MOVILIZACION DE LAS RESERVAS
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Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón ACUMULACIÓN Y MOVILIZACIÓN DE LAS RESERVAS EN LOS VEGETALES Las plantas acumulan nutrientes y los asimilan como diversos compuestos necesarios para su crecimiento y desarrollo. Estos elementos a menudo son limitados en el medio en que las plantas viven, y por ello deben ser racionados entre los diversos procesos metabólicos que los requieren. Sin embargo, cuando se hallan en abundancia, los nutrientes pueden ser almacenados para su posterior uso al momento en que la capacidad de asimilación pueda ser inadecuada. Los típicos ejemplos de almacenamiento de reservas son los que se encuentran en las semillas, en particular el almidón, las proteínas y los lípidos. Estas reservas sobreviven largos períodos de dormancia de semillas y para ser catabolizados luego de la germinación, y sus catabolitos son utilizados para el crecimiento de la misma hasta que se forma una planta autotrófica capaz de fotosintetizar. PROTEÍNAS DE RESERVA Se trata de proteínas acumuladas en cantidades significativas en semillas en desarrollo que al germinar se hidrolizan rápidamente para proveer una fuente de nitrógeno reducido para los estadíos tempranos de la germinación. Las proteínas de almacenamiento se pueden dividir en cuatro (4) clases, de acuerdo a sus principales solubilidades: Albúminas (solubles en agua) Globulinas (solubles en soluciones salinas) Prolaminas (solubles en agua-alcohol) Glutelinas (solubles en soluciones ácidas o alcalinas). En semillas de monocotiledóneas (por ejemplo cereales) predominan las gutelinas y prolaminas, mientras que en las legumbres y otras dicotiledóneas predominan las albúminas y globulinas. Una excepción es la avena (monocotiledónea), donde predominan las globulinas (Tabla 1). Tabla 1: Composición porcentual del tipo de proteína de almacenamiento en mono y dicotiledóneas representativas. Especie Trigo (monocotiledónea) Maíz (monocotiledónea) Arroz (monocotiledónea) Avena (monocotiledónea) Arveja (dicotiledónea) Soja (dicotiledónea) Albúminas (%) 9 4 5 11 40 30 Globulinas (%) 5 2 10 56 60 70 Prolaminas (%) 40 55 5 9 0 0 Glutelinas (%) 46 39 80 23 0 0 Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Albúminas: Son proteínas globulares compactas con abundantes residuos de cisteína. Se encuentran principalmente en fabáceas. También están en cereales donde tienen propiedad de inhibidores de tripsina o α-amilasa. Globulinas: Son subcategorizadas de acuerdo a su coeficiente de sedimentación: - Vicilinas 7 S: tienen entre 150 y 200 Kda, pierden residuos de cisteína y no forman puentes disulfuro. Se encuentran en el embrión y en la capa de aleurona de cereales, son menos abundantes que las leguminas 11 S. - Leguminas 11 S: tienen entre 350 y 400 Kda; tienen subunidades de 60 Kda las que a su vez tienen subunidades de de 40 y 20 KDa. Forman puentes disulfuro. Prolaminas (gliadinas y gluteninas): Las gliadinas son proteínas monoméricas y se caracterizan por tener un peso molecular medio y alta extensibilidad. Por su parte, las gluteninas son polímeros formados por polipéptidos unidos por puentes disulfuros , con un alto peso molecular y una elevada plasticidad. En general las prolaminas son mezclas altamente polimórficas de polipéptidos de 30 – 90 KDa. Las prolaminas se clasifican en: - Ricas en azufre - Pobres en azufre - HMW (de alta masa molecular) Las prolaminas ricas en azufre son proteínas poliméricas ligadas por puentes disulfuro o proteínas monoméricas con un puente disulfuro intracatenario. En el extremo N-terminal tienen prolina o glutamina y en el C-terminal tienen cisteína. Las prolaminas pobres en azufre tienen un C-terminal truncado y un dominio N-terminal de secuencia repetida. Las prolaminas HMW tienen una secuencia repetitiva flanqueada y un N-terminal rico en glicina y glutamina. Los tres grupos de prolaminas provienen de un ancestro común. La proteína ancestral tiene aproximadamente 90 aminoácidos con tres dominios (A B C). Durante la evolución las prolaminas ricas en azufre y las HMW adquieren inserciones de secuencias repetitivas en los dominios A B C y en las regiones de los extremos. En las prolaminas pobres en azufre la secuencia repetitiva es amplificada. A y B se pierden y solo queda algo de C. Las albúminas y las globulinas son proteínas ricas en lisina y treonina mientras que las prolaminas (gliadinas y glutelinas) son ricas en prolina y glutamina. CUERPOS PROTEICOS Las semillas vegetales poseen abundantes vacuolas especializadas para el almacenamiento de proteínas, denominadas “cuerpos proteicos” (protein bodies). Durante la germinación, las proteínas almacenadas en los cuerpos proteicos son hidrolizadas hasta aminoácidos y exportadas al citosol para su uso en la síntesis de otras proteínas. Las enzimas hidrolíticas son almacenadas en vacuolas especializadas llamadas “vacuolas líticas”, que se fusionan con los cuerpos proteicos para iniciar el proceso de ruptura. Introducción a la Biotecnología Vegetal CP VL Dr. J.R. Soberón Micrografía de un protoplasto preparado de la capa de aleurona de semillas. El revelado fluorescente muestra dos clases de vacuolas: los cuerpos proteicos (CP) y las vacuolas líticas (VL). FORMACIÓN DE CUERPOS PROTEICOS EN SEMILLAS DE LEGUMINOSAS (FABÁCEAS) Los cuerpos proteicos en células parenquimáticas de almacenamiento de las semillas de fabáceas tienen generalmente un diámetro de 1 – 10 μm y son homogéneos en su estructura. Las proteinas de almacenamiento son sintetizadas en el retículo endoplasmático (RE) y transportadas al aparato de Golgi vía las conexiones tubulares del retículo endoplasmático liso. Luego son empaquetadas en vesículas derivadas del Golgi y transportadas a la vacuola. Estas vesículas se fusionan con el tonoplasto de las vacuolas central y descargan las proteínas en el lúmen vacuolar. La evaginación del tonoplasto alrededor de las proteínas de almacenamiento concentradas resulta en la formación del cuerpo proteico vacuolar maduro. Los cuerpos proteicos además de las proteínas de almacenamiento contienen hidrolasas presentes en las vacuolas de las células vegetales. Los cuerpos proteicos pueden ser considerados como pequeñas vacuolas especializadas para el almacenamiento de proteínas. Después de la germinación de las semillas, las proteínas de almacenamiento son movilizadas y los cuerpos proteicos se funden formándose la gran vacuola central de las células parenquimáticas del cotiledón. FORMACIÓN DE CUERPOS PROTEICOS EN GRANOS DE CEREAL Los cuerpos proteicos en granos de cereal se encuentran en dos tipos de tejidos de almacenamiento: endosperma amiláceo y células de la aleurona. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Endosperma amiláceo: es tejido específico y refleja diferencias en el contenido de proteínas de almacenamiento. Contiene tres tipos de cuerpos proteicos estructuralmente diferentes: Tipo 1: cuerpos proteicos esféricos y angulares de 1 a 3 μm de diámetro Tipo 2: cuerpos proteicos esféricos y angulares de 0,1 a 1 μm de diámetro Tipo 3: cuerpos proteicos cristalinos de 1 a 5 μm de diámetro Existen dos mecanismos de formación de estos cuerpos proteicos, a diferencia de lo que sucede en las fabáceas. Los cuerpos proteicos tipo 1 y 2 son dilataciones del RE rugoso, mientras que los del tipo 3 se forma de modo semejante a lo visto en fabáceas. Una ruta similar a la de Fabáceas opera en la capa de aleurona de los cereales, que contienen globulinas y albúminas (pero nunca prolaminas ni glutelinas). El endosperma de arroz contiene dos tipos de cuerpos proteicos: unos de origen vacuolar (que contiene globulinas, casi el 80% de las proteínas de almacenamiento) y los provenientes del RE (que contienen prolaminas, casi el 5% de las proteínas de almacenamiento). Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón BIOSÍNTESIS Y MODIFICACIONES POST Y CO-TRASLACIONALES Las proteínas de almacenamiento son usualmente sintetizadas en el RE rugoso, aunque en algún caso particular (como el maíz) se sintetizan en poliribosomas unidos a los cuerpos proteicos. Ellas poseen péptidos señalizadores que dirigen los nuevos péptidos sintetizados hacia el lumen del RE, donde luego son removidos por clivaje proteolítico. La proteína es plegada en su forma tridimensional correcta dentro del lumen del RE, el mismo lugar donde los puentes disulfuro de algunas globulinas, albuminas y prolaminas se forman. Existen tres tipos de proteínas del RE que asisten a estos eventos: cis trans proli isomerasas, disulfuro isomerasas y chaperonas (Hsp 60 y Hsp 70). Las cis-trans prolil isomerasas incrementan la velocidad del plegamiento catalizando la interconversión de enlaces peptídicos en cis y trans de restos de prolina en la cadena polipeptídica. Esto permite que el enlace peptídico de cada prolina se forme correctamente. Recordar que los residuos de prolina que intervienen en los enlaces peptídicos pueden tener configuración cis (casi el 6%) o trans. Isómeros cis y trans de un enlace peptídico en el que interviene el nitrógeno de la prolina. Más del 99,95% de los enlaces peptídicos en los que no interviene la prolina tienen configuración trans, sin embargo en torno a un 6% de los enlaces peptídicos en los que interviene el nitrógeno de la prolina se halla en configuración cis, y muchos de éstos intervienenen los giros β. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Las disulfuro isomerasas catalizan la ruptura y formación de puentes disulfuro correctos en las proteínas. Las chaperonas aumentan la velocidad del proceso de plegamiento limitando el número de las rutas no productivas que puede presentar el plegamiento de un polipéptido. Existen dos familias de chaperonas, llamadas hsp70 y hsp60 (estas últimas se conocen también como chaperoninas) Las chaperonas de la familia hsp de 70 kDa (hsp70) se unen a las cadenas del polipéptido a medida que éstas se sintetizan en el ribosoma, protegiendo las superficies hidrófobas que normalmente estarían expuestas al disolvente. Esto evita la agregación prematura de la proteína hasta que la cadena completa se ha sintetizado y pueda producirse el plegamiento definitivo. Sin embargo, algunas proteínas no pueden finalizar su proceso de plegamiento en presencia de chaperonas hsp70 y son entregadas a la familia hsp60. Un ejemplo de esta chaperona es la hsp60 de la bacteria Escherichia coli. Las chaperoninas (hsp60) forman estructuras cuaternarias cilíndricas compuestas por múltiples subunidades en cuya cavidad central hidrófoba se unen las proteínas desplegadas en estado globular fundido. Las chaperoninas poseen actividad ATPasa, es decir que hidrolizan ATP a medida que facilitan el plegamiento. Las chaperonas también se requieren para el replegamiento de proteínas después de que éstas hayan atravesado la membrana celular. Existe un sistema de chaperonas que facilita el transporte de proteínas en una conformación desplegada al interior de la mitocondria y a través de las membranas del retículo endoplásmico; las chaperonas locales facilitarían el plegamiento posterior de las proteínas transportadas. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón La legumina 11S de soja (una globulina) es un ejemplo pictórico de las etapas de transcripción desde los genes de los cotiledones hasta su ensamblaje como proteína de almacenamiento madura en el cuerpo proteico. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Algunas proteínas de almacenamiento de semillas son glicopropetínas, por ej. las vicilinas 7S y algunas albúminas, y cuya glicosilación inicial ocurre como evento cotraslacional. Existen dos tipos principales de cadenas laterales de oligosacáridos que son adheridas: - Oligosacáridos que contienen residuos de manosa (Man) y N-acetilglucosamina (GlcNAc). Oligosacáridos complejos que poseen xilosa (Xyl) y/o fucosa (Fuc). El ensamblaje de las proteínas de almacenamiento dentro de los cuerpos proteicos es un evento altamente ordenado, con pasos diferentes que ocurren en el RE, golgi y dentro del mismo cuerpo proteico. La tabla 2 presenta dichos eventos de modo general Tabla 2: Localización de eventos involucrados en el procesamiento de proteínas de almacenamiento depositadas dentro de cuerpos proteicos derivados de vacuolas RE rugoso Remoción de secuencias Ny C-terminales del péptido señal N-glicosilación Golgi Modificaciones de glicanos Cuerpo proteico Clivaje proteolítico Remoción/modificación de glicanos Ensamblaje de oligómeros Plegado del polipéptido Formación de puentes disulfuro Ensamblaje de oligómeros Nótese que estos eventos no son comunes a todas las proteínas de almacenamiento (por ejemplo las leguminas no sufren N-glicosilación). RESERVAS EN GRANOS DE CEREAL Los granos de cereales pueden ser divididos en tres partes: El embrión diploide El endosperma triploide El pericarpo testa La parte del embrión consiste en el principalmente en el embrión propiamente dicho, junto con el escutelo, órgano absortivo, cuya función es capturar las reservas de nutrientes solubilizados desde el endosperma y transferirlas al embrión en crecimiento. El endosperma está compuesto de dos tejidos: el endosperma amiláceo (localizado en la región central) y la capa de aleurona. El endosperma amiláceo consiste en células de paredes delgadas llenas de gránulos de almidón. La capa de aleurona rodea al endosperma amiláceo, y está constituida por células envueltas de una gruesa pared primaria que contienen una gran cantidad de cuerpos proteicos, encerrados por una membrana simple. Los cuerpos proteicos también contienen fitina, una sal (potásica o magnésica) de ácido mio-inositol hexafosfórico (ácido fítico) Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón MOVILIZACIÓN DE RESERVAS PROTEICAS El ejemplo más estudiado de movilización de reservas es el de las semillas de cereales. Durante la germinación la actividad en la aleurona es rápidamente direccionada hacia la síntesis y secreción de enzimas hidrolíticas que catalizan la despolimerización de las macromoléculas de almacenamiento en las células de endosperma amiláceo. El epitelio del escutelo realiza una doble función: 1°: produce y secreta hidrolasas, 2° capta los productos de degradación del endosperma y los trasloca hacia el embrión en desarrollo. Las enzimas producidas por la aleurona y el escutelo durante la germinación pueden ser clasificadas en tres grupos: A) enzimas “house keeping” involucradas en la continuidad del metabolismo dentro de las células. B) enzimas que movilizan las reservas de las propias células de aleurona y escutelo. C) enzimas hidrolíticas, sintetizadas de novo y secretadas hacia el endosperma amiláceo. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón La matriz proteica de la aleurona y sus incrustaciones de fitina desaparecen rápidamente durante la germinación. Los cuerpos proteicos coalescen para formar vacuolas que eventualmente ocupan la mayor parte de la célula. Los cuerpos lipídicos decrecen en abundancia y se vuelven más pequeños, mientras que las mitocondrias incrementan su actividad metabólica. La movilización de reservas está acompañada de una proliferación del RE rugoso, inicialmente asociado con los cuerpos lipídicos alrededor de la aleurona, pero luego desarrollando en prominentes pilas fenestradas. Aparecen abundantes complejos de golgi. Estos cambios ultraestructurales se asocian a la movilización de aminoácidos, fosfato, reservas de lípidos y la elaboración de la maquinaria sintetizadora y secretoria de proteínas, necesaria para que la aleurona facilite la degradación del endosperma amiláceo. Cambios similares ocurren en el escutelo. Los cuerpos proteicos han sido identificados como los principales reservorios de enzimas hidrolíticas en semillas no germinadas. Estas enzimas son las principales responsables de la movilización de reservas de la aleurona y escutelo al inicio de la germinación. Las dos enzimas responsables de la degradación del almidón son la α-amilasa y la β-amilasa. La α-amilasa hidroliza cadenas de almidón internamente para producir oligosacáridos consistentes en residuos de glucosa con uniones α-1,4, mientras que la β-amilasa degrada estos oligosacáridos desde los extremos para producir maltosa, que luego se convertirá en glucosa por acción de la maltasa. Luego de haber secretado estas enzimas, las células de la aleurona evolucionan hacia una muerte celular programada. Las Giberelinas (GAs) son reguladores vegetales involucrados en la germinación, que estimulan la aleurona en la producción y secreción de enzimas hidrolíticas. CARBOHIDRATOS DE RESERVA ALMIDÓN Constituye la forma más generalizada, aunque no la única, de reserva energética en vegetales. Se almacena en forma de gránulos, y puede llegar a constituir hasta el 70% del peso de granos (maíz y trigo) o de tubérculos de papa. El análisis de la estructura del almidón demuestra que es una mezcla de otros dos polisacáridos: la amilosa y la amilopectina. La proporción de ambos polisacáridos varía según la procedencia del almidón pero, por lo general, la amilopectina es la más abundante (alrededor del 80% del total). La amilosa es un polímero lineal formado por unidades de α-D-glucopiranosa, unidas exclusivamente por enlaces (α-1, 4). El número de monómeros de la molécula depende de la procedencia del almidón: alrededor de 1000 en el caso de la papa y 4000 en el caso del trigo. La amilosa se disuelve fácilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de la hélice comprende 6 unidades de glucosa. El iodo se une a esta hélice y permite teñir el almidón de un color azul muy intenso. La amilopectina tiene un peso molecular mucho mayor que la amilosa puede contener cientos de miles o millones de monómeros de α-D-glucopiranosa. Es un polímero ramificado, en el que las cadenas principales están formadas por monosacáridos unidos mediante enlaces glicosídicos (α -1, 4) y donde cada rama se une a la cadena principal mediante enlaces glicosídicos (α 1,6). Estas ramificaciones están regularmente espaciadas (cada 25-30 residuos de glucosa) y cada rama está Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón formada exclusivamente por uniones (α 1, 4). Los almidones constituyen la principal fuente de carbohidratos para el ser humano. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón SACAROSA Es el azúcar de caña. Es la forma usual de reserva hidrocarbonada de muchas plantas. Está formada por glucosa y fructosa unidas ambas por sus carbonos anoméricos. Es por tanto un disacárido no reductor. FUNCIONES -Transporte (es la forma en la cual el Carbono asimilado en la fotosíntesis se transloca hacia los diferentes órganos de la planta). -Reserva: Transitoria (Mesófilo de Hojas) -Permanente (Parénquima de reserva, en Vacuolas) -Fuente inmediata de Carbono -Energética BIOSÍNTESIS DE ALMIDÓN Y SACAROSA En la mayoría de las especies, la sacarosa es la principal forma en que los carbohidratos se movilizan por la planta a través del floema. El almidón es un carbohidrato de reserva insoluble presente en la mayoría de los vegetales. Tanto el almidón como la sacarosa son sintetizados a partir de triosas fosfato generadas por el ciclo de Calvin-Benson. El almidón se sintetiza en los cloroplastos, a partir de las triosas fosfato del ciclo de CalvinBenson, vía Fru-1,6 BiP→Fru-6P→Glu-6P→Glu-1P. La Glu-1P intermediaria se convierte en ADPGlu por acción de la ADP-glucosa pirofosforilasa, en una reacción que requiere ATP y genera pirofosfato, que se hidroliza hasta 2 moléculas de ortofosfato (Pi) por acción de una pirofosfatasa inorgánica específica, de este modo la síntesis de ADP-Glu se vuelve irreversible. Finalmente el ADP-Glu transfiere un residuo de glucosa al extremo no reductor (carbono 4) de una glucosa terminal de un almidón en crecimiento. Micrografía electrónica de una célula de maíz donde se observan los gránulos de almidón dentro de los cloroplastos. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón En los amiloplastos (presentes en tejidos no fotosintetizantes), el almidón se genera a partir de la Glu-6P proveniente del citosol, que ingresa a través de un antiporte con el Pi. La síntesis de sacarosa en el citosol es muy parecida a la del almidón en los cloroplastos. El punto de partida es el mismo: triosas fosfato que vienen del ciclo de Calvin y que pasan a Fru-1, 6BiP, después a Fru-6P y por isomerización a Glu-6-P y luego a Glu-1P. A diferencia del almidón se forma UDP-Glucosa (en el cloroplasto era ADP-Glucosa) que se une a Fru-6P obteniéndose sacarosa 6-P, en una reacción catalizada por la Sacarosa Fosfato Sintasa (SPS). Una fosfatasa (sacarosa fosfato fosfatasa) quita el fosfato y se obtiene la sacarosa. Como se ha dicho antes, a diferencia de la síntesis de almidón, se utiliza UDP-Glucosa y la enzima que la forma es la UDP-Glucosa pirofosforilasa; un punto de control clave para la síntesis de sacarosa. Las enzimas fructosa 1, 6-Bisfosfatasa y sacarosa fosfato sintasa (SPS) constituyen checkpoints en la síntesis de sacarosa. La primera regula en función de las necesidades de la planta la segunda, de una forma más general, regula la velocidad de síntesis. Al igual que en la síntesis de almidón, se forma fosfato inorgánico que puede usarse para intercambio por triosas fosfato con el translocador de fosfato del cloroplasto. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón La sacarosa fosfato sintasa tiene una regulación bastante compleja. Los niveles de actividad dependen de la relación entre la glucosa 6-fosfato y el fosfato inorgánico. Si la relación es alta, la actividad será alta; si la relación es baja, la actividad será baja. Por otro lado, la enzima alcanza el pico de actividad cuando está desfosforilada, estando controlada de esta manera por la sacarosa fosfato sintasa kinasa y por la sacarosa fosfato sintasa fosfatasa. Por otro lado, la glucosa 6-fosfato inhibe a la SPS kinasa pero además es un modulador alostérico de la SPS que al unirse a ella provoca el cambio conformacional que hace que aumente su actividad. El fosfato inorgánico por el contrario favorece la actividad de la SPS fosfatasa y además fosforila a la enzima provocando un cambio conformacional que reduce su actividad, es por tanto, un modulador alostérico negativo. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón MOVILIZACIÓN DEL ALMIDON Y SACAROSA Los mecanismos que regulan y ejecutan la degradación del almidón aún no están del todo esclarecidos. Las enzimas que degradan el almidón participan en reacciones de rupturas fosforolíticas o hidrolíticas. Una hipótesis, que no está universalmente aceptada, sostiene que las almidón fosforilasas no pueden degradar los granos de almidón intactos, de modo que la degradación inicial depende de la actividad de las amilasas hidrolíticas. Al menos tres enzimas contribuyen a la degradación fosforolítica del almidón: almidón fosforilasa, enzima desramificante y glucosiltransferasa, cuyas reacciones se presentan a continuación: La almidón fosforilasa realiza una ruptura fosforolítica del almidón desde los extremos no reductores, generando Glu-1P, sin embargo su actividad no puede seguir más allá de los cuatro residuos de desde un punto de ramificación. La enzima desramificante (llamada también enzima R o pullulanasa) rompe la unión α-1,6 del punto de ramificación, liberando cadenas lineales (sustratos de almidón fosforilasa). Además, la glucosiltransferasa (o enzima D) puede condensar pequeños polímeros de glucanos, generando así nuevos sustratos para la fosforilasa. La actividad almidón fosforilasa predomina en los plástidos, aunque también se encontraron isoenzimas citosólicas. La regulación se cree que está dada por la disponibilidad de ortofosfato para la degradación. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón El almidón también puede ser degradado por una serie de enzimas hidrolíticas conocidas como “amilasas”. Se conocen muchas isoformas de las amilasas, aunque sus roles en la movilización del almidón aún no se han elucidado por completo. La α-amilasa cataliza el clivaje de enlaces glicosídicos internos, generando glucanos de baja masa molecular llamados “dextrinas límite”, junto con glucosa y maltosa. La β-amilasa libera residuos de maltosa desde los extremos o reductores del almidón. La maltosa y dextrinas pueden ser degradadas por acción de las αglicosidasas. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Las enzimas involucradas en la hidrólisis del almidón son especialmente activas durante la germinación de semillas, como ya se vio anteriormente. En la degradación de sacarosa participan principalmente dos familias de enzimas: sacarosa sintasa (que también participa en su síntesis) e invertasas. La sacarosa sintasa cataliza la unión del UDP a la sacarosa obteniendo UDP-glucosa y fructosa. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Las invertasas hidrolizan de forma irreversible la sacarosa en glucosa y fructosa. Cada una de las isoenzimas de las invertasas se agrupen en función de su pH óptimo (invertasas ácidas y alcalinas o neutras) y se pueden encontrar en varios compartimentos celulares: Extracelulares: así encontramos invertasas apoplásmicas; invertasas de pared (unidas ionica o covalentemente). Intracelulares: invertasas citosólicas (generalmente las alcalinas) e invertasas vacuolares (invertasas ácidas). Estás enzimas cumplen una importante función en el proceso de traslocación de la sacarosa, ya que determina si el C se transporta como hexosas (Glu+Fru) o como sacarosa. Algunas membranas son impermeables a la sacarosa, de manera que las invertasas apoplásmicas o de pared hidrolizan la sacarosa en hexosas para su transporte al interior de la célula (ej caña de azúcar). En función de la familia que actúe habrá más o menos gasto de ATP: si actúa la sacarosa sintasa se gasta una molécula de ATP y otra de PPi (pirofosfato), si actúa la invertasa se gastan 2 ATPs. La degradación de sacarosa puede generar sustrato para la biosíntesis de pared: la celulosa se forma por fuera de la membrana celular por adición de un residuo de glucosa a una molécula de celulosa en crecimiento. Las unidades de glucosa para esta síntesis provienen de la UDP-Glu, que debe ser provista por la sacarosa sintetasa asociada con el complejo que sintetiza celulosa. Esto soluciona el problema de transferencia de UDP-Glu a través de la membrana celular. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón LIPIDOS DE RESERVA Los lípidos, especialmente las grasas y aceites, son compuestos altamente hidrofóbicos poco solubles en agua, que constituyen una forma más reducida del carbono que los carbohidratos. Las plantas usan así los lípidos como reservas de carbono, a diferencia de las células animales, donde son usados como reservas de energía. Las grasas y aceites son reservas importantes de carbono reducido en muchas semillas, por ejemplo en soja, girasol, algodón, etc. La biosíntesis de los triacilglicéridos o triglicéridos (grasas y aceites almacenados en las semillas) requiere la cooperación de dos organelas: los plástidos y el retículo endoplásmico. Las plantas pueden usar los triglicéridos para generar energía. Los triglicéridos son tri-ésteres del glicerol. Los ácidos grasos de los vegetales usualmente son ácidos carboxílicos con número par de átomos de carbono. Las cadenas pueden ir desde los 12 hasta los 20 carbonos, aunque las más comunes van de 16 a 18. Los aceites son líquidos a temperatura ambiente, debido al predominio de ácidos grasos insaturados, mientras que las grasas son sólidas a temperatura ambiente, debido a la mayor proporción de ácidos grasos saturados. La composición de ácidos grasos en los lípidos vegetales varía entre especies (Tabla 3). Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Tabla 3: composición porcentual de ácidos grasos predominantes en aceite de maní y de semillas de algodón Aceite de semillas de Ácido Graso Aceite de maní algodón Ácido palmítico 9% 20% Ácido oleico 59% 30% Ácido linoleico 21% 45% Los triglicéridos en la mayoría de las semillas son almacenados en el citoplasma, ya sea de cotiledones o en células del endosperma, en organelas conocidas como oleosomas (llamados también esferosomas o cuerpos oleíferos). Los oleosomas poseen una inusual membrana-barrera que separa los triglicéridos del citoplasma acuoso. Se trata de una sola capa de fosfolípidos, cuyas cabezas polares se orientan al citosol y cuyas colas apolares hacia el interior de triglicéridos. Los oleosomas se estabilizan por la presencia de proteínas específicas, llamadas oleosinas, que recubren la superficie y evitan que los fosfolípidos de los oleosomas adyacentes se contacten y fusionen. La particular estructura membranal de los oleosomas es resultado de la biosíntesis de triglicéridos: dicho proceso se completa por enzimas localizadas en las membranas del RE, y las grasas resultantes se acumulan entre las monocapas de la bicapa del RE. La bicapa termina de separarse a medida que más triglicéridos se acumulan en la estructura en crecimiento, hasta que finalmente emerge del RE un oleosoma maduro. Las oleosinas pueden también ayudar a que otras proteínas se unan a la superficie de la organela. Durante la germinación de semillas, los lípidos en los oleosomas son degradados y convertidos en sacarosa con la ayuda de los glioxisomas. La primera etapa de este proceso es la hidrólisis de los ácidos grasos del esqueleto del triglicérido por acción de la lipasa. La lipasa está débilmente asociada a la superficie de la membrana del oleosoma y puede ser anclada a través de las oleosinas. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón BIOSÍNTESIS DE GLICEROLÍPIDOS Los ácidos grasos sintetizados en los plástidos son posteriormente usados para construir los glicerolípidos de membranas y los de oleosomas. Los primeros pasos de la biosíntesis son dos reacciones de acilación que transfieren los ácidos grasos desde el complejo formado por el ácido graso y la proteína transportadora de acilos, conocido como Acil-ACP hasta el glicerol-3-P para formar el ácido fofatídico o fosfatidato. Luego una fosfatasa específica hidroliza el fosfatidato generan diacilglicerol (DAG). Se admite que existen dos rutas biosintéticas con diferentes localizaciones, referdias como ruta procariótica (o cloroplastídica) y ruta eucariótica (o del RE). Ruta procariótica (en cloroplastos): emplea palmitil-ACP (16:0-ACP) u oleil-ACP (18:1Δ9ACP) generados por biosíntesis de ácidos grasos en el cloroplasto. Alternativamente, los ácidos grasos pueden ser exportados al RE como ésteres de la Coenzima A para ser incororados al DAG allí. Ruta eucariótica (en el RE): emplea diferentes aciltransferasas para incorporar los ácidos grasos en el fosfatidato. En algunas plantas superiores, incluyendo Arabidopsis y espinaca, ambas rutas contribuyen de igual modo a la síntesis de lípidos en cloroplastos. En muchos otros angiospermas, sin embargo, el fosfatidilglicerol es el único producto de la ruta procariótica, y los restantes lípidos del cloroplasto son sintetizados por completo por la ruta eucariótica. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Las enzimas clave en el metabolismo de lípidos de semillas son: acil-CoA:DAG aciltransferasa y Fosfatidilcolina:DAG aciltransferasa, que catalizan la síntesis de triglicéridos. Como ya se mencionó antes, los triglicéridos son acumulados en estructuras subcelulares especializadas (oleosomas), desde donde pueden ser movilizados durante la germinación y convertidos en azucares. MOVILIZACIÓN DE LÍPIDOS DE ALMACENAMIENTO Luego de la germinación, las semillas que contienen lípidos los metabolizan para convertirlos en sacarosa. Las plantas no son capaces de transportar lípidos desde el endosperma hacia la raíz y ápice de la plántula en crecimiento, por ello deben convertirlos en una “molécula movilizable”, tal como la sacarosa. Este proceso involucra diversas etapa, localizadas en diferentes compartimientos celulares: oleosomas, glioxisomas, mitocondrias y citosol. A modo de resumen general se puede decir que la germinación gatilla la conversión de lípidos en sacarosa, que comienza con la hidrólisis de los triglicéridos almacenados en los oleosomas, liberando los ácidos grasos para producir Acetil-CoA. Los ácidos grasos son oxidados en organelas tipo peroxisomas, denominados “glioxisomas”, abundantes en semillas con oleosomas. El Acetil-CoA es metabolizado en el glioxisoma hasta succinato, que es transportado luego hacia la mitocondria, donde será convertido primero en oxalacetato y leugo en malato. El proceso termina en el citosol con la conversión del malato a glucosa vía gluconeogénesis, y luego en sacarosa. El proceso de movilización implica entonces: Hidrólisis por acción de lipasas: los triglicéridos de los oleosomas se degradan por acción de la lipasa, que, al menos en algunas semillas, como las de ricinus communis (tártago), algodón y maíz, se localiza en la monocapa fosfolipídica que rodea el oleosoma. Se generan tres moléculas de ácidos grasos y una de glicerol. En el maní, soja y pepino se ha detectado actividad lipasa en los glioxisomas (no en oleosomas). Durante esta fase los glioxisomas y oleosomas se hallan en estrecha relación física. Micrografía electrónica de una célula del cotiledón de acumulación de aceites de semilla de pepino, donde se observan los glioxisomas, mitocondrias y oleosomas. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Β-oxidación de ácidos grasos: luego de la hidrólisis de triglicéridos, los ácidos grasos ingresan al glioxisoma donde se activan por unión a la Coenzima A, generan Acil-CoA , en una reacción catalizada por la acil graso CoA sintasa. El Acil-CoA es el sustrato inicila para una serie de reacciones de β-oxidación, donde los “n” carbonos del ácido graso se conviertes en n/2 moléculas de de Acetil-CoA. Cada ciclo de β-oxidación involucra la reducción de ½ O 2 hasta H 2 O y formación de 1 NADH y 1 FADH 2 por cada Acetil-CoA producido. En mamíferos la cuatro enzimas de cada ciclo son mitocondriales, sin embargo en las semillas de vegetales ellas se ubican exclusivamente en el glioxisoma. En tejidos vegetativos las reacciones de βoxidación se ubican en la organela relacionada, es decir los peroxisomas. El ciclo de glioxilato tiene como objetivo convertir 2 moléculas de Acetil-CoA (en total 4 C) en una de succinato (una molécula C4). El Acetil-CoA reacciona con oxalacetato para generar citrato, que es transferido al citosol para ser isomerizado hasta isocitrato (por la aconitasa); el isocitrato es re-importado al glioxisoma y convertido en malato por reacciones exclusivas de esta organela: 1- El isocitrato (C6) es clivado por la isocitrato liasa hasta succionato (C4) y glioxilato (C2). El succionato es exportado hacia la mitocondria. 2- La malato sintasa combina una segunda molécula de Acetil-CoA con glioxilato para generar malato. El malato es luego oxidado por acción de la malato deshidrogenasa hasta oxalacetato, que puede combinarse con otro Acetil-CoA para iniciar un nuevo ciclo. El glioxilato producido permite que el ciclo continúe funcionando, pero es el succinato el que se exporta a la mitocondria para el posterior procesado. 3- En las mitocondrias el succinato es convertido en malato por acción de las enzimas del ciclo del ácido cítrico. El malato resultante es exportado al citosol donde será oxidado hasta oxalacetato por la isoenzima citosólica de la malato deshidrogenasa. El oxalacetato ingresa a la gluconeogénesis para convertirse en glucosa y finalmente en sacarosa, que se transloca a los tejidos en crecimiento a partir de las semillas. Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón Introducción a la Biotecnología Vegetal Dr. J.R. Soberón REFERENCIAS Akazawa, T. and Nishimura, I.H. (1985). Topographic aspects of biosynthesis, extracellular secretion, and intracellular storage of proteins in plant cells. Annual Review of Plant Physiology 36: 441-472. Beck, E. and Ziegler, P. (1989). Biosynthesis and degradation of starch in higher plants. 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