Microscopía óptica instrumentación y principios
Anuncio
Microscopía óptica: instrumentación y principios Autor: Jaime Rodríguez R., Compound Microscope, circa 1751 Microscopio óptico compuesto Cabezal Estativo Ocular (adaptador para los ojos) Revolver Objetivo Platina móvil Macrométrico condensador Micrométrico Lente de campo (fuente luminosa) Control de iluminación EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Máster en Ciencias Forenses Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Fundamentos técnicos de la microscopía óptica Óptica (lentes) Aumentos Campo visual Iluminación Resolución Contraste Profundidad de campo Enfoque 5 Refracción La luz se dobla en ángulo cuando incide en una superficie Aire Al igual que un vehículo cambia su dirección cuando entra en un terreno de gravilla Pavimento suelto Cristal Esta primera rueda frena Onda incidente La componente que incide primero se ralentiza primero Pavimento consolidado Eje perpendicular La onda se comprime y se dobla en el límite del medio que produce la desaceleración EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Aumentos y Orientación I Las líneas de puntos son perpendiculares a la superficie de la lente Dirección de la luz rápido lento Posición actual Una lente biconvexa curva la luz en la misma dirección cuando entra y cuando sale Frog gastrula, saggital section; arrow indicates yolk plug rápido Dirección del movimiento Dirección aparente abajo Punto focal Objeto real Imagen aparente Imagen proyectada arriba izquierda EMP-INACIPE derecha www.BioEdOnline.org Aumentos y Orientación II ¿Por qué una lente de aumento simple no produce una imagen invertida? Con el objeto más cerca de la lente que del punto focal, los rayos de luz divergen dando al observador la ilusión de que está viendo un objeto más grande, más alejado, pero en la misma orientación.. object focal point EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Aumentos Aumentos finales usando una lente simple (por ejemplo un estereomicroscopio) 40x 100x 400x 40x 100x 400x La misma imágen: usando un microscopio óptico compuesto EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Resolución Resolución (d) = 0.61λ n sin α λ = Longitud de onda de la luz; n = índice de refracción Escala de resolución teórica 0.2 µm 5 µm 2 µm 1 µm 0.4 µm Escala de resolución de una 1 µm EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Campo visual y profundidad de campo Volumen tridimensional Teniendo en cuenta los cambios del aumento Profundidad de campo a diferentes aumentos escala = 5 mm cubreobjeto (#1) 0.15 mm thick Profundidad de una típica muestra montada en humedat 0.1 mm Volumen de espacio observado 40x 100x 400x Grosor del portaobjeto normal 1 mm 40x 100x 400x 1000x 1000x EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Campo visual e intensidad de la luz Aumento final Campo aparente: (izquierda) Sin ajustar el brillo (derecha) Después de compensar con el control de intensidad 100x Demasiado brillante Aumento del objetivo 400x Correcto 1,000x correcto Demasido oscuro 10x Correcto Demasido oscuro 40x 100x Quantity of light Diámetro de campo real 2 mm Área 0.5 mm 3 mm2 0.2 mm 0.2 mm2 EMP-INACIPE 0.03 mm2 www.BioEdOnline.org El contraste y el condensador Vista superior de un condensador con selector de filtros Apertura del condensador: tres posiciones Totalmente cerrado Vista lateral del condensador Resolucióny contraste optimizados Totalmente abierto EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Contraste y variación en el condensador Tres imágenes de Paramecium caudatum (vacuolas alimentarias con células de levadura) Contraste bajo A B Contraste óptimo (Izquierda) Bacillus thuringinensis con endosporas: (A) campo claro; (B) Contraste de fases (400x) (derecha) Pseudopodo de Chaos (Pelomyxa) carolinensis: (C) campo claro; (D) campo oscuro (100x) EMP-INACIPE Alto contraste C D www.BioEdOnline.org Enfocando multiples surperficies objetivo Esquema no a escala Foco inicial por encima de la preparación Preparación Condensador abierto para una mayor claridad Dirección del enfoque EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Observando a través del especimen Enfocando a través de un filamento de Spirogyra (400x) Siguiente paso Células superiores enfocadas Siguiente paso Siguiente paso Cloroplastos enfocados justo debajo de la pared celular Siguiente paso Enfoque en el centro de la célula Aproximadamente a la mitad de la célula Siguiente paso Alcanzando el fondo EMP-INACIPE Cloroplastos enfocados justo encima de la pared celular www.BioEdOnline.org Microscopía con aceite de inmersión Aumentos en seco Aceite de inmersión La difracción es minimizada con el uso de aceite de inmersión Diffracción severa que compromete una buena resolución A A: Bacteria at 400x Aumentos en seco mostrando una imagen borrosa (Resolución pobre) B EMP-INACIPE B: Bacteria at 1000x Con un objetivo de inmersión (Porción central del campo de visión de A) www.BioEdOnline.org Uso del objetivo de inmersión 1 2 Enfocar en seco con el objetivo de mayor aumento. Mover el revólver y dejarlo en una posición entre dos objetivos 5 3 Colocar una gota de aceite de inmersión sobre el espécimen 4 Colocar cuidadosamente el objetivo de inmersión sobre el espécimen Disposición de aceite sobre el cubreobjetos Colocación de aceite sobre un frotis (sin cubreobjetos) Y ya se puede observar La punta del objetivo debe estar completamente embebida en el aceite. EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Enfoque con un objetivo de inmersión Correcto – solo es necesario un buen enfoque Demasiado lejos, mover la platina hacia arriba Alto o bajo Imagen no visible correcto EMP-INACIPE Demasiado cerca – mover la platina hacia abajo Imagen no visible www.BioEdOnline.org Ajuste de los oculares Enfoque del ocular Separación de los ojos (girar para enfocar) centro Totalmente abierto Imagen doble Totalmente cerrado Girar para extender el tubo del ocular Ajustar para una sola imagen EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Lentes sucias? Si ve marcas contra un campo vacío, mueva la muestra de izquierda a derecha ... si se mueven, las manchas están en la preparación Si las marcas no están en la preparación, girar el ocular ... si se mueven indica que las marcas están en el ocular EMP-INACIPE Manchas fuera de foco pueden aparecer en el condesador. Para saberlo ...si alejamos el condensador estas estarán mas fuera de foco www.BioEdOnline.org Comparación de los distintos tipos de microscopía óptica Autor: Jaime Rodríguez R., Ph.D. Adaptación: Dave Caprette Comparación de los tipos de microscopía óptica Spirogyra Bacillus Amoeba proteus Campo claro Campo oscuro (top) bright field (bottom) D.I.C. Contraste fases 400x “D.I.C.,” (off axis condenser) 100x except as noted 400x EMP-INACIPE 40x www.BioEdOnline.org Microscopía de campo claro Objetivo Imagen de la muestra* Campo claro muestra platina Condensador Control de diafragma Diámetro del campo visual Filtro de luz de día Fuente de iluminación EMP-INACIPE *Volvox (fixed and stained) www.BioEdOnline.org Microscopía de campo oscuro Objetivo Luz dispersat Imagen de la muestra* Campo oscuro muestra Platina condensador Filtro opaco Diámetro del campo visual Filtro luz de día Fuente luminosa BioEd Online *yeast cells in suspension www.BioEdOnline.org Microscopía de contraste de fase Imagen proyectada Objetivo (no se esquematizan todos sus componentes Luz alterada por la muestra Membrana plasmática halo Placa de fase Luz no obstaculizada muestra Platina plasmagel Condensador Vacuola allimentaria plasmasol con gránulos Diafragma anular (Fuente de luz no mostrada) Diafragma visto desde arriba EMP-INACIPE Muestra: Chaos (pelomyxa) carolinensis pseudopodium, 400x www.BioEdOnline.org Microscopía Contraste Interdiferencial (Nomarski) Polarized light a Dirección de la vibración (luz que llega al observador) (a) (b) (c) b (a) luz blanca (no polarizada) (b) Filtro polarizador (c) Luz polarizada Amoeba proteus (100x): (a) imagen de campo claro; (b) D.I.C. Efecto obtenido al ajustar el condensador EMP-INACIPE www.BioEdOnline.org Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Otros ejemplos: Huevo de insecto con campo claro © N. Ubero-Pascal 28 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Huevo de insecto con campo oscuro A © N. Ubero-Pascal 29 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Huevo de insecto con contraste de fases B © N. Ubero-Pascal l 30 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Detalle de un huevo de insecto con contraste de fases C © N. Ubero-Pascal 31 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Huevo de insecto con contraste interdiferencial (DIC) Nomarski D © N. Ubero-Pascal 32 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses Créditos de las Ilustraciones / Pictures copyright • • • • Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia: Dirección web: http://ocw.um.es/ Logo encabezamiento. Autor: Musarumana: Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Microscopio_gif.jpg Diapositivas 3-4 y 6-27 adaptadas de las presentaciones de D.R. Caprette: “Light Microscopy: Instrumentation and Principles” y “Light Microscopy: comparison of optics”, publicadas on line en BioEd Online. Disponible en la página web: http://www.bioedonline.org/presentations/index.cfm#presentation32 Las figuras A, B, C y D de las páginas 29 a32 son de Nicolás Ubero Nicolás Ubero Pascal 33
