PrioCHECK® CSFV Ab 2.0 ELISA para detección in vitro de anticuerpos contra el virus de la peste porcina clásica en suero y plasma porcino 5 placas para 450 muestras © Prionics AG Instrucciones de uso Versión 1.1_es Introducción El virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), también conocido como virus de la peste porcina, pertenece al género de los pestivirus (junto con el virus de la diarrea viral bovina y el virus de la enfermedad de la frontera) de la familia Flaviviridae. La CSF es una enfermedad viral contagiosa que afecta a los cerdos (lista A de la OIE). Sus brotes provocan graves pérdidas económicas en los países con producción porcina, por lo que la rápida detección de un cerdo infectado es esencial para evitar que el virus se extienda y controlar la enfermedad. El CSFV está muy relacionado con los pestivirus que causan la diarrea viral bovina (BVD) y la enfermedad de la frontera (BD). Especialmente en granjas porcinas próximas a ganado con BVD o BD, se pueden producir reacciones cruzadas entre anticuerpos contra BVDV o BDV que pueden ocasionar falsos positivos en la ELISA. Para evitar estos falsos positivos, Prio® CHECK CSFV Ab 2.0 detecta anticuerpos contra el dominio A de la proteína E2 del CSFV (3). Se sabe que este dominio es más específico para el CSFV que los dominios B, C y D. ® PrioCHECK CSFV Ab 2.0 detecta anticuerpos contra cepas de CSFV de alta, moderada y leve virulencia poco tiempo después de la infección. La detección de los anticuerpos contra cepas de CSFV de baja virulencia es de suma importancia para trazar infecciones subclínicas por CSFV. ® PrioCHECK CSFV Ab 2.0 combina un procedimiento práctico y sencillo con una alta sensibilidad y especificidad y es ideal para análisis a gran escala. Principio del ensayo ® El reactivo clave de PrioCHECK CSFV Ab 2.0 es un anticuerpo monoclonal (MAb) dirigido contra un sitio 1 antigénico del dominio A de la proteína envoltura E2 (GP-55) del CSFV (3, 4). Se ha escogido el dominio A ya que es más específico para el CSFV que los dominios B, C y D de E2. El diluyente y la muestra se colocan en los pocillos de la placa y se incuban a 37±1°C. Luego, las placas se lavan, se agrega Mab HRPO a los pocillos y se vuelve a incubar a 37±1°C. Después de lavar las placas nuevamente, se añade a los pocillos la Solución de sustrato Cromógeno lista para usar. El desarrollo del color se detiene después de incubar la placa a 22±3°C. La presencia o ausencia de anticuerpos contra la peste porcina clásica se determina midiendo el desarrollo del color a una longitud de onda de 450 nm. Componentes del kit Conserve el kit a 5±3°C hasta su fecha de vencimiento. Consulte la etiqueta del kit para ver la fecha de vencimiento real. La vida útil de los componentes diluidos, abiertos o reconstituidos figura a continuación. Tiene a su disposición los datos de los riesgos químicos en la sección "Normas de seguridad y declaraciones de I+S" (Apéndice II). Componente 1 Placa de ensayo Se suministran cinco placas de ensayo en bolsas selladas con desecante. Componente 2 Conjugado (30x) (Concentrado 30X, diluir antes de usar). Un vial con 2,5 ml de conjugado. El conjugado diluido no es estable, por lo que debe prepararse antes de ser utilizado. Componente 3 Diluyente de conjugado (listo para usar) Un vial con 60 ml de diluyente de conjugado Componente 4 Líquido de lavado (200X) (Concentrado 200X, diluir antes de usar). Un vial con 60 ml de líquido de lavado. Vida media de la solución de lavado: 1 semana a 22±3°C. Componente 5 Diluyente de muestra (listo para usar) Dos viales con 11,0 ml de diluyente de muestra listo para usar. Componente 6 Control positivo (listo para usar) Un vial con 2,2 ml de control positivo. Componente 7 Control positivo débil (listo para usar) Un vial con 2,2 ml de control positivo débil. Componente 8 Control negativo (listo para usar) Un vial con 2,2 ml de control negativo. Componente 9 Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar) Un vial con 60 ml de Solución de sustrato Cromógeno. Componente 10 Solución de frenado (lista para usar) Un frasco con 60 ml de solución de frenado. Contenido adicional del kit: - Instrucciones de uso - 10 selladores de placas - Certificado de análisis Material necesario adicional General: Equipo de laboratorio según las normas de seguridad nacionales. Incubación: Incubador de micro-placas (que llegue hasta al menos 50°C). Análisis de los resultados: Lector de placas Multiscan EX o equivalente. El lector debe tener un filtro apropiado para leer placas a 450 nm. Opcional: Lavador de placas p. ej., Tecan EIA Tray Washer o equivalente. Sólo para diagnóstico in vitro de uso veterinario Guardar a 5±3°C Nº de producto 7610600 Procedimiento del ensayo Precauciones Deben seguirse estrictamente todas las disposiciones nacionales cuando se trabaja con muestras de anima® les. PrioCHECK CSFV Ab 2.0 debe ser utilizado en laboratorios adecuados para este propósito. Las muestras tienen que considerarse siempre como potencialmente infeccionas; y aquellos objetos que entren en contacto con las muestras, deben manejarse como potencialmente contaminados. Tiene a su disposición los de los riesgos químicos en la sección "Normas de seguridad y declaraciones de I+S" (Apéndice II). Notas ® Para lograr resultados óptimos con PrioCHECK CSFV Ab 2.0, debe tenerse en cuenta lo siguiente: El protocolo debe seguirse estrictamente Todos los reactivos del kit deben equilibrarse a temperatura ambiente (22±3°C) antes de ser utilizados. Las puntas de las pipetas deben cambiarse luego de cada uso. Cada reactivo debe colocarse en un recipiente diferente. Los componentes del kit no deben ser utilizados si se observan cambios en su aspecto o luego de su fecha de vencimiento. No debe utilizar componentes con diferente número de lote al mismo tiempo. Se debe usar agua desmineralizada para el ensayo. SOLUCIONES QUE DEBE TENER PREPARADAS Dilución del conjugado Prepare la dilución del conjugado (30X; componente 2) 1/30 en diluyente de conjugado (Componente 3). Por ejemplo, para realizar un ensayo con una placa, prepare 12 ml de solución (agregue 0,4 ml de conjugado concentrado (30x) a 11,6 ml de diluyente de conjugado). Nota: Debe preparar la dilución de trabajo justo antes de usarla. Solución de lavado El líquido de lavado (200x) (Componente 4) debe diluirse 1/200 en agua desmineralizada y es suficiente para un volumen final de 12 litros de solución de lavado. La solución de lavado puede almacenarse durante 1 semana a 22±3°C. Nota: El mal lavado de las placas puede producir un fondo alto. Es preferible utilizar un equipo automático para el lavado, aunque puede también pueden usarse pipetas multicanal o sumergir las placas de ensayo en solución de lavado diluida. En cualquiera de estos casos, no es necesario remojar la placa entre cada lavado. Se necesita un volumen mínimo de 200 µl por pocillo para un lavado correcto de las placas. INCUBACIÓN DEL SUERO 1.1 1.2 1.3 1.4 1 El Comité Internacional de Taxonomía de los Virus (ICTV, por sus siglas en inglés) ha cambiado la designación para la proteína de la envoltura E1 (GP-55) del CSFV a E2 (Australia, septiembre, 1995). Agregue 20 µl de diluyente de muestra (Componente 5) a cada pocillo (Componente 1). Agregue 80 µl de control negativo (Componente 8) a los pocillos A1 y B1. Agregue 80 µl de control positivo débil (Componente 7) a los pocillos C1 y D1. Agregue 80 µl de control positivo (Componente 6) a los pocillos E1 y F1. PrioCHECK® CSFV Ab 2.0 1.5 1.6 1.7 1.8 Agregue 80 µl de muestra a uno (ensayo individual) o dos pocillos adyacentes (ensayo por duplicado) de la placa de ensayo. Selle las placas con el sellador indicado. Agite con suavidad las placas. Incube las placas 60±5 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN CON EL CONJUGADO 2.1 2.2 2.3 2.4 Vacíe las placas y lávelas 6 veces con 200 a 300 µl de solución de lavado. Golpee bien las placas (invertidas sobre papel absorbente) después del último ciclo de lavado. Agregue 100 µl de conjugado diluido a cada pocillo. Selle las placas con el sellador indicado. Incube las placas 30±1 minutos a 37±1°C. INCUBACIÓN CON SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 Vacíe las placas y lávelas 6 veces con 200 a 300 µl solución de lavado diluida por pocillo. Golpee bien las placas después del último ciclo de lavado. Agregue 100 µl de la Solución de sustrato Cromógeno (Componente 9) a cada pocillo. Incube las placas 20 minutos a 22±3°C. Agregue 100 µl de la solución de frenado (Componente 10) a cada pocillo. Mezcle el contenido de los pocillos de las placas. Nota: Añada la solución de frenado 20 minutos después de haber llenado el primer pocillo con la Solución de sustrato Cromógeno. Agregue la solución de frenado en el mismo orden y lugar que la Solución de Sustrato Cromógeno. LECTURA DEL ENSAYO Y CÁLCULO DE LOS RESULTADOS 4.1 4.2 4.3 Mida la densidad óptica (DO) de los pocillos a 450 nm, dentro de los 15 minutos siguientes a la finalización del desarrollo del color. Calcule la DO450 media del control negativo (Pocillos A1 y B1). Éste es el valor máximo de la DO450. Calcule la inhibición porcentual (IP) del control positivo débil, del control positivo y de las muestras según la siguiente fórmula: La DO450 de todas las muestras se expresa como la inhibición porcentual (IP) relativa a la DO450 máx. IP = 100 - DO450 muestra ----------------------------DO450 máx. Interpretación de la inhibición porcentual IP = < 40 % (negativo) La muestra no contiene anticuerpos específicos para CSFV. IP = ≥ 40% (positivo) La muestra contiene anticuerpos específicos para CSFV. Apéndice I Nota informativa Este manual se considera completo y correcto en el momento de su publicación. Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por daños fortuitos o consiguientes en relación con o tras el uso de este manual. Responsabilidad Prionics AG garantiza que sus productos cumplen las correspondientes especificaciones publicadas, siempre que se usen de acuerdo con las instrucciones correspondientes que sean del caso y dentro de la fecha de caducidad de los productos. Prionics AG no da ninguna otra garantía, explícita o implícita. No hay ninguna garantía de comercialidad o idoneidad para un uso particular. La garantía aquí ofrecida y los datos, especificaciones y descripciones de los productos Prionics AG que aparecen en catálogos de Prionics AG impresos y en la bibliografía sobre los productos no pueden ser modificados salvo tras acuerdo escrito explícito firmado por un representante autorizado de Prionics AG. Cualquier representación oral o escrita en contradicción con esta garantía o con dichas publicaciones no está autorizada y, si ha sido dada no es de fiar. En caso de incumplimiento de la garantía susodicha, la única obligación de Prionics AG consistirá, a su elección, en reparar o remplazar el producto en cuestión o parte del mismo, siempre que el cliente notifique el incumplimiento a Prionics AG sin demora. Si, tras esfuerzos razonables, Prionics AG resulta incapaz de reparar o restituir el producto o parte del mismo, entonces Prionics AG restituirá al cliente todos los efectivos pagados por el producto o la parte en cuestión. Prionics AG no asume ninguna responsabilidad por daños indirectos fortuitos, consiguientes, especiales o de cualquier otro tipo que resulten de pérdidas económicas o daños a la propiedad sufridos por cualquier cliente como consecuencia del uso de sus productos. Prionics AG y Prionics Lelystad B.V. son empresas certificadas ISO 9001:2000. Apéndice II x 100 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Criterios de validación 5.1 La DO450 media del control negativo (pocillos A1 y B1) debe ser > 1,0. 5.2 La inhibición porcentual del control positivo débil debe ser >50%. 5.3 La inhibición porcentual del control positivo debe ser >80%. 5.4 Si no se cumplen estos criterios, debe descartar el/los resultado/s del ensayo. Nota: Si la DO450 de una muestra es superior a la DO450 máxima, la inhibición porcentual puede interpretarse como 0%. Si la DO450 media del control negativo es inferior a 1,000, la solución de sustrato cromógeno (TMB) puede estar demasiado fría. En ese caso, caliente la solución hasta 22±3°C o incúbela durante 30 minutos. Si la DO450 media del control negativo es superior a 2,000, se recomienda un periodo de incubación más corto de la solución cromógeno (TMB) sustrato. Normas de seguridad y declaraciones de I+S 1. Deben seguirse estrictamente las normas nacionales de seguridad. Declaraciones I+S Componente 1 Placa del ensayo Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 2 Conjugado (30x) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 3 Diluyente de conjugado Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 4 Solución de lavado (conc. 200x) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 5 Diluyente de muestra Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 6 Control positivo (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 7 Control positivo débil (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 8 Control negativo (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 9 Sustrato Cromógeno (TMB) (listo para usar) Código de riesgo: este producto no está clasificado según las regulaciones de la UE. Componente 10 Solución de Frenado Código de riesgo: R35: provoca quemaduras graves. S26: en caso de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con abundante agua y concurrir a un medico S36/37/39: utilizar indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. S45: en caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta). Apéndice III Bibliografía 1) Holm Jensen, M. Acta Vet. Scand. 22, 85-98, 1981. 2) Wensvoort, G., Bloemraad, M. and Terpstra, C. Vet. Microb. 17, 129-140, 1988. 3) Wensvoort, G. J. Gen. Virol. 70, 2865-2876, 1989. 4) Wensvoort, G., Boonstra, J. and Bodzinga, B.G. J. Gen. Virol. 71, 531-540, 1990. 5) Colijn, E., Bloemraad, M. and Wensvoort G. Vet. Microbiol. 59, 15-25, 1997. Contacto Prionics Lelystad B.V. Platinastraat 33 P.O. Box 2271 NL-8203 AG Lelystad Países Bajos Tel. +31 320 714000 Fax +31 320 714029 Prionics AG Wagistrasse 27a CH-8952 Schlieren-Zurich Suiza Tel. +41 44 200 2000 Fax +41 44 200 2010 www.prionics.com [email protected] Para ver nuestra red de distribuidores, por favor visite www.prionics.com