen 157Gd, 55 Mn, 162 Dy, 52 Cr y 56 Fe.
La molécula hı́brida de inmunoglobulina
puede constituir además una composición farmacéutica junto con un vehı́culo farmacéuticamente aceptable. Estos vehı́culos son bien conocidos en la técnica y pueden incluir emulsiones o
suspensiones acuosas o en disolventes, incluyendo
salina y medios tamponados. Véase, por ejemplo,
la técnica farmacéutica recogida en Remington’s
Pharmaceutical Sciences (16a
¯ Edición, 1980).
Las proporciones de dosificación para la administración de la molécula hı́brida de inmunoglobulina son aquellas que resultan suficientemente
grandes para detectar la presencia de trombos.
La dosis no deberá ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, tales como reacciones
de hipersensibilidad, por ejemplo, salpullido o
shock anafiláctico. En general, la dosis variará
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en función de la edad, estado, sexo y grado de
enfermedad del paciente. Las contraindicaciones pueden incluir hipersensibilidad y otras variables y pueden ser ajustadas por el médico.
La dosis puede oscilar desde 0,01 a 500 mg/kg
de peso corporal, preferentemente de 0,01 a 200
mg/kg. La molécula o moléculas hı́bridas de inmunoglobulina pueden administrarse parenteralmente por inyección o mediante perfusión gradual
en el tiempo. También pueden administrarse por
vı́a intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o
subcutánea.
Una vez descrita la invención en términos generales, la misma llegará a ser más fácilmente
evidente por referencia a los siguientes ejemplos
especı́ficos los cuales se incluyen únicamente con
fines ilustrativos y de ningún modo intentan ser
limitativos, salvo que se indique lo contrario.
Ejemplos
Ejemplo 1
Materiales
Se adquirieron 3 - (2 - piridilditio)propionato
de N - succinimidilo (SPDP) y 2 - iminotiolano en
Pierce y se adquirió Sepharose 4B - CL en Pharmacia. El 125 I fibrinógeno (IBRIN) se adquirió
en Amersham. El plasma se obtuvo a partir del
banco de sangre local. Helena Labs. suministró
el substrato cromogénico para proteasas, dihidrocloruro de H - D - isoleucil - L - propil - L arginina - p - nitroanalida (S - 2288). Todos
los otros productos quı́micos fueron suministrados por Sigma o Fisher.
El anticuerpo 64C5 especı́fico a fibrina ha sido
descrito en Hui et al., supra y en solicitud de patente USA copendiente n◦ de serie 824.228, incorporada aquı́ solo con fines de referencia. El
anticuerpo 59D8 especı́fico a fibrina ha sido descrito en la solicitud de patente USA copendiente
n◦ de serie 851.514, incorporada también solo con
fines de referencia.
Electrofóresis u autorradioarafı́a
Se llevó a cabo SDS - PAGE de acuerdo con
el método de Laemmli, Nature (London), 277:681
(1970). Las proteı́nas fueron visualizadas utilizando Coomassie Brilliant Blue R o, cuando fueron radiomarcadas, usando autorradiografı́a durante 24 - 72 horas a - 70◦C.
Clonación del gen de uroquinasa
Un clon de ADN complementario (PHUK8)
que contiene la secuencia codificadora de cadena
B catalı́tica fue aportado de forma desinteresada
por el Dr. F. Blasi (Verde et al., Proc. Nat’l.
Acad. Sci. USA, 81:4727 (1984)). Este clon
se hizo crecer y se aisló en cantidad en pBR322.
Un segmento de este clon de ADN se utilizó en
construcciones con genes de anticuerpos anti fibrina, empleándose para aislar la secuencia de
ADN genómico.
Clonación del gen de tPA
El Dr. Sandra Degen aportó de forma desinteresada un clon de ADN complementario de longitud completa del gen de tPA humano (PPA34’F).
La secuencia codificadora de la cadena B catalı́tica de tPA fue extractada del clon y, en el
extremo 5’ de esta secuencia se colocó un segmento corto único de ADN sintético (adaptador)
codificador de dos puntos comunes de disociación
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con enzimas de restricción. Este adaptador permite que el gen se una convenientemente “en el
marco de lectura” a otros segmentos de ADN.
Este clon ası́ construido se utiliza en construcciones con genes de anticuerpos anti - fibrina. Se
utiliza también para aislar la secuencia genómica
codificadora del cadena B de tPA y la secuencia
genómica se utiliza posteriormente en construcciones con los genes 59D8.
Clonación de los genes de cadenas ligera y pesada variables del anticuerpo 64C5 especı́fico a fibrina.
Usando un oligonucleótido redundante 17 mer, que fue sintetizado para corresponderse con
el terminal amino de la cadena ligera de 64C5 y
una sonda kappa/J disponible, la transposición
de cadena ligera de 64C5 productiva fue clonada
a partir de una biblioteca subgenómica construida
en pBR322. La cadena ligera entera fue reconstruida por ligación del fragmento transpuesto clonado en un plásmido pBR322 que contiene un
fragmento EcoR1/BamH1 de 5,8 Kb, el cual codifica la región constante kappa de ratón y segmentos de unión (Max, et al, J. Biol, Chem., 256:5116
- 20 (1981)). La transposición Vi se colocó 5’ de
la región constante en la orientación correcta. El
ADN genómico derivado del hibridoma 64C5 fue
digerido con enzima de restricción EcoR1, fraccionado por tamaños en un gel de agarosa preparativo y posteriormente ligado en un vector de clonación lambda para producir una biblioteca subgenómica. Usando una sonda de la región de
unión de cadena pesada, se clonó un fragmento
transpuesto. Se determinó que era la transposición de cadena pesada usada en el hibridoma
64C5 por hibridación a un oligonucleótido basado
en la secuencia amino - terminal del anticuerpo.
Clonación del gen de cadena pesada variable
del anticuerpo 59D8 especifico a fibrina.
El ADN genómico del hibridoma 59D8 fue
fraccionado por tamaños, ligado en un vector de
clonación lambda y evaluado con la sonda de la
región de unión de cadena pesada anteriormente
indicada. Ambas transposiciones de cadena pesada fueron clonadas y se seleccionó la productiva mediante hibridación a un oligonucleótido 20
- mer basado en la secuencia de ARN de la cadena
pesada de 59D8.
Construcciones genéticas de anticuerpo especı́fico a fibrina/activador de plasminógeno.
El fragmento de restricción clonado, que contiene regiones variable y de unión ası́ como secuencias estimuladoras del gen 59D8 o 64C5,
se introduce en la orientación correcta en un
plásmido 5’ de la secuencia de región constante
de cadena pesada 2B gamma de ratón. Este
plásmido que contiene la secuencia de región constante (PSV GPT/gamma 2B) contiene también
el gen de resistencia a ampicilina de pBR322, y
el gen de guanina fosforribosil transferasa (GPT)
bajo control del promotor viral SV40. Fue una
aportación gratuita del Dr. Richard Neer. Esta
construcción es propagada en E. coli MC1061 por
vı́a del gen de resistencia a ampicilina y pudo seleccionarse la expresión del gen de GPT en eucariotos respecto a la presencia de xantina, hipoxantina y ácido micofenólico. Posteriormente
se separó el grueso de la secuencia codificadora
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del terminal carboxi de la región constante de cadena pesada. Se reemplazó con un fragmento de
ADN complementario que codifica la cadena carboxi “B” catalı́tica o uroquinasa o activador de
plasminógeno de tejido. El tercer exon de cualquiera de los genes de región constante de cadena
pesada se une en el mismo marco a uno de los genes de activador de plasminógeno, de manera que
se produzca la secuencia usual de aminoácidos y
se obtenga una proteı́na compuesta. Esta construcción final es transfectada por electroporación
en la variante hibridoma 59D8 o 64C5 adecuada
que ha sido detenida produciendo la cadena pesada usual. Estos transfectantes producen una
molécula de anticuerpo con especificidad a fibrina, con la mitad activador de plasminógeno en
el extremo de cola de la cadena pesada truncada.
Purificación de moléculas hı́bridas uroquinasa
- 64C5 de inmunoglobulina.
La molécula hı́brida se aı́sla utilizando cromatografı́a de afinidad sucesiva sobre benzamidina Sepharose y beta - péptido - Sepharose, con el
fin de obtener moléculas hı́bridas que contienen
un punto de combinación de anticuerpo y secuencia de uroquinasa o de tPA. La columna de afinidad es construida acoplando un péptido de fibrina
de cadena beta amino - terminal sintético (Gly His - Arg - Pro - Leu - Asp - LyS - Cys (beta
péptido)) Hui, et al., Science, 222:1129 (1983) a
maleimidobenzoil lisina - Sepharose C1 - 4B Kitagawa, et al., J. Biochem, (Japon), 79233 (1976).
El eluado de esta columna (0,2 m glicina.HCl, pH
2,8) se recupera y se analiza para determinar las
propiedades de ligación de fibrina y la actividad
fibrinolitica.
Purificación de moléculas hı́bridas tPA - 59D8
de inmunoalobulina.
Las moléculas hı́bridas de inmunoglobulina
son purificadas a partir de las células huésped mediante cromatografı́a de afinidad secuencial en dos
etapas. Las moléculas se aplican en primer lugar
a Sepharose CL - 4B que contiene benzamidina
inmovilizada y se retienen las moléculas hı́bridas
de tPA - anticuerpo las cuales son posteriormente
eluidas con 0,1 M acetato, 0,4 M NaCl (pH 4,0).
Después de la neutralización, el eluado se aplica
a la columna de péptido - Sepharose. El eluado
de la columna de beta péptido (0,2 M glicina, pH
2,8), se dializa contra tampón NaPi que incluye
1 M arginina y 0,1% de Tween 80 y se guarda en
este tampón a 4◦C.
Caracterización de moléculas hı́bridas de inmunoalobulina.
Las moléculas hı́bridas se someten a SDS PAGE en condiciones tanto reductoras como no
reductoras. Los geles son teñidos con azul Coomassie o sometidos a autorradiografı́a (en el caso
de que tPA o UK se marque con 125 I antes del
acoplamiento).
Ensayo con substrato cromogénico para determinar la actividad peptidasa.
Para determinar las propiedades funcionales
de la molécula hı́brida, se examinan en primer lugar sus propiedades peptidolı́ticas con respecto a
un substrato no selectivo, dihidrocloruro de H D - isoleucil - L - propil - L - arginina - p - nitroanalida (S - 2288). El ensayo con S - 2288 se
efectúa con un volumen total de 1 ml en 0,05 m
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Tris - HCI, 0,10 M NaCl (pH 8,5) con una concentración de substrato de 3 x 104 M. La absorbancia
a 405 nm se mide cada 10 segundos a 20◦ C.
Ensayos con fibrinógeno
El contenido en fibrinógeno de muestras de
plasma humano citratado o plasma de conejo citratado se determinó mediante dos métodos. El
fibrinógeno coagulable fue medido mediante el
método de Clauss, Acta Chir. Scand., 90:419
(1957) y el fibrinógeno total se determinó mediante precipitación con sulfito sódico.
Ensayo con coágulo de plasma
Se utiliza el método de Lijnen et al., Thromb.
Haemostas, 52:308 (1984) con las siguientes modificaciones. Plasma humano congelado obtenido de donantes se reune, se distribuye en partes alı́cuotas y se vuelve a congelar. Inmediatamente antes de cada experimento, se calibran las
actividades de tPA, UK y de sus moléculas hı́bridas de inmunoglobulina empleando el ensayo
con S - 2288 (es decir, se determinan las actividades peptidasa de los activadores de plasminógeno naturales y de sus moléculas hı́bridas y
se efectúan diluciones adecuadas para que al actividad peptidasa (en unidades/ml) sea idéntica en
cada una de las muestras). Se preparan coágulos
de plasma añadiendo a plasma congelado reciente
cada uno de los siguientes materiales: trombina,
8 unidades NIH/ml; 0,5 M CaCl2 , 100 µ/ml; y
fibrinógeno humano marcado con 125 I (IBRIN),
40.000 cpm/ml. La solución se pasa inmediatamente a tubos Silastic (diámetro interno: 4 mm)
y se incuba a 37◦ C durante 30 minutos. El tubo
Silastic que contiene plasma congelado reciente
coagulado se corta en secciones de 1,5 cm, para
obtener coágulos de 0,2 ml. Estos se lavan entonces en 0,15 M NaCl antes de su uso. Cada coágulo
se coloca en un tubo de plástico, se efectúa un
conteo y se suspende en 1 ml de plasma congelado
reciente (procedente del mismo depósito). Los experimentos se inician por adición de un activador
de plasminógeno (o molécula hı́brida de activador
de plasminógeno y anticuerpo). A intervalos de
30 minutos, se separa de cada tubo, para proceder
a su conteo, una parte alı́cuota del plasma congelado reciente. Se conservan muestras al final del
experimento para la determinación de los niveles
de fibrinógeno.
Trombolisis in vivo
Se utiliza el modelo de la vena yugular de
conejo de Collen et al, J. Clin. Invest., 71:368
(1983). Después de sedar el conejo con acetopromazina y cetamina, se practica una incisión paramedial desde la mandı́bula derecha hasta por
encima de la clavı́cula derecha. La vena yugular
externa se aı́sla por disección y las ramificaciones
se ligan y se separan. Se introduce un hilo de
lana para sujetar el coágulo. Después de cesar la
sangrı́a, se colocan pinzas vasculares con el fin de
aislar este segmento de la vena yugular externa
y los componentes del coágulo se introducen en
el segmento venoso aislado. Estos componentes
consisten en - aproximadamente 500. 000 cpm
de fibrinógeno humano marcado con 125I (cada
muestra es sometida a conteo antes de su uso),
100 µl de glóbulos rojos sanguı́neos humanos, 100
µl de plasma congelado reciente humano, 10 µl
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de 0,5 m CaCl2 Y 10 µl de trombina bovina (8
unidades NIH). Después de 30 minutos, se retiran las pinzas vasculares y se restablece el flujo
sanguı́neo. Se toma una muestra de sangre inmediatamente después de soltar las pinzas, para
determinar la radioactividad no incorporada en
el trombo. Se diluyen cantidades medidas de activador de plasminógeno a un volumen de 25 ml
y se suministran por vı́a de la vena marginal de
la oreja contralateral durante 4 horas mediante
una bomba de infusión. Se determinan los recuentos mediante jeringas de recuento, esponjas
de gasas y tubos. Seis horas después del inicio de
la infusión, el segmento venoso entero es aislado,
separado y sometido a recuento. El porcentaje de
lisis se determina como la relación de los recuentos que permanecen al término del experimento
con respecto a los recuentos netos al comienzo.
Ensayo fibrinolı́tico
El ensayo fibrinolı́tico cuantitativo consiste en
ligar monómero de fibrina en Sepharose. El fibrinógeno se purifica de plasmina contaminante
mediante paso sobre lisina - Sepharose y luego
se mezcla con trazas de fibrinógeno marcado con
125
I. A continuación se acopla a Sepharose Cl 4B activado con bromuro de cianógeno. El fibrinógeno inmovilizado se convierte a fibrina por
adición de trombina humana en presencia de 100
mM CaCl2 .
Para evaluar su actividad fibrinolı́tica relativa, se incuban cantidades cada vez mayores de
molécula hı́brida 125 I - UK - 64C5 y de uroquinasa
(o molécula hı́brida 125 I - tPA - 59D8 y tPA) con
125
I - fibrina - Sepharose durante 4 horas. A continuación, la resina se incuba con plasminógeno purificado. Después de intervalos de 2,5 y 15 horas,
la mezcla se centrifuga y se determina la radioactividad del sobrenadante. Este procedimiento se
repite con el conjugado de control, (125 I - UK) SS - (3H3).
Ejemplo 2
Materiales y métodos
Clonación del gen de cadena negada 59D8
Se preparó ADN genómico de alto peso molecular a partir de las células hibridomas 59D8
en la forma ya descrita en Quertermous et al.,
J. Immunol., 128:2687 - 2690 (1987). Para identificar genes de inmunoglobulina de cadena pesada transpuesta, especı́ficos a la lı́nea hibridoma
59D8, se lleva a cabo el análisis de transferencia Southern, como ya ha sido descrito, con ADN
genómico digerido con Eco R1 y con una sonda
de región de unión genómica Eco R1/Pst1 de 1,7
kilobases (kb). (Southern, E.M., J. Mol. Biol.,
98:503 - 517; Sakano et al., Nature, 286:676 - 683
(1980)). Se identificaron dos transposiciones que
no se encontraban en ninguna de las células originalmente fusionadas para producir el hibridoma
59D8 (SP210 y Balb/c). A continuación se digirió
1 mg de ADN genómico con Eco R1 y se fraccionó por tamaños en un gel de agarosa preparativo. Southern, E. in Methods in Enzymology, et.
Wu. R. (Academic Press. NY) vol. 68, pp. 152 176. Las fracciones que contenı́an cada uno de los
dos fragmentos transpuestos fueron identificadas
por hibridación a la sonda de la región de unión.
Estas fracciones fueron concentradas y ligadas en
19
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λgt10. Las dos bibliotecas subgenómicas ası́ construidas fueron evaluadas con la sonda de región
de unión y se aislaron varios clonos potenciales a
partir de cada biblioteca. (Maniatis et al., Molecular Cloning. 1982) (Cold Spring Harbor, NY).
La selección del clon que contiene el fragmento
transpuesto codificador del punto de combinación
de antigeno 59D8 se llevó a cabo mediante hibridación a un oligonucleótido de 20 pares de bases
que habı́a sido construido en base a la secuencia del mARN de cadena pesada de 59D8. El
aislamiento y secuenciación de ARN, el marcado
con 32 p del oligonucleótido con T4 polinucleótido
quinasa y la hibridación se llevaron a cabo según
técnicas ya descritas. (Maniatis et al., Molecular
Cloning, supra: Clarke et al., J. Ex - V. Med.
161:687 - 704 (1985); Suggs et al., Proc. Nat’l
Acad. Sci. USA, 78:6613 - 6617 (1981).
Construcción del vector de expresión
La secuencia de t - PA se derivó de un clon
de cADN (pPA34’F) que habı́a sido construido a
partir de mARN de células HELA. Fisher et al.,
J. Biol. Chem., 260: 11223 - 11230 (1985). El
ADN codificador del punto SacI de cadena beta
al punto Eco R1 de pBR322 fue aislado y ligado
en pGEm3. A continuación, se aisló un fragmento
5’ contiguo por digestión con SfaN1 y Sac1. Al
extremo 5’ del segundo fragmento se añadió un
oligonucleótido sintético que contiene un extremo
Bam H1, un punto Xho1 y dos bases reconstituyentes de un codon para glicina. El fragmento
modificado fue ligado entonces en un plásmido
que contiene ya el fragmento 3’, reconstituyendo
ası́ la secuencia de cadena beta. La cadena beta
fue cortada con Xho1 y Sca1, siendo aportado el
punto Sca1 por la secuencia de oBR322.
La construcción final fue montada en el vector pSV2gpt que habı́a sido modificado por la inserción de un poli - enlazador que contiene un
fragmento de restricción Xba1 de 6 kb codificador de la región constante de cadena pesada
γ2b murinica. Mulligan et al., Proc. Nat’l Acad.
Sci. USA. 78:2072 - 2076 (1981); Tucker et al.,
Science, 206:1303 - 1306 (1979). El gen transpuesto productivo de cadena pesada de 59D8 que
habla sido clonado en un fragmento Eco R1 de
2,6 kb, se insertó en la orientación correcta en un
punto Eco R1 del polienlazador 5’ de la región
constante γ2b. La secuencia de la región constante entre el punto Xhol único en CH2 y un
punto Sall en el polienlazador fue cortada, el
punto Sall se hizo romo y la cadena beta de t
- PA se ligó en su sitio. El análisis de la secuencia de nucleótidos confirmó que la unión entre la
cadena pesada y los segmentos de t - PA se encontraba en el mismo marco. Sanger et al., Proc.
Nat’l. Acad. Sci. USA, 74: 5463 - 5467 (1977).
Anticuerpos monoclonales y selección de variantes de pérdida
El anticuerpo monoclonal 59D8 especı́fico a
fibrina fue promovido por inmunización con un
heptapéptido sintético basado en la secuencia
amino - terminal de la cadena beta de fibrina,
como ya ha sido descrito en Hui et al., Science
222:1129 - 1132 (1983). Las células hibridomas y
las variantes de pérdidas se mantuvieron en medio
completo: DMEM con 4,5 mg/ml de glucosa, 12%
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de suero vacuno fetal (FCS), 50 g/ml de sulfato de
gentamicina y 0,6 mg/ml de L - glutamina. Para
la selección de las variantes de pérdida de cadena
pesada, las células se hiciéron crecer en agarosa
blanda. A los platos de cultivo tisular (60 mm) se
añadieron 5 ml de medio completo más 0,2% de
agarosa y 8% más de FCS y se dejó solidificar a
temperatura ambiente durante 3 - 5 minutos. Las
células (1 a 2 x 103 ) a seleccionar respecto a la
pérdida de cadenas fueron depositadas en capas
sobre la agarosa. Los platos se incubaron a 37◦C
en 6% de dióxido de carbono hasta que se formaron racimos de células (2 - 4 dı́as). Para detectar
variantes de pérdida de cadena pesada, los racimos de células fueron cubiertos con una solución
de antisuero (1 ml) conteniendo medio completo
con 0,2% de agarosa y 5 - 10% de cadena pesada
anti - ratón de conejo o cabra. Los racimos de
células que segregan cadena pesada desarrollaron
un halo de precipitina. Los racimos que no tenı́an
un halo de precipitina fueron recogidos de la agarosa blanda mediante una pipeta capilar y se suministraron posteriormente a platos de 96 pocillos que contenı́an medio completo con 8% más
de FCS. Los subclonos individuales fueron ensayados mediante el ensayo con inmunoabsorbente
enlazado a enzimas (ELISA) o mediante transferencia Western respecto a la presencia de cadena
pesada y cadena ligera.
Transfección u selección
La construcción pD8SVtβ fue transfectada en
células variantes de pérdida por electroporación,
usando una fuente de alimentación eléctrica Isco,
en la forma descrita por Potter et al., Proc. Nat’l
Acad. Sci. USA. 81:7161 - 7165 (1984). Las
condiciones óptimas de la transfección fueron una
descarga de 2.000 voltios en 0,8 ml de salina tamponada con fosfato. Los transformantes fueron seleccionados mediante crecimiento en ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. La confirmación
de la transfección y expresión se obtuvo mediante
análisis de transferencia Northern usando una
sonda de CADN de 2 kb codificadora de la porción
3’ de la cadena beta de t - PA humano. Maniatis et al., Molecular Cloning supra. Las lı́neas
de células transfectadas fueron subclonadas de
acuerdo con técnicas convencionales.
Purificación de proteı́na
La proteı́na fue purificada a partir de los sobrenadantes celulares y a partir del fluido ascı́tico
mediante cromatografı́a de doble afinidad secuencial en dos columnas. Una de las columnas se
construyó enlazando el péptido sintético usado
para la generación de 59D8 con Sepharose. La
otra columna consistı́a en un anticuerpo monoclonal de t - PA anti - humano enlazado a Sepharose. Se utilizó una tercera columna, compuesta
de benzamidina enlazada a Sepharose, en los intentos iniciales de purificación. Sin embargo, incluso aunque la benzamidina se liga bien al punto
activo de t - PA y se puede utilizar benzamidina
- Sepharose para purificar la molécula intacta, la
columna no retuvo la proteı́na recombinante.
La purificación de la proteı́na recombinante
se controló mediante dos inmunoanálisis en fase
sólida. Para detectar actividad de anticuerpo anti
- fibrina, se revistieron placas de microvaloración
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de 96 pocillos con monómero de fibrina y se bloquearon con 10% de suero de caballo. Se incubaron entonces con muestras, tras lo cual se lavaron
y se sondaron con Fab anti - ratón de cabra marcado con 125 I. El segundo ensayo o análisis fue
para detectar el antigeno de t - PA asociado con
la actividad del anticuerpo anti - fibrina. En este
ensayo, las placas revestidas con monómero de fibrina se incubaron con sobrenadante de cultivo o
fluido ascitico y se sondaron con t - PA anti - humano marcado con 125I. Debido a que la cadena
de t - PA no posee actividad de ligación de fibrina,
únicamente se detecta proteı́na recombinante que
contiene ambos dominios funcionales.
Análisis de transferencia Western
Se efectuaron transferencias Western a partir de ambas muestras reducida y sin reducir separadas en geles de poliacrilamida y NaDodSO4 ,
usando técnicas ya establecidas. Burnette, W.N.,
Anal. Biochem., 112:195 - 203 (1981). Como
sonda se utilizó Fab anti - ratón o un anticuerpo
monoclonal de tiPA anti - humano marcado con
125
I.
Ensayo de ligación de antigeno
El anticuerpo original (59D8) y la molécula recombinante se ensayaron en primer lugar respecto
a la presencia de antigeno de Fab de ligación de
fibrina. Esto se efectuó con el inmunoanálisis en
fase sólida descrito anteriormente usando, como
sonda, Fab anti - ratón de cabra marcado con
125
I. Se generaron curvas de titulación para 59D8
y para la proteı́na recombinante variando sus concentraciones en el ensayo. Aquella concentración
que proporcionó la misma cantidad de anticuerpo
ligado marcado con 125 I se seleccionó entonces
entre la parte lineal de cada una de las curvas.
A esta concentración de 59D8 o de proteı́na de
fusión, se llevó a cabo un ensayo de competición
en pocillos que habı́an sido revestidos con fibrina
y llenados con varias cantidades de fibrina soluble. La proteı́na que se ligó a la fibrina soluble
en lugar de hacerlo a la fibrina insoluble, se separó mediante lavado antes de la aplicación del
anticuerpo marcado.
Ensayos de la función enzimática
Para comparar la función enzimática de la
proteı́na recombinante con la de t - PA natural, se
examinaron en primer lugar sus propiedades peptidolı́ticas en un ensayo que mide la disociación o
rotura del substrato no selectivo S - 2288 (Helena
Labs. Beaumont, TX). El ensayo se llevó a cabo
en un volumen de 50 µl de tampón (0,15 M Tris,
0,15 M NaCl) con una concentración final 1 milimolar de substrato cromogénico. Se añadieron
varı́as concentraciones de proteı́na recombinante
o de t - PA purificado a partir de la lı́nea de
células de melanoma Bowes (Bio Response, Hayward, CA) y se midió la absorbancia a 405 nm en
una serie de puntos de tiempo.
Para determinar sı́ la proteı́na recombinante
es capaz de activar plasminógeno, se efectuó
un segundo ensayo utilizando el substrato cromogénico S - 2251 (Helena Labs). En primer lugar se determinó, en el ensayo S - 2288, la actividad de t - PA de melanoma, de la proteı́na
recombinante y de tripsina bovina, y se ajustaron las concentraciones de manera que cada en12
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zima estuviera presente en 100 unidades/100 µl.
Se añadieron entonces µl de t - PA de melanoma,
proteı́na recombinante o tripsina bovina en una
dilución en serie a 100 µl de plasminógeno humano (0,15 mg/ml) y 800 µl de substrato S - 2251.
Las muestras se incubaron durante 60 minutos a
37◦C. La reacción se terminó por la adición de
1 ml de ácido acético al 50% y se determinó la
absorbancia a 405 nm.
Resultados
La electroporación de la construcción
pSVD8T (Fig. 1) en las variantes de pérdida de
cadena pesada de 59D8 proporcionó numerosos
clonos transfectados. Cuando se mezclaron aproximadamente 1 x 108 células hibridomas con 50
µg de ADN plásmido circular en 0,8 ml de salina
tamponada con fosfato y la mezcla se sometió a
una descarga de 2.000 voltios, aproximadamente
15 de los pocillos de una placa de 96 pocillos contenı́a clonos resistentes a medicamentos. Aproximadamente el 75% de estos clonos segregaron la
proteı́na recombinante. Se seleccionaron 5 clonos
para su análisis posterior en base a su velocidad
de crecimiento y expresión de mARN codificador
de la proteı́na de fusión.
Se efectuaron análisis de transferencia Western de la proteı́na recombinante purificada por
afinidad. Transferencias de geles reducidos sondados con un anticuerpo monoclonal de t - PA
anti - humano yodado revelaron en marcado de
un péptido de 65 kD. Este es el tamaño esperado
de una proteı́na de fusión de t - PA de cadena pesada. La cadena beta de t - PA es de aproximadamente 33 kD y la cadena pesada truncada deberá
aportar 30 kD.Varias lı́neas de evidencia indican
que el péptido de 65 kD no es una molécula de
tipo t - PA aportada por suero vacuno fetal. La
banda de 65 kD es observada cuando las lı́neas
de células transfectadas son crecidas en un medio libre de suero o en el espacio intraperitoneal
del ratón. Igualmente, cuando se purificó t - PA
bovino a partir de suero vacuno fetal mediante
cromatografı́a de afinidad con benzamidina, incluso aunque fue marcado por el anticuerpo en
transferencias Western, el tamaño de la molécula
fue de 75 kD.
Transferencias Western de muestras reducidas
y sondadas con un Fab anti - ratón de cabra derivado de sueros policlonales, revelaron el marcado
de una proteı́na de 25 kD, el cual es el tamaño
esperado de la cadena ligera K de 59D8. Aunque
en dichas transferencias este reactivo marca normalmente también las cadenas pesadas de inmunoglobulina de ratón, la ausencia de marcado del
péptido de fusión no es sorprendente puesto que se
ha separado la mayor parte de la región constante
de cadena pesada. Transferencias producidas con
muestras son reducir revelaron el marcado de una
sola banda a un peso molecular de 170 - 180 kD
mediante ambos anticuerpos yodados. Esto proporciona una fuerte evidencia de que las células
hibridomas producen una molécula que contiene
ambos péptidos de inmunoglobulina y de t - PA.
El valor de 170 - 180 kD sugiere que se han formado los enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas para obtener una molécula de tipo Fab que
contiene dos puntos de combinación de antı́genos
y dos mitades de t - PA.
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La actividad peptidolı́tica de la porción de t PA de la molécula se evaluó inicialmente midiendo
la disociación del substrato no especı́fico S - 2288.
La disociación de este tripéptido puede ser controlada con precisión siguiendo la producción de
paranitroanilina, la cual absorbe luz a una longitud de onda de 405 nm. La figura 2A muestra
un ensayo tı́pico, el cual utiliza directamente la
actividad de diferentes concentraciones de t - PA
de melanoma puro. La actividad en este ensayo
se define como la velocidad de cambia en la densidad óptica. Cuando se efectúa una comparación,
sobre una base molar, entre la proteı́na recombinante y t - PA natural, la proteı́na recombinante
posee 70% de la actividad de t - PA natural.
Para determinar si la subunidad beta catalı́tica mantenı́a actividad contra plasminógeno
(su substrato fisiológico), se llevó a cabo un ensayo S - 2251. En este caso, se requiere el
activador de plasminógeno para convertir plasminógeno a plasmina y la plasmina libera posteriormente para nitroanilina a partir de un
tripéptido sintético. Ni el activador de plasminógeno ni la tripsina pueden convertir directamente el substrato S2251. En primer lugar se
determinaron, en el ensayo S2288, las actividades
amidolı́ticas de la proteı́na recombinante, de t PA de melanoma y de tripsina y a continuación
se determinó la capacidad de cantidades comparables de cada uno de ellos para convertir plasminógeno. La figura 2B revela que la capacidad
de la proteı́na recombinante para actuar sobre el
substrato fisiológico es muy similar a la de t - PA
natural. Aunque una proteasa de serina no especı́fica, tal como tripsina, es capaz de convertir
plasminógeno a plasmina, lo hace de un modo mucho menos eficaz que el activador de plasminógeno
natural o recombinante.
Tanto el esquema de purificación como los
ensayos utilizados después de la purificación requerı́an un punto de combinación de antı́geno intacto y funcional. Con el fin de comparar más
cuantitativamente la molécula recombinante con
el anticuerpo 59D8, se utilizó un ensayo de competición simple. Este ensayo midió la capacidad
del monómero de fibrina soluble para competir
por los puntos de ligación de anticuerpo contra fibrina ligada al fondo de una placa de 96 pocillos.
Aunque el ensayo indica que el anticuerpo natural liga monómero de fibrina mejor que lo hace la
proteı́na recombinante, la diferencia en sus afinidades de ligación es inferior a 10 veces (Figura 3).
Es evidente que la ligación del anticuerpo no se
deteriora de manera importante en la proteı́na de
fusión.
Discusión
El análisis extensivo de la proteı́na segregada
indica que una proteı́na de fusión de t - PA de
cadena pesada de 59D8 está siendo expresada y
segregada en asociación con la cadena ligera y ello
del modo previsto. Sin embargo, la cantidad de
proteı́na recombinante presente en los sobrenadantes de los cultivos de células aparece solo como
del 10% de la cantidad esperada para los anticuerpos monoclonales. mediante purificación por afinidad, se han obtenido de forma rutinaria solo 0,1
µg de proteı́na purificada por ml de sobrenadante
de cultivo celular o 10 µg por ml en fluido ascı́tico.
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Se controló la purificación con inmunoanálisis en
fase sólida como se ha descrito anteriormente y las
recuperaciones obtenidas a partir de las columnas
de afinidad estaban dentro de la gama esperada.
Existen varias razones posibles de la producción
limitada de proteı́na recombinante. Una de ellas
es que la proteı́na recombinante se degrada durante el crecimiento de las células o purificación
de la proteı́na. En un intento de limitar la degradación proteolı́tica, se añadieron inhibidores de
proteasa a los cultivos celulares. Aunque no se
observó ninguna mejora en el rendimiento, la degradación proteolı́tica siguió siendo un problema.
Otros problemas más fundamentales pudieron ser la causa de los bajos rendimientos de
proteı́na. Aunque puede apreciarse ARN mensajero del tamaño adecuado en la transferencia Northern, la transcripción de la construcción puede
ocurrir a un bajo nivel. La transcripción es impulsada por el promotor y estimulador de cadena
pesada natural, pero de esta construcción han
sido excluidas las secuencias 3’, las cuales han
demostrado ser importantes en la regulación de
la expresión de inmunoglobulina. Gregor et al.,
Mol. Cell. Biol., 6:1903 - 1916 (1986); Kobrin
et al., Mol. Cell. Biol., 6:1687 - 1697 (1986).
En adición, la región 3’ no traducida del gen
quimérico es de t - PA, una proteı́na que se produce a un bajo nivel bajo condiciones normales, y
se guarda posteriormente en las células en donde
se produce. Es posible que la región 3’ no traducida del gen de t - PA conduzca a bajos niveles
de transcripción o traducción, o bien que interfiera con la secreción de la proteı́na recombinante
a partir de la célula. Experimentos dirigidos a la
cuantificación de la sı́ntesis de m ARN, sı́ntesis de
proteı́na y estabilidad del péptido recombinante
deberán permitir la resolución de este problema.
Las variantes de pérdida de cadena pesada
proporcionan un medio conveniente para la reconstitución del punto de combinación del anticuerpo. Su disponibilidad hace innecesario clonar y transfectar la transposición de cadena ligera productiva. Este enfoque, como es lógico,
depende de la posibilidad de poder transfectar estas lı́neas celulares variantes. Las dos lı́neas usadas en estos experimentos fueron transfectadas
fácilmente usando técnicas convencionales, pero
no está todavı́a claro si las otras lı́neas derivadas de SP210 se comportarı́an de manera similar.
La cantidad de cadena ligera que segregan las variantes de pérdida de cadena pesada varı́a. Sin
embargo, algunas variantes de pérdida que segregan pequeñas cantidades de cadena ligera pueden
ser capaces de segregar cantidades normales de
esta misma cadena ligera cuando se reanuda la
sı́ntesis de la cadena pesada. Wilde et al., Eur.
J. Immunol., 10:462 - 467 (1980). Se sabe poco
acerca de la base biológica de la pérdida de producción de cadena de inmunoglobulina en estas
células y es posible que pueda deteriorarse la capacidad de algunas variantes de pérdida para producir cadena ligera ası́ como cadena pesada. El
bajo nivel de producción de la presente proteı́na
recombinante podrı́a ser el resultado de una expresión deprimida de la cadena ligera.
La cadena beta de t - PA recombinante tiene
un alto nivel de actividad catalı́tica y retiene la
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capacidad especı́fica de convertir plasminógeno a
plasmina. Los primeros estudios, que enlazaron
nucleasa estafilococal y funciones de ADN polimerasa de E. coli a la cadena pesada de inmunoglobulina, proporcionaron una actividad de función
efectora considerablemente menor del 70%, medida en el ensayo S - 2288. Neuberger et al, Nature, 312:604 - 608 (1984); Williams et al., Gene,
43:319 - 324 (1986). Esta retención de actividad
enzimática y especificidad por el substrato indica
que para formar proteı́nas recombinantes hı́bridas pueden utilizarse incluso moléculas complejas
que requieren un doblado y formación estrictos
de múltiples enlaces disulfuro entre las cadenas.
Otros han demostrado que la cadena beta de t
- PA es capaz de doblar correctamente y mantener la actividad en ausencia de la cadena alfa.
macDonald et al., Gene, 42:59 - 67 (1986); von
Zonneveld et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA,
83:4670 - 4674 (1986). Los resultados aquı́ obtenidos confirman la actividad de la cadena cata-
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lı́tica únicamente e indican que la cadena puede
doblarse correctamente en el contexto de una secuencia aminoterminal diferente. En conjunto,
estas observaciones proporcionan evidencia del
doblado independiente de diferentes dominios de
proteı́na.
En resumen, según esta invención se ha clonado el gen de cadena pesada codificador del
punto de combinación de antı́geno de un anticuerpo antifibrina y se ha producido una construcción que codifica un péptido de fusión de subunidad beta de t - PA de cadena pesada truncada. La construcción fue transfectada posteriormente en variantes de pérdida de cadena pesada
del hibridoma antifibrina. El análisis de transferencia Western indica que la proteı́na de fusión
tiene actividad de anticuerpo antifibrina y retiene
un nivel de activación de plasminógeno suficientemente alto para considerarlo similar a la de t PA natural.
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REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la producción de una
molécula hı́brida recombinante de inmunoglobulina que comprende un anticuerpo, o una porción
del mismo, especı́fico por fibrina y un activador
de plasminógeno, o una porción del mismo, capaz de convertir plasminógeno a plasmina, caracterizado porqué comprende acoplar sucesivos aminoácidos mediante la formación de enlaces
péptidos.
2. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el activador de plasminógeno
es activador de plasminógeno de tipo tisular, estreptoquinasa, uroquinasa o prouroquinasa.
3. Un proceso según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque se prepara el anticuerpo
64c5 (ATCC HB 8545) o 59D8 (ATCC HB 8546).
4. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
porción del activador de plasminógeno es la región
catalı́tica.
5. Un proceso según la reivindicación 4, caracterizado porque la región catalı́tica es la cadena B de tPA o uroquinasa.
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6. Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende
además la etapa de marcar de forma detectable la
molécula.
7. Un proceso según la reivindicación 6, caracterizado porque comprende radiomarcar la
molécula.
8. Un proceso para la preparación de una
composición farmacéutica administrable para su
aplicación en diagnosis in vivo, caracterizado
porque comprende mezclar una molécula hı́brida recombinante de inmunoglobulina, preparada
según el proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con un vehı́culo farmacéutica o veterinariamente aceptable para la misma.
9. El uso de una molécula hı́brida recombinante de inmunoglobulina preparada por un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5, en la preparación de un agente trombolı́tico.
10. El uso de una molécula hı́brida recombinante de inmunoglobulina, marcada de forma
detectable, preparada por un proceso según la reivindicación 6 o 7, en la preparación de un agente
detector de trombos.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
65
Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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