ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO A MICRO

Glosa Revista de Divulgación / Universidad del Centro de México / Coordinación de Investigación
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO A MICRO-ESCALA DE QUÍMICA
SANGUÍNEA POR ESPECTROFOTOMETRÍA
Maria José Falcón Iracheta y Dr. Jorge Alejandro Alegría Torres
Laboratorio de Investigación Molecular en Nutrición (LIMÓN), Universidad
del Centro de México, Capitán Caldera 75, Col. Tequis.
San Luis Potosí, S.L.P. C.P. 78250
RESUMEN
Esta investigación se centró en el desarrollo de un método espectrofotométrico a
micro-escala en lector de placa de 96 pozos para determinar la concentración de
glucosa, triglicéridos, colesterol total y colesterol HDL Una vez validado, este
método fue utilizado para realizar el análisis clínico de estos analitos así como de
VLDL y LDL calculado por fórmula en 200 participantes de un estudio cuyo objetivo
es identificar rasgos de Síndrome Metabólico en el personal académico y
administrativo del instituto OTHÓN-UCEM. A través de la implementación de esta
metodología se redujo el tiempo y los costos que se necesitan al realizar
determinaciones de este tipo, y así poder brindar un resultado de laboratorio
eficiente y confiable.
INTRODUCCIÓN
Para que nuestro organismo funcione de manera adecuada es necesario proveerlo
de ciertos compuestos que son necesarios para la obtención de energía de las
células del cuerpo. Algunos de estos compuestos importantes es la glucosa que
gracias a esta molécula compuesta principalmente por C, O, e H ayuda a la célula
a proveerla de energía para desarrollar las funciones vitales de la misma. La mayor
parte de los lípidos que se encuentran en el organismo son en forma de triglicéridos,
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un tipo de lípido obtenido por medio de la dieta y principal reserva energética en el
organismo. El colesterol es lípido presente en el organismo que circula por el
torrente sanguíneo, esencial para la biosíntesis de hormonas esteroideas, ácidos
biliares, membranas celulares y lipoproteínas, como las de alta densidad (HDL),
baja densidad (LDL) y muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en ingles). Este tipo
de lipoproteínas circulan libremente por el torrente sanguíneo ocasionando
diferentes efectos en el organismo según su concentración, estos efectos pueden
ser positivos o negativos, dependiendo de la lipoproteína presente, en el caso de
las HDL o lipoproteínas de alta densidad ayudan a remover a las LDL o lipoproteínas
de baja densidad y VLDL o lipoproteínas de muy baja densidad que se quedan
estancadas en las arterias impidiendo la circulación, para posteriormente
transportarlas al hígado y que de esta manera puedan ser metabolizadas o
excretadas.
En el momento que las concentraciones de estos compuestos rebasan el límite
permitido se pueden desarrollar ciertas complicaciones en el organismo
favoreciendo la aparición de enfermedades crónicas tales como la diabetes mellitus
II o enfermedades cardiovasculares. Para poder monitorear y conocer las
concentraciones reales de estas moléculas en el plasma sanguíneo se requiere de
estudios específicos para cada uno de estos compuestos. Una de las técnicas
utilizadas en este tipo de análisis es por medio de espectrofotometría. Este método
es perfectamente descrito por el principio de Lambert-Beer, según el cual la
concentración es directamente proporcional a la absorbancia de luz o energía de la
muestra a analizar.
MATERIALES Y MÉTODOS
Dentro de la investigación de identificación de rasgos de síndrome metabólico en el
personal del OTHÓN-UCEM se desarrolló un método a micro-escala, para la
determinación de glucosa, triglicéridos colesterol total y colesterol HDL en plasma
sanguíneo por medio de espectrofotometría.
Para ello se realizaron controles de calidad para comprobar la efectividad y
confiabilidad del método. Se evaluó la linealidad, repetibilidad y reproducibilidad del
método. De acuerdo a los protocolos descritos por el proveedor (glucosa
triglicéridos, colesterol total y colesterol HDL de Bio-Systems®), se ajustó el
volumen de forma proporcional reduciéndolo 5 veces. Para linealidad se utilizaron
diferentes volúmenes de plasma: 2µL, 4 µL, 6 µL, 8 µL y 10 µL, utilizando 200µL
de reactivo. Las determinaciones se hicieron por triplicado en una placa de 96 pozos
con pipetas automáticas p20 y p200, para posteriormente leerlas en el
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espectrofotómetro (BIO-RAD ®, xMark microplate) a una longitud de onda de
500nm. Con los resultados obtenidos de las lecturas se realizó una curva para
evaluar el coeficiente de correlación (r²), que según el control de calidad establecido
debería de ser igual o mayor a 0.99. Para repetibilidad se calculó el Coeficiente de
Variación (CV) obtenido a partir de 20 repeticiones de una misma muestra. Para
reproducibilidad se analizaron 20 muestras en días diferentes para calcular el CV
entre pares.
Tabla 1. Glucosa
Glucosa Escala Micro
Normal Escala
Muestra 10 µL
4 µL
Reactivo
200 µL
1000µL
Tabla 2. Colesterol HDL
Colorimetría
Escala
normal
Micro
Sobrenadante 100 µL
Muestra
20 µL
Reactivo
1000
µL
200
µL
Precipitante
HDL
Escala Micro
Normal
escala
Muestra
200 µL
40µL
Reactivo
500 µL
100µL
HDL
escala
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Tabla 3. Colesterol total y TGL
TGL/
Escala Micro
Colesterol normal Escala
Total
Muestra
10 µL
3 µL
Reactivo
1000µL 200 µL
RESULTADOS
Como se puede observar en las gráficas 1, 2, 3 y 4 en donde se muestran los
resultados de linealidad para glucosa, triglicéridos, colesterol total y colesterol HDL),
el el coeficiente de correlación (R²) fue cercano a 1.
Para los resultados de repetibilidad se obtuvieron los siguientes coeficientes de
variación para cada uno de los analitos: Glucosa: 4.49%, Triglicéridos: 7.24%,
Colesterol Total: 7.24%, Colesterol HDL: 7.24 %. A pesar que no alcanzar los CV
recomendados por el proveedor, el criterio de aceptación se basa en la reducción
de los volúmenes por lo cual en todo momento las determinaciones se realizaron
por triplicado y el resultado fue aceptado siempre que la desviación estándar haya
sido menor a 0.05. Posteriormente de la aplicación de los controles de calidad se
analizaron cerca de 200 muestras de plasma sanguíneo.
Gracias a los resultados obtenidos de la determinación de glucosa, triglicéridos
colesterol total y colesterol HDL, se pudieron determinar las concentraciones de
colesterol LDL y VLDL por medio de la fórmula de Friedewald, descritas a
continuación:
LDL = CT-((TGL/5)+ HDL)
VLDL = TGL/5
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Gráfica 1.Glucosa
Gráfica 2. Triglicéridos
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Gráfica 3. Colesterol total
Gráfica 4. Colesterol HDL
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CONCLUSIONES
Gracias a la estandarización del método a micro-escala se pueden analizar
simultáneamente 30 muestras por triplicado en lector de placa de 96 pozos, esto
con el fin de reducir los tiempos al momento de analizar una cantidad considerable
de muestras, y además, reducir los costos de las pruebas realizadas al ser menor
los volúmenes de reactivo.
Para concluir con la investigación se realizaron protocolos estandarizados para su
futuro uso dentro del laboratorio.
REFERENCIAS
https://www.pfizer.es/salud/servicios/calculadoras/calculadora_colesterol_ldl_vldl.h
tml
Christopher K. Mathews, Kevin G. Ahern, K. E. Van Holde. Metabolismo lipídico de
los ácidos grasos,tricilgliceroles y lipoproteínas. En Bioquímica (2002). (pp:701742). Ed. Pearson Education.
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