Actividad de la ADP glucosapirofosoforilasa, Almidón sintetasa

Resumen: A-025
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Actividad de la ADP glucosapirofosoforilasa, Almidón sintetasa soluble y Enzima
ramificante en raíces de mandioca (Manihot esculenta Crantz) regeneradas in vitro.
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Medina, Ricardo D. - Carvalho, Luiz J. C. B. - Barrueto Cid, Luis P.
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Faloci, Mirta M. - Mroginski, Luis A.
1.Facultad de Ciencias Agrarias (FCA-UNNE), Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE-CONICET).
2.Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecúaria, Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia
(EMBRAPA-CENARGEN). FCA-UNNE, IBONE-CONICET.
Sgto. Cabral 2131, 3400 Corrientes (Argentina). E-mail: [email protected]
Antecedentes:
El inicio de un órgano de reserva y su posterior desarrollo no sólo involucra cambios en la morfología sino también va
acompañado de variaciones drásticas en su fisiología (Fernie & Willmitzer, 2001). Conocer en detalle la formación de
raíces de reserva implicaría también una mejor comprensión de los mecanismos bioquímicos involucrados. La raíz de
reserva de mandioca se diferencia a partir del incremento en diámetro de una raíz fibrosa debido a la actividad del
cambium vascular, el cual produce xilema secundario centrípetamente (Indira & Kurian, 1977; Ramanujan & Indira,
1984) en especial gran cantidad de células parenquimáticas reservantes que se especializan en acumular exclusivamente
almidón (Cabral et al., 2000). Según estos autores el almacenamiento de almidón en raíces de reserva de mandioca sólo
ocurre luego del crecimiento secundario, sin embargo se ha demostrado histológicamente (Medina et al., 2001) que bajo
determinadas condiciones inductivas las raíces primarias también pueden comportarse como órganos reservantes a
diferencia de otras que no se modificaron para tal fin y que aparentemente mantuvieron su función de absorción y
sostén. El análisis metabólico de los diferentes tipos de raíces nos permitirá ampliar los conocimientos que se tienen
acerca del fenómeno de la tuberización en mandioca y de los factores que la regulan. El objetivo de este trabajo fue
determinar las actividades de las principales enzimas de la biosíntesis de almidón tales como ADPglucosapirofosforilasa - ADPGppasa (EC 2.7.7.27), Almidón sintetasa soluble – ASS (EC 2.4.1.21) y de la Enzima
ramificante – ER (EC 2.4.1.18) en raíces fibrosas (RFT) y de reserva (RRT) regeneradas in vitro en un medio con
reguladores de crecimiento comparándolas con raíces fibrosas control (RFC) obtenidas en un medio sin reguladores de
crecimiento y menor contenido de sacarosa.
Materiales y Métodos:
Material Vegetal
Se trabajó con raíces de mandioca (Manihot esculenta Crantz) regeneradas in vitro mediante el cultivo de segmentos
uninodales, en el medio basal de Murashige & Skoog, 1962 (MS), con 3% de sacarosa como control y otro adicionado
con 5% de sacarosa más 0,1 mg L-1 de ácido naftalenacético (ANA) y 0,1 mg L-1 de 6-bencilaminopurina (BAP). Los
cultivos se incubaron en un cuarto climatizado a 27±2ºC con un fotoperíodo de 14 hs (con una irradiancia de 116 mm
-2 -1
m s ). Al cabo de 45-50 días de cultivo se aislaron las raíces de las plantas regeneradas y fueron cuidadosamente
lavadas, clasificándolas en raíces fibrosas control (RFC) provenientes del medio MS sin reguladores de crecimiento
vegetal, y en raíces fibrosas tratamiento (RFT) y raíces de reserva (RRT) in vitro obtenidas con el medio MS con 5%
sacarosa más ANA y BAP. Posteriormente se pesaron entre 1 – 4 g de raíces enteras y se procesaron para el análisis
enzimológico.
Preparación del extracto para la determinación de la actividad enzimática y análisis de proteínas
Para la preparación de los extractos crudos se trabajó en frío, refrigerando todo el material utilizado. Primeramente se
sumergió el material vegetal en N2 líquido y luego se homogeneizaron con buffer de extracción [50 mM de Tris-HCl
pH=7,8; 0,5 mM de ácido etilen diamino tetracético (EDTA); 2 mM de ditiotreitol (DTT); 100 µM de fenil-metilsulfonil fluoruro (PMSF) y 10 % de glicerol], en una relación 0,2 g/ml.
Las soluciones proteicas para todos los ensayos enzimáticos fueron concentradas por la reducción de 2 ml del extracto
crudo hasta por lo menos el 50 % del volumen inicial con filtros Ultrafree-CL PLTK Ultracel-PL, 30 kDa (Millipore )
por centrifugación (2000 x g, 45 min, 4 °C). Para la medida de la actividad de ADPGppasa se utilizó el extracto
concentrado previo a su conservación a –80 °C. Para las determinaciones de las actividades de las otras 2 enzimas se
usaron las alícuotas de los extractos concentrados conservadas a –80 °C. Todas las actividades enzimáticas reportadas
para las distintas muestras están dentro del rango de linearidad para cada enzima en particular.
Para la cuantificación de proteínas se utilizó el método del ácido bicinconínico (BCA) de Pierce (Micro BCA Protein
Assay Kit) y se construyó la curva de calibración con albúmina de suero bovino (BSA, 2 µg/µL). Para degradar
pigmentos que interfieran en la medición, las muestras fueron alicuotadas y expuestas a la luz ultravioleta por 20 min.
Alícuotas de 50 µL del extracto concentrado y de las diferentes diluciones del estándar de BSA (0,1 – 1,2 µg/µL) fueron
adicionadas con 450 µL de H2O bidestilada, 100 µL de desoxicolato de sodio al 0,15 % P/V y 100 µL de ácido
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tricloroacético (TCA al 72 % P/V), y se dejaron a temperatura ambiente por 10 min y luego se centrifugaron a velocidad
máxima por 10 min a 4 °C. El pellet recolectado fue suspendido en 50 µL de reactivo de solubilización (5%
dodecilsulfato de sodio + 0,1 M NaOH) y 1 mL del reactivo de trabajo BCA (Micro BCA mix), luego se incubó por 60
min a 60 °C y luego se midió la absorbancia a 562 nm versus H2O bidestilada como referencia. Todas las
determinaciones se hicieron por triplicado. La concentración de proteína se determinó interpolando los datos de
absorbancia en la curva de calibración.
Actividad de la ADPGppasa:
La medida del actividad ADPGppasa se desarrolló en la dirección de la pirofosforólisis según lo descripto por Ballicora
et al., 1998 con menores modificaciones. La fosforólisis de la ADP-glucosa fue determinada por la formación de
[32P]ATP a partir de 32PPi. La mezcla de reacción estuvo compuesta por 80 mM de Glicina-Glicina (pH = 8), 7 mM de
MgCl2, 3 mM de DTT, 2 mM de ADP glucosa, 10 mM de NaF, 16 mM de 3 fosfoglicerato (3PGA), 0,2 µg/µL de BSA,
1,5 mM de 32PPi calibrado para una actividad específica de 1474 cpm/nmol, volúmenes variables del extracto
enzimático (5, 10 y 20 µL) y H2O ultrapura en un volumen final de 250 µL. La reacción fue iniciada por la adición del
extracto enzimático e incubada a 37 °C y al cabo de 20 min fue interrumpida por la adición de 2 mL de TCA frío al 5%.
El [32P]ATP formado fue medido como describieron previamente Morell et al., 1987. Las lecturas fueron realizadas en
un Contador de Centelleo Líquido (Beckman, modelo LS 6500). Una unidad de actividad de ADPGppasa fue definida
como la cantidad de enzima que catalizó la síntesis de 1 nmol de [32P]ATP por minuto por mg de proteína bajo las
condiciones de reacción descriptas.
Actividad de la ASS:
El método consistió en la determinación de la cantidad de 14C incorporado a un cebador exógeno (glucógeno de ostra) a
partir de ADP [14C]glucosa. La metodología fue adaptada de Macdonald & Preiss, 1983. La mezcla de reacción
contenía 100 mM de Bicina (pH = 8.5), 10 mM de glutatión reducido (GSH), 10 mM de EDTA, 450 mM de citrato de
sodio, 5 µg/µL de glucógeno de ostra, 0,8 mM de ADP [14C]glucosa calibrado para una actividad específica de 2823,8
cpm/nmol, volúmenes variables del extracto enzimático (10, 30 y 50 µL) y H2O ultrapura en un volumen final de 200
µL. La reacción fue iniciada por la adición del extracto enzimático e incubada a 30 °C y al cabo de 20 min fue
interrumpida con calor a 100 °C por 1 min y la adición de 2mL de METOH/KCl (75%:1%). La [14C]glucosa
incorporada fue medida como describió previamente Ghosh & Preiss, 1965. Las lecturas fueron realizadas en un
Contador de Centelleo Líquido (Beckman, modelo LS 6500). Una unidad de actividad de la ASS fue definida como la
cantidad de enzima que catalizó la incorporación de 1 nmol de [14C]glucosa por minuto por mg de proteína bajo las
condiciones de reacción descriptas.
Actividad de la ER:
La base del ensayo fue la estimulación de la síntesis de α-D-glucano por la ER a partir de la Glucosa-1-fosfato
catalizada por la Fosforilasa a. Se procedió según el protocolo descripto por Hawker et al., 1974 con menores
modificaciones. La mezcla de reacción estaba compuesta por 1 mM de AMP, 0,1mM de Fosfosrilasa a de conejo, 50
mM de [14C] Glucosa-1-fosfato calibrado para tener una actividad específica de 837,8 cpm/nmol, volúmenes variables
del extracto enzimático (5, 10 y 20 µL) y H2O ultrapura en un volumen final de 100 µL. La reacción fue iniciada por la
adición del extracto enzimático e incubada a 30 °C y al cabo de 60 min fue interrumpida con calor a 100 °C por 3 min y
luego transferido al hielo. Luego se adicionó 100 µL de una solución de glucógeno 10mg/mL, se mezcló y se le agregó
2 mL de METOH/KCl (75%:1%). Después de 5 min el glucógeno precipitado fue centrifugado por 5 min en una
centrífuga clínica. El fluido sobrenadante fue descartado y el glucógeno precipitado fue redisuelto en 100 µL de H2O
ultrapura. Luego de producirse de nuevo la precipitación se lavó 2 veces más con 2 mL de METOH/KCl (75%:1%) y se
disolvió finalmente en 500 µL de H2O ultrapura, se transfirió a un frasco de lectura y se le agregó 4 mL del cocktail de
centelleo y se cuantificó con un Contador de Centelleo Líquido (Beckman, modelo LS 6500). Una unidad de actividad
de la ER fue definida como la cantidad de enzima que catalizó la incorporación de 1 nmol de [14C]glucosa en el α-Dglucano por minuto por mg de proteína bajo las condiciones de reacción descriptas.
Resultados y Discusión:
El análisis fue de carácter sincrónico, es decir se basó en determinaciones que se realizaron en un momento específico
del proceso de almacenamiento de almidón en raíces de mandioca siendo posible la evaluación de la actividad
ADPGppasa (EC 2.7.7.27), ASS (EC 2.4.1.21) y de la ER (EC 2.4.1.18) en los distintos tipos de raíces regeneradas in
vitro. Se tuvo especial cuidado con los extractos utilizados para el análisis de la actividad de ADPGppasa debido a su
vulnerabilidad a la degradación, desnaturalización, ó pérdida de actividad por interrupción de la cadena de frío ó ciclos
de congelación/descongelación, previamente recomendado por Mares et al., 1985.
El valor más bajo de actividad ADPGppasa se registró en RFC (Figura 1). Sin embargo las RFT presentaron el mayor
valor de actividad, siendo secundadas por las RRT. Posiblemente la actividad de ADPGppasa en las RRT al cabo de 4550 días de cultivo este transcurriendo por una fase de declinación. Estudios histológicos previos determinaron que en
RRT la cantidad de los gránulos de almidón va aumentando, tornándose masiva a los 21 días de cultivo (Medina et al.,
2001), quizás en este período la actividad de ADPGppasa sea superior. En el tubérculo de papa, la actividad de
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ADPGppasa se incrementa rápidamente en etapas tempranas del crecimiento, produciéndose un pico de actividad
simultáneamente con el aumento del contenido de almidón (Sowokinos, 1976; Hawker et al., 1979), declinando la
misma en etapas posteriores (Sowokinos, 1976). Probablemente las RFT presentaron la mayor actividad ADPGppasa a
pesar de su morfología influenciada por la composición del medio de cultivo. Significativamente menor fue la actividad
observada en RFC probablemente relacionada con una menor concentración de sacarosa en el medio de cultivo y la
ausencia de reguladores de crecimiento. Al haber menor producción de substrato (ADP glucosa), habrá menor
producción de cebadores glucanos ó de cadenas lineales de glucosa y consecuentemente habrá una disminución de la
actividad ASS y ER, conduciendo a una reducción en la síntesis de almidón. Por lo tanto, si la actividad de la
ADPGppasa es baja la síntesis de almidón será restringida o limitada por la escasez de substrato (Kossman & Lloyd,
2000).
Las actividades de la ASS y de la ER registradas en RRT fueron igual ó más bajas respecto de los otros tipos de raíces
analizados (Figuras 2 y 3). Estos resultados se podrían relacionar con los fundamentos anteriormente expuestos para
explicar el resultado obtenido con la ADPGppasa.
Figura 1: Actividad de la ADPGppasa en raíces regeneradas in vitro de mandioca
Figura 2: Actividad de la ASS en raíces regeneradas in vitro de mandioca
Figura 3: Actividad de la ER en raíces regeneradas in vitro de mandioca
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Ambos tipos de raíces obtenidos en el medio con 5% de sacarosa más ANA y BAP presentaron mayor actividad
ADPGppasa respecto de las raíces regeneradas en MS 3% sacarosa, por lo tanto a igual actividad ASS o menor
actividad ER, las primeras tienen mayores posibilidades de producir cantidades superiores de almidón. Esto está
relacionado con la estimulación a la biosíntesis de almidón que le imprimen medios ricos en sacarosa suplementados
con reguladores de crecimiento.
En lo que se refiere a las RFT obtenidas en medios con ANA y BAP, en las tres enzimas analizadas evidenciaron
mayores valores de actividad respecto de las RRT. Ambos tipos de raíces poseen una estructura primaria, pero las RRT
se diferencian de las RFT por tener una notable similitud externa con la raíz de reserva ex vitro y por la diferenciación
de un parénquima cortical reservante con grandes espacios intercelulares que funciona como tejido de almacenamiento.
A los 45-50 días de cultivo, esa capacidad de almacenar almidón se vislumbra en ambas, sin embargo probablemente en
ese momento las RRT estén transcurriendo por una fase de disminución de las actividades enzimáticas analizadas y en
consecuencia debido a esto presenten menores valores.
Conclusiones:
- Fue posible medir la actividad de las 3 enzimas principales de la síntesis de almidón en los distintos tipos de raíces de
mandioca regeneradas in vitro.
- Se confirman nuestras observaciones histológicas de que para que haya almacenamiento de almidón en condiciones in
vitro no es necesario que previamente haya crecimiento secundario.
- Las diferencias encontradas entre las RFC y RFT, corroborarían la acción inductiva de elevadas concentraciones de
sacarosa y presencia de reguladores de crecimiento sobre la actividad ADPGppasa, enzima fundamental para la síntesis
del almidón. La menor actividad de las 3 enzimas estudiadas en RRT respecto de las RFT se explicaría asumiendo que
las primeras están transcurriendo por una fase de disminución de la síntesis de almidón.
Bibliografía:
-Cabral, G., L. Carvalho & B. Schaal. 2000. In: Carvalho, L., Thro, A. & A. Vilarinhos [eds.], Proceedings 4st
International Scientific Meeting of the Cassava Biotechnology Network. EMBRAPA - Genetic Resources and
Biotechnology. Brasilia, DF, Brazil. p. 345-356.
-Ballicora, M.A., Y. Fu, N.M. Nesbitt & J. Preiss. 1998. Plant Physiol. 118: 265-274.
-Fernie, A.R. & L. Willmitzer. 2001. Plant Physiol. 127: 1459-1465.
-Ghosh, H.P. & J. Preiss. 1965. J. Biol. Chem. 240: 960–962.
-Hawker, J., J. Ozbun, H. Ozaki, E. Greenberg & J. Preiss. 1974. Arch Biochem Biophys. 160: 530-551.
-Hawker, J., H. Marschner & A. Krauss. 1979. Physiol. Plant. 46: 25-30.
-Indira, P. & T. Kurian. 1977. J. Root Crops 3: 29-32.
-Kossman, J. & J. Lloyd, 2000. Crit. Rev Plant Sci. 19: 171-226.
-Macdonald, F.D. & J. Preiss, 1983. Plant Physiol. 73: 175-178.
-Mares, D. J., J. R. Sowokinos & J. S. Hawker. 1985. In: P. H. Li (ed.). Potato Physiology. Orlando, Florida, EE.UU.:
Academic Press, pp. 279-327.
-Medina, R.; A. Gonzalez; M. Faloci & L.A. Mroginski. 2001. 6ta. Reunión de Comunicaciones Científicas y
Tecnológicas, UNNE. CD-ROM.
-Morell, M.K., M. Bloom, V. Knowles & J. Preiss. 1987. Plant Physiol. 85: 182-187.
-Murashige, T. & F. Skoog. 1962. Physiol. Plant. 15: 473-497.
-Ramanujam, T. & P. Indira. 1984. Indian J. Plant Physiol. 27: 355-360.
-Sowokinos, J. R. 1976. Plant Physiol. 57: 63-68.