CASEÍNA Y DEL LACTOSUERO

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
ESCUELA DE POST-GRADO
ESPECIALIDAD DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Practica
:
COMPORTAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE
LA LECHE (CASEÍNA Y DEL LACTOSUERO) FRENTE AL
TRATAMIENTO TÉRMICO Y pH
Curso
:
Bioquímica de los Alimentos
Alumna
:
Deyli Díaz Lezama
Lima , 2010
COMPORTAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE
LA LECHE (CASEÍNA Y DEL LACTOSUERO) FRENTE AL
TRATAMIENTO TÉRMICO Y pH
I. INTRODUCCIÓN
La leche es el líquido segregado por las glándulas mamarias de las hembras de
los mamíferos. Es el alimento exclusivo del animal recién nacido y contiene
todos los nutrientes necesarios para su desarrollo.
(1)
Desde un punto de vista físico químico, la leche es una mezcla homogénea de
un gran número de sustancias (lactosa, glicéridos, proteínas, sales, vitaminas,
enzimas, etc) que están unas en emulsión (la grasa y sustancias asociadas),
algunas en suspensión (las caseínas ligadas a sales minerales) y otras en
disolución verdadera (lactosa, vitaminas hidrosolubles, proteínas del suero,
sales, etc) (2)
La leche contiene 30-36 g/l de proteína y alcanza cantidades nutritivas de muy
alto valor biológico. Las proteínas de la leche se clasifican bien como caseínas
o bien como proteínas del suero. Todas las proteínas se encuentran con fosfato
cálcico en forma de complejos esféricos, altamente hidratados y singulares,
conocidos como la micela de caseína. Tales complejos son polidiversos
variando su tamaño desde 30 a 300 nm de diámetro, con un pequeño
porcentaje que se aproxima a los 600 nm. Las caseínas suponen el 80% de
las proteínas de la leche; consecuentemente, la cuajada formada por
aglomeración de micelas de caseína durante la fabricación de queso retiene la
mayoría de la proteína total de la leche. Las restantes proteínas son retenidas
en el suero del queso, de ahí su nombre de proteínas séricas (3).
II. OBJETIVOS
Los objetivos que se plantearon en la presente práctica son:
Evaluar en la leche entera el efecto del pH sobre las proteínas de la
leche, empleando el análisis turbidimétrico.
Evaluar en el lactosuero el efecto del tratamiento térmico (diferentes
temperaturas por diferentes tiempos) sobre las proteínas del lactosuero,
haciendo uso del análisis espectrofotométrico en el rango UV.
III. REVISION DE LITERATURA
2.1 Las proteínas de la leche
Las proteínas de la leche son de dos tipos, proteínas del lactosuero y caseínas.
Las caseínas constituyen más del 80% de las proteínas totales de la leche,
aunque la proporción relativa de proteínas del lactosuero frente a caseínas
varía según el estado de lactación. La leche producida en los primeros días
después del parto y hacia el final de la lactación tiene un contenido de
proteínas del suero mucho mayor que la leche de mitad de lactación. Este
incremento está
acompañado de niveles elevados de proteínas del suero
sanguíneo.
2.1.1 Las caseínas
Las caseínas de la leche se pueden subdividir básicamente en cinco tipos,
caseínas
s1,
s2,
,
y k. Todas ellas, excepto la caseína
glándula mamaria; la caseína
caseína
, se sintetizan en la
se origina en la proteólisis postraslacional de la
, por la acción de las proteinazas nativas de la leche, principalmente
plasmina, o de la actividad proteolítica de las bacteria. Las proporciones
relativas de caseína
, , y k están sujetas a variaciones genéticas dentro de
los rebaños y pueden existir diferencias significativas en la composición de la
caseína de diferentes vacas. Sin embargo, la composición global de la caseína
de la leche de una explotación, varía muy poco en cualquier fase de la
lactación.
Las caseínas son proteínas globulares y tienen un contenido de aminoácidos
similar a los otros tipos, aunque la cisteína sólo está presente en pequeñas
cantidades en las caseínas
s2
y k. Una característica inusual de las caseínas
es la modificación post-ribosomal que consiste en la fosforilación de los grupos
hidróxilo de la serina. Los residuos de fosfoserina son, en parte, responsables
de las propiedades únicas de las caseínas.
La caseína
s2
s2
contiene de siete a nueve residuos de fosfoserina por mol, la
10 a 13 y la
cinco. Los residuos de fosfoserina se concentran en grupos y
son responsables de la existencia de áreas hidrofílicas de fuerte carga
negativa. Las moléculas también contienen bloques de residuos hidrofóbicos.
La caseína
contiene la mayoría de los componentes hidrofóbicos y forma
agregados con el grupo hidrofílico N-terminal expuesto al solvente y la parte
hidrofóbica hacia el interior.
Tabla 1. Las caseínas de la leche
Peso molecular1
Residuos fosfoserina
Alfas1
23.000
7-9
Alfas2
25.000
10-13
Beta
24.000
5
11.600-20.500
0ó1
1.980
12
Fracción
Gamma
Kappa
1.
Peso molecular del monómero
2.
Sólo la caseína que contiene carbohidratos
Las caseínas
s
son sensibles del calcio debido a la presencia de grupos
fosfato y precipitan en presencia de iones Ca2+ a pH 7.0. Las cadenas
polipeptídicas contienen 8.5% de prolina, lo que limita la formación de la
hélice .
La caseína k define de las caseínas
y
porque contiene sólo un grupo
fosfoserina y una fracción glucídica cargada. La molécula de caseína k parece
que se trata de una estructura relativamente estable con un puente disulfuro,
en la que hay tanto regiones con conformación
-hélice como -plegada. Se
cree que el enlace Phe105 –Met106 sensible a la quimosina, sobresale de la
superficie molecular. Un tercio de la molécula de caseína k corresponde a la
zona C-terminal fuertemente iónica, que contiene tres residuos glucídicos. El
resto de la molécula es altamente h idrofóbico y correspondiente a la para-kseína formada después de la hidrólisis del enlace Phe-Met.
El carácter anfifílico de las caseínas y su fosforilación facilita las interacciones
entre ellas y con el fosfato cálcico para formar complejos esféricos altamente
hidratados conocidos como micelas. Su tamaño es variable, oscilando su
diámetro entre 30 y 300 nm (diámetro medio 120 nm, peso molecular 10 8). El
92% del contenido proteico de las mi celas está constituido por caseínas
s2,
s1,
y k con una relación media de 3:1:3:1. El 8% restante son compuestos
inorgánicos, principalmente fosfato cálcico coloidal. Se cree que se distribuye
en la micela en forma de fosfato cálcico amorfo y la presencia de iones calcio
es absolutamente esencial para la formación de la micela. La transformación en
formas más estables, como el hidroxiapatito, se evita con la presencia de otros
iones, especialmente magnesio. El fosfato también parece que es esencial en
la estabilidad de las micelas al calor.
Se han propuesto varios modelos para la micela de caseína que muchas veces
son contradictorios. El más satisfactorio supone a la micela de caseína
constituida por un agregado de sub-micelas casi esféricas que a su vez están
formadas por agregados de moléculas de caseína. El fosfato cálcico y las
caseínas
s1
y
se unen al participar los grupos fosfoserina en la estructura del
fosfato cálcico. La caseína k se localiza en la superficie de la micela, o muy
cerca de ella. La zona hidrofóbica de la molécula de caseína k se une al centro
de la micela, mientras el macropéptido hidrofílico forma una capa de filamentos
“pilosos” altamente hidratados, que se proyectan en la fase acuosa. Los
filamentos de caseína k son responsables de la estabilización estérica de las
micelas de caseína.
Parece que los componentes de la micela de caseína están en equilibrio con la
fase acuosa, mientras la leche recién ordeñada contiene sólo pequeñas
cantidades de caseína soluble, algunas caseínas se disocian junto con el
fosfato cálcico coloidal de la micela durante el almacenamiento a 0°C. La
caseína principalmente afectada es la , que se puede encontrar hasta un 40%
en solución. Se disocia una cantidad relativamente pequeña de caseínas
s1
o
k y por esta razón se ha considerado que son estos dos componentes los que
tienen principalmente función estructural. La disociación es reversible, pero no
se sabe si la estructura nativa se forma de nuevo.
2.1.2 Proteínas del lactosuero
Las proteínas del lactosuero comprenden dos tipos de proteínas nativas:
lactoglobulina y
-
-lactalbúmina; la fracción proteosa-peptona (derivada de la
hidrólisis de la caseína
) y pequeñas cantidades de proteínas de origen
sanguíneo: seroalbúmina e inmunoglobulinas (tabla 2).
Las proteínas del lactosuero tienen una estructura típica de proteínas
globulares compactas, con una secuencia en la que los grupos no polares,
polares y cargados tienen una distribución relativamente uniforme. Las
proteínas sufren un plegamiento intramolecular como resultado de la formación
de puentes bisulfuro entre los grupos sulfhidrilo de las cisiteínas, quedando la
mayor parte de los grupos hidrofóbicos encerrados en el interior de la molécula.
Por esta razón las proteínas del lactosuero no se agregan fuertemente, ni
interactúan con otras proteínas, en estado nativo.
Tabla 2. Las proteínas del lactosuero de la leche
Fracción
Peso molecular1
Beta-lactoglobulina
18.300
Alfa-lactalbúmina
14.000
Seroalbúmina
63.000
Inmunoglobulinas
hasta 1.000.000
La proteína mayoritaria del lactosuero,
autoasociación a los valores de pH
-lactoglobulina, sufre una limitada
normales de la leche, para formar un
dímero con una forma geométrica que recuerda a dos esferas superpuestas.
Los dímeros se disocian en solución a 60°C, volviéndose susceptibles a la
desnaturalización por desdoblamiento de la estructura terciaria. La
-
lactalbumina tiene una estructura primaria similar a la de la lisozima y es muy
compacta, con forma prácticamente esférica. Esta molécula es termoestable
que la -lactoglobulina.
2.1.3
Efecto del calor sobre las proteínas de la leche
Las micelas de caseína son notablemente estables a temperaturas de hasta
140°C. Por el contrario, las proteínas del lactosuero son relativamente
termolábiles,
sufriendo
una
intensa
desnaturalización
a
80°C.
La
desnaturalización se acompaña de la rotura y nueva formación de numerosos
puentes disulfuro estabilizantes. -lactoglobulina, es más sensible al calor que
la -lactalbúmina debido a su grupo sulfhidrilo libre, que origina la iniciación de
reacciones de intercambio disulfuro autocatalizadas.
La desnaturalización de la
-lactoglobulina tiene importantes consecuencias
adicionales, ya que 100 °C y temperaturas más elevadas se produce una
interacción entre la
-lactoglobulina, y la caseína k. En esta
interacción
probablemente se produce un intercambio tio-disulfuro, y mientras la caseína k
permanece en la superficie, las propiedades de la superficie micelar se alteran.
Estos cambios afectan a la interacción de las micelas con el fosfato cálcico, y
por lo tanto a su estabilidad. El precalentamiento de la leche no concentrada a
90°C por ejemplo, reduce su estabilidad durante el procesado posterior a
temperaturas más elevadas. Por el contrario, la estabilidad de la leche
concentrada aumenta por calentamiento a 90°C. Esto probablemente se debe a
la reducción de la concentración de iones calcio inducida por el calor, que es
considerable en la leche concentrada, superando el efecto desestabilizante de
la reacción de la micela con la
-lactoglobulina.
El calentamiento continuado conlleva cambios más intensos incluyendo
proteólisis inducida por el calor, formación de lisinoalanina y pardeamiento de
Maillard. El calentamiento durante períodos de tiempo superiores a 20 minutos
a 140° conduce a la desestabilización de las micelas de caseína y la formación
de un gel.
2.1.4 Las proteínas lácteas y el comportamiento de la leche durante el
procesado
Las propiedades de las proteínas lácteas se relacionan con el comportamiento
de la leche durante el procesado, tanto debido a las características especificas
de la micela de caseína como a la secuencia de aminoácidos que en definitiva
determinan las propiedades funcionales.
Las reacciones más importantes de las proteínas lácteas son aquellas que
conllevan la desestabilización de las micelas proteicas. Algunas de estas
reacciones son tecnológicamente deseables, como la formación de un gel, bien
cuando se reduce el pH de la leche (por ejemplo, en la elaboración de leches
fermentadas o quesos de coagulación ácida) o cuando la caseína
sufre una
proteólisis selectiva (por ej., en la elaboración de queso Cheddar). La
acidificación en condiciones adecuadas también puede utilizarse para
fraccionar las proteínas de la leche (por ej., obtención de caseína ácida). Sin
embargo, en otros casos, las reacciones que determinan la desestabilización
de las micelas no son tecnológicamente deseables. Entre estas últimas se
incluyen diversas reacciones que causan la agregación de la caseína como
ocurre en la gelación por envejecimiento de las leches concentradas.
Las propiedades funcionales de la caseína y el lactosuero reflejan la secuencia
de aminoácidos, y por tanto la conformación de las proteínas. En el caso de la
caseína, la naturaleza anfifílica de la molécula, con aminoácidos hidrofílicos e
hidrofóbicos, le confiere unas excelentes propiedades activas de superficie que
se traducen en las propiedades funcionales de emulsificación y formación de
espumas. Estas propiedades dependen en cierta medida del pH.
Las proteínas del lactosuero no son anfifílicas y generalmente tienen menor
actividad de superficie que la caseína. Las propiedades estabilizantes de
espumas son, sin embargo, superiores ya que forman una capa más rígida en
la interfase aire/agua.
2.1.5 Propiedades nutritivas de las proteínas lácteas
Las proteínas lácteas tienen un gran valor nutritivo y en las tablas de
clasificación provisional de los alimentos en función de su calidad nutritiva,
elaboradas por la Comisión de Agricultura y Alimentación de las Naciones
Unidas, tanto las caseínas como las proteínas del lactosuero tienen
puntuaciones altas. los dos tipos de proteínas lácteas son completamente con
respecto al contenido de aminoácidos esenciales y esto compensa la ligera
deficiencia de aminoácidos sulfurados, metionina y cisteína de la caseína. La
proteína láctea es también muy digestible, aunque la digestibilidad puede
disminuir tras el procesado. El proceso también conduce a la pérdida de
nutrientes.
IV.
METODOLOGIA EXPERIMENTAL
4.1
Estudio del efecto del pH sobre las proteínas de la leche
Materiales, equipos y reactivos
-
5 beakers de 50 mL
-
1 probeta de 50 mL
-
02 pipetas de 1 ó 2 mL
-
Papel Whatman # 4
-
Solución de NaOH y HCl 0.1 N
-
Potenciómetro
-
Conductímetro
-
Espectrofotómetro rango visible y UV
-
Centrífuga
-
Sistema de filtración
-
Baño María
Procedimiento
-
Se llevó con una pipeta 20 mL de la leche a un beaker de 50 mL. Se
hizo esto 5 veces.
-
En cada beaker se reguló el pH a valores de 3, 4.6, 5.5, 6 y 7
(midiéndose la conductividad).
-
Se centrifugaron las diversas soluciones a 5000 rpm por 10 minutos.
-
Se separó el sobrenadante cuidadosamente, sin dejar caer parte del
precipitado y si cayó parte del precipitado, se filtró con papel
Whatman # 4.
-
En cada fracción sobrenadante, se leyó la turbidez a 500 nm en el
espectrofotómetro y la conductividad.
De los resultados obtenidos se hicieron las siguientes gráficas.
a.
pH vs turbidez en el sobrenadante (D.O. a 500 nm)
b.
Conductividad (ms) vs pH
Esquema experimental 1: Estudio del efecto del Ph sobre las proteínas de
la leche
20 mL de Leche
Con NaOH o Hcl
pH 3
pH 4.6
pH 5.5
pH 6
pH 7
Centrifugar a 5000 rpm x 10 minutos
Separar sobrenadante
Si cae precipitado
Turbidez
Conductividad
Reporte de resultados
4.2
Estudio del efecto del tratamiento térmico sobre las proteínas del
Lactosuero
Materiales, equipos y reactivos
-
9 beakers de 50 mL
-
1 probeta de 50 mL
-
Papel Whatman # 4
-
Centrífuga
-
Sistema de filtración
-
Baño maría
-
Embudos
Procedimiento
Se llevó con una pipeta 40 mL de suero a un beaker por 9 veces.
-
Tres de los beakers fueron sometidos a la temperatura de 50°C por
10, 20 y 30 min, los otros tres beakers fueron sometidos a la
temperatura de 70°C por los mismos tiempos y en una tercera serie
se colocaron los beakers a 100°C por los mismos tiempos.
-
Pasados los tiempos respectivos se procedió a centrifugar a 5000
rpm por 10 min, luego se separó el sobrenadante cuidadosamente,
sin dejar caer parte del precipitadoy si caía parte del precipitado, se
filtró con papel Whatman # 4.
Para cada fracción de sobrenadante obtenido se leyó la densidad óptica en el
rango UV a 280 y 260 nm y se halló el contenido de proteína del lactosuero
inicial y a la que quedó en el sobrenadante luego de cada tratamiento, para
ello se recurrió a la siguiente fórmula:
Concentración de proteína (mg/mL) = 1.45 DO280 – 0.74 DO 260 (Kalckar, 1947).
Esquema experimental 2: Efecto del tratamiento térmico sobre las
proteínas del lactosuero.
50 mL de Suero
50 °C por 10, 20 y 30 min.
70 °C por 10, 20 y 30 min.
90 °C por 10, 20 y 30 min.
Centrifugar a 5000 rpm x 10 minutos
Separar sobrenadante
Leer D.O. en rango UV 280 y 260 nm
Concentración de proteína (mg/mL)
= 1.45 DO280 – 0.74 DO 260 (Kalckar,
1947).
Si cae precipitado
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Tabla 1: Turbidez y pH en el sobrenadante de las proteínas de leche.
pH
Dilución
Absorbancia
Turbidez ( 500 nm)
3
10
0,068
0,68
4,6
10
0,075
0,75
5,5
20
0,146
2,92
6
20
0,701
14,02
7
20
0,835
16,7
Figura 1: Turbidez y pH en el sobrenadante de las proteínas de leche.
Tabla 2:
pH y conductividad en el sobrenadante
de las proteínas de
leche.
pH
CONDUCTIVIDAD
3
10,41
4,6
7,92
5,5
6,82
6
6,18
7
5,54
Figura 2: pH y conductividad en el sobrenadante
leche.
de las proteínas de
Tabla 3: Efecto del tratamiento térmico sobre las proteínas del lactosuero
% de proteína desnaturalizada
Tiempo
(min.)
0
Mesa A
50°C
Mesa B
70°C
50°C
promedio
70°C
50°C
0,00
0,00
0,00
0,00
10
28,20
37,67
36,47
35,55
32,34 36,61
20
31,93
38,69
34,83
39,74
33,38 39,21
30
18,93
43,70
39,07
44,02
29,00 43,86
Figura 3: Efecto del tratamiento térmico sobre las proteínas
del lactosuero.
0,00
70°C
0,00
-Ph y turbidez en el sobrenadante (500 nm):
De la figura 1, podemos encontrar que existe una relación directa entre el
incremento del pH y la turbidez medida con absorbancia (500nm).
Según Charles, 1970 la turbidez de la leche resulta principalmente de la
dispersión de la luz por las micelas de fosfocaseinato de calcio. Los glóbulos
grasos dispersan igualmente la luz, pero intervienen poco en la opalescencia
blanca, ya que su dimensión es muy superior a la longitud de onda media de la
luz solar.
En la práctica la muestra evaluada correspondía en si al sobrenadante de la
leche cuando es sometida a centrifugación, por lo cual podría deducirse que la
dispersión de la luz disminuía cuando aumentaba el pH, debido a que a esos
pHs las micelas podrían estar además formando complejos con las proteínas
séricas.
Es importante también señalar por lo expuesto que a mayor turbidez se
obtendrán mayores lecturas de densidad óptica.
También Belitz y Grosch, 1997 sugieren que la medida de la densidad óptica
en leche es muy útil para evaluar el aguado de (aunque menciona también que
este tipo de adulteración se puede enmascarar con la adición de sales); y la
construcción de la gráfica de solubilidad de las proteínas presentes en ella.
Ph y conductividad:
De la gráfica 2; podemos observar que el pH y la conductividad mantienen un
alto nivel de correlación negativa, pues a medida que aumenta el pH la
conductividad decrece.
La variación de la conductividad de las leches está directamente relacionada
con la carga que presenten estas proteínas a los diferentes pHs evaluados y de
manera indirecta a la concentración de estos los sueros evaluados. Ante esto,
Cheftel y col, 1989 indican que a pHs próximos al punto isoeléctrico (pI), las
moléculas proteicas, manifiestan un mínimo de interacciones con el agua,
favoreciendo de esta manera a la formación de agregados insolubles
(precipitan). Es decir, en las leches y sueros sometidos a los pHs evaluados se
produjo la precipitación proteica de la leche, lo que redujo directamente e
indirectamente la carga neta de las proteínas contenidas en las muestras y la
resistencia al paso de la corriente eléctrica, respectivamente.
Fennema, 2000; manifiesta que la fracción k-caseína se insolubiliza en un
rango de 4.1-4.5, mientras que la α-caseína, β- caseína y lasproteínas del
suero (α-lactoalbúmina y β-lactoglobulinas) lo hacen entre 5.1 y 5.3. Esto
explica el porque la conductividad disminuye a medida que se incrementa el
pH, pues poco a poco se van a insolubilizar las dieferentes fracciones proteicas
presentes en la leche, disminuyendo así la carga neta total.
La conductibilidad de la leche varía con la temperatura, normalmente s el mide
a 25 °C. El agudo de la leche rebaja la conductibilidad y ante una acidificación,
la conductibilidad se eleva. La medición de la conductibilidad se utiliza
generalmente para investigar este aguado de la lache o para descubrir las
leches mastíticas.
En la figura 3 que se muestra la turbidez o D.O de las proteínas del suero de
leche al ser sometidas a diferentes tiempos de tratamiento térmico. La proteína
del suero de leche se desnaturaliza más a 70 ºC que a 50 ºC.
Cheftel, 1989 establece que las proteínas de lactosuero son relativamente
termolábiles, sufriendo una intensa desnaturalización a 80 °C, y que esta
desnaturalización se acompaña de la rotura y nueva formación de numerosos
puentes disulfuro dando lugar a la formación de dímeros y tetrámeros de alto
peso molecular que se precipitan (esto se conoce en la industria láctea como
“la piedra de la leche”). La proteína responsable de este efecto es la βlactoglobulina, pues es más sensible que la α-lactoalbúmina debido a su grupo
sulfhidrilo libre, que origina la iniciación de reacciones de intercambio disulfuro
autocatalizadas.
Sin embargo en la práctica no se pudieron hallar valores del tratamiento
térmico a 90ºC en las proteínas del lactosuero debido a fallas en el equipo de
baño maría.
VI. CONCLUSIONES
-El pH altera la carga neta de las proteínas, haciendo que estas se comporten
como base o como ácidos dependiendo del pH del medio. Estas cargas le
permiten a la proteína interaccionar con el agua y de esta manera mantenerse
solubles en el medio.
-Cuando el pH del medio se aproxima al punto isoeléctrico, la carga neta de la
proteína es cero, y esta se precipita, lo cual es fácilmente detectable a través
del análisis turbidimétrico.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Belitz y Grosh. 1997. Química de los Alimentos. Editorial
Acribia. Zaragoza.
2. Ordoñez, J. 1998.Tecnología de los alimentos. Volumen II.
Editorial Síntesis, S. A. España.
3. Fennema, O. R. 1985. Introducción a la Ciencia de los
Alimentos. Editorial Reverté. Barcelona.
4. Charles, A. 1970. Ciencia de la leche. Principios de técnica lechera.
Editorial Continental. México.
5. Cheftel, J. 1989. Proteínas Alimentarias. Editorial Acribia, S. A.
Zaragoza. España.