guía rápida

GUÍA RÁPIDA
Procedimiento en tubo
1.- Recolectar, mediante venopunción, 1ml de sangre (hasta la
línea) de cada paciente en cada uno de los 3 tubos de recolección
de sangre QuantiFERON®-TB:
1. Tubo tapón GRIS: Control Nulo
2. Tubo tapón ROJO: Antígenos TB
3. Tubo tapón LILA: Mitógeno
2.- Mezclar el contenido de los tubos girándolos hacia uno y otro
extremo de 8 a 10 veces o durante 5 segundos, asegurándonos de
que la sangre moja las paredes del tubo y se resuspenden los
antígenos liofilizados que se encuentran adheridos a ellas. (muy
importante)
3.- Incubar 16-24 horas a 37ºC de forma vertical.
4.- Después del periodo de incubación, centrifugar a 1500-2200 g
durante 5-10 minutos.
Separar el plasma en tubos (se puede guardar a 4ºC durante 1 semana o a
–20ºC o -70ºC, indefinidamente).
Cuando se descongelan las muestras, pueden aparecer coágulos de fibrina. Si
los coágulos no son muy importantes, se pueden deshacer vorteando las
muestras. En caso de ser considerables, habrá que retirarlos con una punta de
pipeta o centrifugando los tubos a 1500-2200g durante 5-10 minutos.
Conservar las muestras a 4ºC hasta realizar el análisis. En caso de no
procesarlas antes de una semana, hay que conservarlas congeladas (-20ºC o
-70ºC)
ELISA de IFN- humano
Antes de empezar a trabajar, hay que preparar los reactivos de la
curva estándar, la solución de trabajo del conjugado (X1) y la
solución de lavado.
1.- Sacar el kit de la nevera una hora antes mínimo (muy
importante) y esperar a que se atemperen los reactivos.
2.- Resuspender el Standard de INF- con agua desionizada con la
cantidad que se indica en la etiqueta del vial. Asegurarse que está
bien disuelto (vortear si es necesario). La solución de Stock tendrá
una concentración de 8 UI/ml. Realice la siguiente dilución para la
preparación de los estándares (S1, S2, S3 y S4:
150 L
50 L
150 L
Diluyente
Verde
(Estándar del Kit)
8,0 IU/mL
Estándar 1
4,0 IU/mL
50 L
150 L
Diluyente
Verde
Estándar 2
1,0 IU/mL
150 L
Diluyente
Verde
Estándar 3
0,25 IU/mL
150 L
Diluyente
Verde
Estándar 4 (cero)
(Diluyente Verde
SOLAMENTE)
3.- Diluir el tampón de lavado 20 veces: (1 parte de tampón 20x +
19 partes de agua destilada).
4.- Reconstituir el conjugado con 0.3ml de agua desionizada para
tener una solución a una concentración de 100X.
La concentración de trabajo es 1X. El volumen a preparar, dependerá
del número de tiras que necesitemos (preparar siempre una tira en
exceso) como se muestra en la tabla :
NÚMERO
DE TIRAS
VOLUMEN DE
CONJUGADO
CONCENTRADO
100X
VOLUMEN DE
DILUYENTE
VERDE
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
10 L
15L
20 L
25 L
30 L
35 L
40 L
45 L
50 L
55 L
60 L
1,0 mL
1,5 mL
2,0 mL
2,5 mL
3,0 mL
3,5 mL
4,0 mL
4,5 mL
5,0 mL
5,5 mL
6,0 mL
Una vez tenemos preparado el conjugado 1X, necesario, hay que
guardar a 4ºC, ,inmediatamente después de su uso, el conjugado
100X sobrante, del vial madre. Sacarlo sólo cuando tenga que usarse
para preparar solución de trabajo 1X.
5.- Pipetear 50l de conjugado 1X en cada uno de los pocillos.
6.- Añadir 50l de muestra en los pocillos correspondientes en el
siguiente orden:
· Control Nulo (tubo GRIS)
· Antígeno TB (tubo ROJO)
· Mitógeno (tubo LILA)
7.- Añadir 50l de los estándares, por duplicado, y en orden
decreciente de concentración.
8.- Agitar la placa e incubar a temperatura ambiente durante 2
horas.
9.- Lavar la placa con el programa QUANTI del lavador o
manualmente con 400l de tampón de lavado 6 veces.
10.- Pipetear 100l de sustrato en todos los pocillos.
11.- Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
12.- Parar la reacción añadiendo 50l de solución STOP.
13.-Leer la densidad óptica de la placa con el programa Innolisa.
Lectura directa con un filtro de 450nm usando un filtro de
referencia de 620nm.