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Biotecnología de Plantas Desafíos para la expresión de genes introducidos 1. Importancia del promotor y elementos enhancers 2. Hay dos factores principales que determina si los genes se expresan en el momento y cantidad adecuadas a) Un gen debe ser introducido en todas las células y ser estabble para la transferencia a su descendencia: i. El promotor debe ser reconocido y bien regulado o siempre activo. Un promotor fuerte que se usa de manera rutinario es el promotor del virus del mosaico de la colifor (CaMV 35S) y el promotor de la Rubisco, regulada por luz ii. Se debe suministrar terminación y señal de poliadenilación iii. Se pueden necesitar secuencias que dirija la proteína a un orgánulo determinado b) Uso de codones: i. Los genes necesitan especificar aminoácidos que coincida con los tRNA y grupos de aminoácidos de la planta ii. Los genes se pueden modificar para que contenga los codones adecuados (ingeniería de codones) Dinero que mueve la Ingeniería Genética • Inversión global estimada alrededor de 20.000 millones de euros • 2/3 consiste en inversión privada • Un estudio industrial estimó el mercado potencial para productos biotecnológicos en 278.000 millones de euros en 2005 Hindmarsh et al. 1998 DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE • Aislar genes • Manipular el diseño • Integrar el DNA recombinante en las células de la planta • regenerar un planta completa PARA LA MEJORA POR INGENIERÍA GENÉTICA SE NECESITA..... 1. Conocer los procesos que controlan la característica a mejorar 2. Identificar especies o variedades que contienen los genes de interés (cualquier especie) 3. Aislar el gen 4. Organizar el gen para que se exprese en el lugar y modo adecuado 5. Que la proteína (si la hay) sea funcional 6. Transformar plantas y seleccionar transformantes que expresen la proteína a niveles suficientes 7. Rezar...... DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE DNA RECOMBINANTE • CONFERIR CARACTERÍSTICAS DESEADAS DE MANERA PRECISA • CRUZAR BARRERAS DE ESPECIES • CREAR NUEVAS COMBINACIONES DNA • INTRODUCIR SÓLO EL GEN DE INTERÉS Expresar un gen.. PROMOTOR GEN TRANSFORMAR PLANTAS Promotores: regulación PROMOTOR RNA polimerasa PROMOTOR GEN transcripción GEN Promotores •Promotores fuertes GEN •Promotores débiles GEN •Promotores específicos de tejidos GEN DesarrollosBiotecnológicos GMOs - Organismos Geneticamente modificados • GMO - Un organismo que expresa caracteres que resultan de la introducción de DNA extraño • También llamado organismo transgénico Términos importantes • Mejora Gen beneficioso añadido de misma especie Gen añadido por cruces dentro de especies Source: USDA • Transformación Gene beneficioso de otra especie Gen añadido por ingeniería genetica Source: USDA Aclaremos conceptos • Mejora clásica ≠ Biotecnología Mejora sólo intercambia genes dentro de especies Sólo en especies afines PERO no es lo mismo que biotecnología • Biotecnología añade características que no son disponibles en estas especies Soja no tiene un gen que degrada Roundup El gen viene de Bacteria Cruce interespecífico Wheat Rye X Triticale Nueva especie, pero NO un producto biotecnológico Biotecnología Vegetal •Tradicional Mejora clásica Recombinante Técnicas de DNA http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5 Los resultados de mejora clásica son buenos per muy lentos… corn cob teosinte John Doebley photo Tomate silvestre (Lycopersicon pimpinellifolium ) D= 1 cm www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg híbridos (heterosis) Mutagénesis: Nuevo caracter sin un nuevo Gen Mutagénesis cambian la secuencia de un gen Nuevas, características interesantes se pueden obtener Tratemiento de Mutagénesis Gen Normal susceptible ATTCGA Gen resistente mutante ATTGGA El mercado de cosechas biotecnológica está dominado por cinco Países 6% 4 mha 63% 43 mha 21% 14 mha 3% 3 mha 3% 3 mha Estos países suponen el 98% del mercado 15 % de incremento en cultivo biotec en 2003 a2003 growing season data. http://www.isaaa.org/Press_release/Briefs30-2003/press/b30_english.htm Productos de Biotecnología bacteriano y animal Source: Chr. Hansen Biotecnología chymosin enzyma usado en productos lácteos gen de levaduras obtenidos de bacterias GE reemplaza el enzima del hígado bST (aomatotropina bovina) Source: Rent Mother Nature incrementa la producción de la leche gen de la vaca protein harvested from GE bacteria replaces cow protein originally harvested from pituitary glands of slaughtered cows Cultivo de tejidos de plantas y aplicaciones Cultivo de tejido de plantas Se define como el cultivo de partes de plantas en condiciones estériles tales como órganos, embriones, semillas, y células en medio líquido o solidificado Células diferenciadas se pueden cultivar in vitro para generar plantas enteras, con el uso de una pequeña cantidad de material Tejido meristemático (células en crecimiento) se usa para crecer plantas con flores, y es libre de virus, aspecto importante en la propagación de plantas Los pasos básicos de cultivo de plantas son: a) Remover una pieza de tejido de una planta, denominado un explanto. b) Coloca un explanto en un medio nutritivo para forzar a las células del explando convertirse en indiferenciadas y formas un callo: Desdiferenciación. c) El tejido que forma el callo se transfiere a otro medio nutritivo que permite si diferenciación en un tejido: Rediferenciación. d) La planta se transfiere a sustrato. La capacidad de una célula vegetal a producir una planta completa se llama Totipotencia. Hay 6 tipos de cultivo in vitro que pueden crear una planta completa: a) Cutivo de callo – cultivo de un tejido desdiferenciado de un explanto que se desdiferencia b) Cultivo celular – cultivo de células o agregado de células (pequeño grupo de células) en cultivo líquido c) Cultivo de protoplasto – cultivo de células vegetales que tienen sus paredes celulares quitadas d) Cultivo de embriones – cultivo de embriones aislados e) Cultivo de semillas – cultivo de semillas para generar plantas completas f) Cultivo de órganos – Cultivo de órganos de plantas aislados como anteras, raíces, tallos, yemas etc. B. Micropropragación 1. Plantas de interés se clonan a través de un proceso de cultivo in vitro denominado “propagación clonal in vitro” o micropropagación 2. Forma parte de una industria muy importante puesto que tiene el potencial de crear muchas más plantas a partir de un material inicial (por ejemplo olivos) Hay 4 etapas en la micropropagación: Etapa 1 – Iniciación de un explanto estéril, esterilización de la superficie del tejido para prevenir contaminación, y tranferencia de explantos a un medio nutritivo. Etapa 2 – Iniciación del tallo, que es la multiplicación del tejido del tallo a partir de explantos en un segundo tipo de medio nutritivo. Etapa 3 – Iniciación de raíz, que es la multiplicación de un tejido de raíz de explantos en medio nutritivo. Etapa 4 – Transferencia de las plantas a un medio estéril u otro sustrato bajo condiciones controlas para crecer plantas completas. Nutrientes como vitaminas, sacarosa, y hormonas vegetales pueden controlar el cultivo del tejido. Por ejemplo alterando las cantidades de las hormonas auxinas y citoquinicas induce multiples tallos para formar un cultivo. Embriones somáticos (embriogénesis somática) a) Produce estructura embrion-like llamados embrioides de tejidos de plantas. b) Hormonas como auxinas afecta el desarrollo normal y forma embrioides de tejidos “normales”. c) Los callos también se pueden usar, cambiando las hormonas para inducir la formación de embriones, y cada embrioide puede formar una nueva planta. d) También se pueden producir en cultivo líquido, usando células individuales o tejido de plantas: i. Las paredes celulares se degradan con enzimas para formar protoplastos. ii. Se regenera la pared celular, comienza la división celular, y se forma agragaciones celulares. iii. Las agragaciones celulares se cultivan en un medio sólido para formar tallos y raíces. e) Este es el método preferido para produccióna gran escala, usando bioreactores para producir millones de embrioides. f) Embrioides también se pueden empaquetar como semillas artificiales, que se encapsulan para la distribución y se protegen con un complejo de agar y otros geles. Productos químicos de plantas a) Metabolitos primarios y secundarios son útiles para las plantas para funcionar como protección de mamíferos, insectos, y patógenos. Muchos de estos compuestos son usados en medicina y alimentación. b) Más del 25% de los productos farmacéuticos en Europa vienen de plantas y el 75% de la población mundial dependen de medicina obtenida de hierbas c) En muchos casos el desarrollo de una droga comienza con la identificación de una hierba medicinal ampliamente usada normalmente por indígenas. Es compuesto químico (principio activo) es aislado, sintetizado químicamente y testado en ensayos clínicos. Cultivo celular: i. Produce compuestos químicos sin la necesidad de usar plantas tropicales y subtropicales para crecer plantas completas, que pueden dañar el medio ambiente ii. Puede producir mayoras cantidades de metabolitos que plantas completas en condiciones controladas como un bioreactor iii. Shikonina, un producto químico que se usa en muchas cremas, cosmétidos y tintes se ha producido en grandes bioreactores que producen entre 1.5 y 4.0 gramos de shikonina por litro de cultivo iv. Muchos procesos de producción requieren mucho tiempo (hasta 10 años) y costa mucho desarrollar, por lo tanto las ventas deben amortizar los costes v. Los genes se pueden introducir en plantas de manera que permita a las células de plantas producir metabolitos qye no producen normalmente vi. Puede ser perjudicial para países en desarrollo, que se basa en la extracción de metabolitos de plantas en lugar que producirlos Otros usos del cultivo de tejido 1. Fusion de protoplastos a) Protoplastos se generan por digestión de la pared celular b) Dos protoplastos de dos especies no relacionadas se fusionan por productos químicos o electroporación c) El material genético se mezcla junto, y las células híbridas se criban buscando caracteres de interés Variación somaclonal a) La variabilidad genética producida por cultivo de tejidos. Esta variabilidad puede ser explotada para mejora características de cosechas y plantas ornamentales, tales como maíz, trigo, cebada, y patata b) Caracteres tales como tolerancia a sal y metales pesados, resistencia a insectos, y mejora de la calidad de semilla se puede generar por un proceso de selección c) La variabilidad genética se produce por cambios en el número cromosómico debido a reorganizaciones cromosómicas, amplificación génica, y la activación de transposones. Como resultado, planta hijas difieren de parentales. El manteniemiento de caracteres deseables es esencial Colecciones de Germoplasma a) El material genético de una planta, que puede contener características importantes e incrementar el valor de una planta, como resultado de mayor tolerancia a sequía y plagas b) Germoplasma antiguo se usa para introducir nuevos caracteres tales como resistencia a enfermedades en plantas actuales c) El germoplasma va desapareciendo debido a la perdida de cultivo tradicional, eliminaciónd de viejos cultivos, y el uso de plantas modernas en lugar de plantas antiguas d) Banco de genes Introducir genes en plantas 1) Infectar células de plntas con plásmidos como vectores que llevan el gen de interés 2) Disparar balas microscópicas que contienen en su superficie el gen directamente a la célula Ingeniería genética de plantas Transformación de plantas y Agrobacterium tumefaciens. 1. Una bactería común de suelo que causa tumor en agalla 2. La bacteria entra por lugares donde la planta ha sido dañada 3. La bacteria tiene un plásmido llamado “plasmido Ti” que contiene genes llamados “genes vir (virulencia)” que codifica una proteína que transfiere una región del plásmido llamado “T-DNA” a células donde se pa producido el daño 4. Una vez que las células vegetales son infectadas, las hormonas vegetales estumula el crecimiento de las células tumorales 5. El T-DNA ha sido construido de manera que tiene los genes vir eliminados, de manera que el DNA extraño puede ser insertado en genoma de plantas, transformando la misma 6. Un método de transformación general: a) Células de un disco de hoja, plántulas, o yemas, y protoplastos reciben el DNA y las células crecen b) Se usa un medio de selección de aquellas células con el nuevo caracter c) Las células transformadas se cultivan en un medio sólido para formar un callo d) Las hormonas son modificadas para promover la formación de tallos y raíces e) Se examinan las plantas modificadas para determinar si se expresa el gen introducido Agrobacterium ･ Bacteria patogena de plantas ･ Causa enfermedad crown gall ･ Plasmido Ti en cepas patogenas ･ T-DNA transferido a celulas de la T-DNA planta Plasmido Ti El ingeniero de la naturaleza: Agrobacterium tumefaciens Ingenería genética de plantas con Agrobacterium tumefaciens • A. tumefaciens: usado rutinariamente. • Contiene T-DNA (plásmido bacteriano) • Los genes se integran en el DNA bacteriano cuando se transfiere el TDNA Inducción del tumor por A. tumefaciens El tumor de A.tumefaciens puede ser grandecito… Biología de A. tumefaciens Bién conocido que produce el tumor de agalla A.tumefaciens es una bacteria que vive en el suelo (en la rizosfera) donde usa nutrientes que provienen de las raíces Infecta a través de heridas son atraídas quimiostáticamente a ellas www-genvagar.slu.se/teknik/ djup/plasm.htm T-plasmido bacteriano produce receptores para actosiringona Daño en plantas produce acetosiringone Las bases de ingeniería genética mediada por Agrobacterium • T-DNA de A. tumefaciens se excinde e integra en el genoma de plantas como parte de una infección natura • Cualquier DNA insertado en el T-DNA será también integrado Genes importantes condificados por el plásmido Ti 1. Citoquininas (hormona vegetal esencial en división celular y crecimiento tumoral) 2. Enzimas para la síntesis de ácido indolacético (auxina) Hormona vegetal (induce elongación de tallo y hoja, induce partenocarpia y previene envejecimiento) 3. Enzimas implicadas en síntesis y liberación de metabolitos de plantas: las opinas (derivados de aminoácidos) las grocinopinas (derivados fosforilados de azúcares) Nopaline Opinas y agrocinopinas son NUTRIENTES de A.tumefacies. No puden ser usados por otras especies bacterianas Proporciona un nicho único para A .tumefaciens Cytoquininas son hormonas vegetales derivadas de la purina adenina Zeatina es una de de las citoquininas cuya síntesis puede ser codificada por el plásmido Ti Aislada del maíz Expresión específica celular de citoquinica en célula infectada por A.tumefaciens Opinas son nutrientes que se usan para detectarse entre bacterias Las células de plantas comienzan a secretar Las opinas del T-DNA bacteriano transferido opina difunde en células de alrededor y sirve como moléculas señal para la conjugación de Agrobacterium (Quorum sensing) Plásmido Ti Región T-DNA Genes que producen tumor Catabolismo de Opinas Region Vir (virulencia) ORI DNA entre bordes L y R es Transferido a una planta como ssDNA Genes codificados por el T-DNA se pueden sustituir por otros genes Vectores basados en plásmidos Ti Sistemas binarios Vectores co-integrativos Necesita 3 vectores Necesita 2 vectores: Plásmido Ti desarmado Con gen de interés (sin genes vir) Vector helper para infección (con genes vir) Forma plásmido co-integrado después de recombinación homóloga sobre T-DNA Plámido con el Ti desarmado capáz de infectar Vector intermedio Con región T-DNA y el gen de interés (trasferido por conjugación) Vector helper Para trasferencia del plásmido intermedio al Agro Vectores co-integrativos (plásmido ti híbridos) Ráramente usados DESVENTAJAS: 1) Se requiere mucha homología entre plásmido Ti y plásmido de E. coli (vectores intermedios basados en pBR322) lo que hace que sean dificil de construir y usar 2) Transferencia ineficiente comparados con vectores binarios Vectores binarios Región T DNA eliminada Gen de interés Marcador de selección en planta Marcador de selección en bacteria Disarmed Ti plasmid ori para E.coli Región de Virulencia ori para A. tumefaciens Plásmido HELPER ori para Agro DESVENTAJA: Según la orientación, los plásmidos con dos orígenes de replicación pueden ser inestables en E. coli VENTAJA: Se usan vectores pequeños, lo que incrementa la eficiencia de transferencia de E. coli a Agrobacterium. No se requiere recombinación intermolecular Promotores usados para la expresión en plantas transgénicas 35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV CaMV es un genoma circular de doble cadena dsDNA CaMV 35S es un promotor muy fuerte (constitutivo o ectópico) que es activo en la mayoría de tejidos de dicotiledoneas Pasos en la creación de una planta transgénica 1. Los dos plásmidos se transfieren a Agrobacterium 2. Un cultivo vegetal se infecta con el Agro 3. Productos de los genes Vir escinden el T-DNA y lo transfieren al cromosoma de la planta L-Border Polilinker Gen de resistencia a Kan Gen de interés 4. Selección de células transformadas en Kan 5. Confirmar la presencia del transgen por PCR 6. Una planta completa se puede crecer de células transformadas !!! R-Border Callo Tejidos especializados de plantas que se forman en una herida; se forma un cambiun para sellar la herida de manera progresiva Células del Callo Son las má fáciles de transformar (sus paredes son muy delgadas) Protoplastos (sin paredes celulares son más fáciles de transformar, pero es más deficil de obtener una planta completa Los callos se producen por manipulación de concentraciones externas de hormonas vegetales Hormonas vegetales fundamentales Auxinas Auxina natural es el ácido indolacético (IAA) Meristemo apical es el sitio principal de síntesis de auxinas Citoquininas Relacionadas estructuralmente a la adenina Producida por tejidos de crecimiento activo, especialmente raíces, embriones y frutos auxina < CITOQUININA TALLOS AUXINA > citoquinina RAÍCES auxinA = citoquinina callo indiferenciado Producir callo transformar callo estimular tallo por adición de citoquinina + citoquinina Procedimento fácil (según especie) para dicotiledóneas Biology of Plants, Raven et. al., Freeman Worth Publishing, 1999 Monocots no son fáciles de manejar – callo es difícil de iniciar, callus A.tumefaciens no es una bacteria patogénica para monocots 1. Se elimina el pericarpo y se obtienen embriones inmaduros (0.5 - 1.0 mm) 2. Los embriones inmaduros se colocan en un medio de inducción de callos La transfomación se realiza con una pistola de genes Medio muy osmótico prepara el callo para transformación DNA con el gen de interés y resistencia a antibiótico cubre partículas de oro Los callos se colocan en una cámara de vacío, la presión de Helio dispara el DNA hacia las células Los callos se dejan en medios con alto osmótico durante 20 horas después del disparo Arma de genes Partículas de oro recubiertas con el DNA Cámara de vacío plantsciences.montana.edu/ .../transform1.htm 3. Bombardeo de partículas usando una pistola de genes que usa Helio Gas de Helio Metodología Discos de ruptura macroprojectiles Célula vegetal Partículas recubiertas con el DNA 1. Bombardeo de células con partículas de oro 2. Detectar actividad con proteínas marcadoras - No requiere cultivos celulares o pretratamiento de cultivos - Es la que se emplea normalmente para la transformación de monocots Después del disparo los callos se sitúan en un medio de selección por varias semanas Los callos se transfieren a medio para inducir la producción de tallos Despúes de inducir pequellos tallos se transfieren a a contenedores con medio que induce la foramación de raíces Las pequeñas plantas se transplanta a suelo y se aclimatan bajo condiciones de alta humedad Con los procedimientos actuales solo entre un 10-20% de las plantas actuales son trangénicas,y por tanto se deben comprobar en la expresión del transgen 4. Electroporación metodología Optimizació Optimización de mutiples variables Desidad de protoplasto 2 x 106mL-1 Concentración plásmido 200µg/mL Tamaño plásmido 3-6 Kb Eliminaciónd de paredes celulares no siempre necesario 1.5 kV Concentración de iones KCl 125 mM Examinar células para la actividad de transgen (por ejemplo expresión GUS) Gen reportador – gen cuya expresión es fácil de observar. Usada para “reportar” la expresión del gen - regulación y localización http://home.ust.hk/~rocklab/dc3gus/ ABA-inducible expression • gen GUS (uidA) X-Glc β-glucuronidasa Precipitado azul Ácido 5-bromo-4-cloro-3-inolil -β-D-glucurónico Guard cells Roots •Proteína fluorescente verde (GFP) Proteína de la medusa Aequorea victoria. GFP se produce en muchos organismos heterólogos Muchas variantes disponibles comercialmente (proteína fluorescente roja) • Gen de la kuciferasa (luc) A. thaliana C24 wild type (left) 35S-mgfp4-ER transformed (right) La mosca de fuego de norte américa libera luz verde durante la oxidación del sustrato luciferina Cámaras CCD pueden detectar bioluminiscencia en tiempo real Aequorea victoria
